Yöntem makalesi

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hedeflenebilir Değişikliklerin Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak Saptanması

DOI:

10.3791/69091

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda hedeflenebilir genomik değişiklikleri tespit etmek için otomatik, ISO15189 onaylı yeni nesil dizileme iş akışını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (KHDAK) hedefe yönelik tedavinin başarısı, mutasyonlar, gen füzyonları ve amplifikasyonlar dahil olmak üzere sürücü değişikliklerinin kesin olarak tanımlanmasına bağlıdır. Yeni nesil dizileme (NGS), hem bilinen hem de yeni genomik anormallikleri tespit edebilen ve kişiselleştirilmiş KHDAK tedavisi için kritik destek sağlayan kapsamlı bir moleküler tanı aracı olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, NGS karmaşık ve teknik olarak zorlu bir yöntem olmaya devam etmektedir. Yaygın olarak benimsenmesine rağmen NGS, teknik karmaşıklık ve uzun geri dönüş süreleri gibi bazı zorluklarla karşı karşıyadır. Burada, klinik laboratuvarda uygulanan ISO15189 sertifikalı NGS iş akışı tanıtılmaktadır. Standartlaştırılmış protokol, tümör hücresellik değerlendirmesini (%≥20), formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) dokulardan DNA ekstraksiyonunu (DNA girişi ≥ 50 ng), otomatik kütüphane hazırlamayı ve biyoinformatik analizini kapsıyordu. İş akışı, her adımda sıkı kalite kontrol (QC) önlemlerini entegre ederek yüksek veri güvenilirliği sağlar. Ayrıca, iş akışındaki en önemli yenilik, NGS kütüphane yapısının otomasyonuydu. NGS kitaplığı yapımının otomatikleştirilmiş sistemi, insan hatasını etkili bir şekilde en aza indiren, deneysel tekrarlanabilirliği artıran, uygulamalı süreyi azaltan ve böylece verimliliği artıran uç onarımı, A-kuyruğu, adaptör ligasyonu, hibridizasyon yakalama ve saflaştırmayı içeriyordu. Deneyimler birlikte, klinik NGS testlerinde doğruluğu ve ölçeklenebilirliği korumak için sıkı kalite kontrol ve otomatik kütüphane hazırlığının gerekli olduğunu göstermektedir. Bu optimize edilmiş yaklaşım yalnızca ISO15189 standartlarına uyumu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda KHDAK yönetiminde hassas onkolojiye yönelik artan talebi de destekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), tüm akciğer kanseri vakalarının %75-85'ini oluşturur ve hem klinik bir önceliği hem de terapötik bir zorluğu temsil eder 1,2,3. Son yıllarda, epidermal büyüme faktörü reseptörü tirozin kinaz inhibitörleri (EGFR-TKI'ler) gibi moleküler hedefli ilaçların başarılı bir şekilde geliştirilmesi ve klinik olarak uygulanmasıyla, ileri KHDAK tedavisi kişiselleştirilmiş hassas tedaviler çağına girmiştir 4,5,6. Hedefe yönelik tedavi, kesin etkinlik, yüksek özgüllük ve minimum yan etki sunar 7,8. Tedavideki bu değişim, aynı zamanda moleküler tanı teknolojilerine olan talebi de artırmıştır.

Şu anda, kapsamlı tümör hedefli testler, doğru genetik mutasyon profillerinin aydınlatılmasına yardımcı olabilecek ve böylece hastalar için daha sonraki hedefe yönelik ilaç kullanımı, ilaç direnci izleme ve prognoz değerlendirmesi için güvenilir bir temel sağlayan klinik uygulamanın vazgeçilmez bir bileşeni haline gelmiştir. Özellikle, yüksek verimli ve yüksek hassasiyetli teknik avantajlardan yararlanan NGS tabanlı çoklu gen testi, klinik uygulama 9,10,11,12 için zaten önerilmiştir.

Geleneksel moleküler tanı teknikleriyle karşılaştırıldığında, NGS çığır açan avantajlar göstermektedir. NGS'nin en önemli avantajı yüksek verim kapasitesinde yatmaktadır. Hem bilinen hem de bilinmeyen genetik değişiklikler dahil olmak üzere birden fazla genin eşzamanlı olarak saptanmasını sağlar 13,14. Bu arada NGS, tek bir çalışmada kapsamlı testler gerçekleştirerek maliyeti, numune tüketimini ve test geri dönüş süresininispeten azaltır 15,16. Bu avantajlar göz önüne alındığında, NGS klinik uygulamada giderek daha fazla uygulanmaktadır. Bununla birlikte, tümör hücresellik değerlendirmesi, nükleik asit ekstraksiyonu, otomatik kütüphane hazırlama ve biyoinformatik analiz dahil olmak üzere NGS süreçleri karmaşıktır. İlk numune işlemenin kalitesi, sonraki biyoinformatik analizlerin performansını doğrudan etkiler17. Özellikle kütüphane hazırlığı, ham nükleik asit numunelerini dizileme cihazlarıyla uyumlu standartlaştırılmış kütüphanelere dönüştürmek için bir dizi adımı içerir. Kütüphane hazırlığı, parçalanma, uç onarımı, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonunuiçerir 18. Bu karmaşık süreç genellikle çeşitli teknik önyargıları beraberinde getirir: örneğin, parçalanma, heterokromatin bölgelerinin yetersiz temsil edilmesine yol açabilir; adaptör ligasyonu sırasında ligazın substrat tercihi, belirli dizilerin kaybına neden olabilir; ve PCR amplifikasyonu, aşırı GC içeriğine sahip bölgelerde eşit olmayan kapsama alanına neden olma eğilimindedir19. Bu sistemik önyargılar sadece sıralama verilerinin kalitesini düşürmekle kalmaz, aynı zamanda sonraki biyoinformatik analizlerde hatalı sonuçlara da yol açabilir. Bu nedenle, deneysel sonuçların güvenilirliğini ve tutarlılığını sağlamak için sıkı bir kalite kontrol sistemi oluşturmak önemlidir.

Uzun süredir devam eden bu teknik zorlukların üstesinden gelmek için laboratuvar, tam otomatik bir NGS sistemini benimsemiştir. Sistem, manuel işlem süresini azaltmak ve genel geri dönüş sürelerini azaltmak için tasarlanmıştır. Her adımda potansiyel teknik önyargıları etkili bir şekilde en aza indirmek için entegre modüller ve birimler kullanırken hem operasyonel esneklik hem de işleme hassasiyeti sağlamak için programlanabilir protokoller içerir. Ayrıca, bu otomatik çözüm yalnızca kütüphane hazırlığının tekrarlanabilirliğini ve verimini artırmakla kalmaz, daha da önemlisi sıralama verilerinin orijinal numunelerin moleküler bileşimini daha doğru bir şekilde yansıtmasını sağlar. Burada laboratuvar, DNA tabanlı NGS kullanarak sürücü değişikliklerinin tespiti yoluyla sistemi tanıtmak istiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, anonimleştirilmiş arşiv örnekleri için bir IRB feragatnamesi aldı.

1. Ön test adımları ve kalite kontrol

  1. Numune bilgilerini laboratuvar bilgi yönetim sistemine kaydedin (Tablo 1). Gen mutasyon testi için bilgilendirilmiş onam formunu doldurun.
  2. NSCLC FFPE örneğini alın. Test için kullanılan numunenin 2 yıldan fazla saklanmamış bir parafin doku numunesi olduğundan emin olun. Numunelerin standart patolojik yöntemlere göre işlendiğinden ve saklandığından emin olun.
    NOT: Bu çalışma, büyük ölçekli bir klinik analiz yapmaktan ziyade öncelikle metodolojik iş akışına odaklanmaktadır. Bu nedenle, araştırmanın bu aşaması için belirli bir örneklem numarası şartı belirlenmemiştir.
  3. Tek kullanımlık mikrotom bıçakları kullanarak bölümleri kesin. Çapraz kontaminasyonu önlemek ve operatör kaynaklı kontaminantların (örn. saç, deri hücreleri, tükürük) bulaşmasını önlemek için numuneler arasında bıçakları, forsepsleri ve 1,5 ml'lik mikrotüpleri değiştirin.
    NOT: Büyük numune boyutu (≥ 0,5 cm x 0,5 cm) 6-10 μL, beş yaprak; küçük numune boyutu (< 0,5 cm x 0,5 cm) ve delinme numuneleri, 6-10 μL, 10 yaprak.
  4. Tümör hücresi içeriğini değerlendirmek için rutin hematoksilen-eozin (HE) boyaması yapın.
  5. Aşağı akış analizi için %≥20 malign tümör hücresi içeren numuneleri seçin. Tümör içeriği patologlar tarafından HE vitray lamları20 üzerinde değerlendirilir.
    NOT: Tümör içeriği% 20'den azsa, HE lamındaki işaretli tümör bölgelerinin rehberliğinde, ilgili tümör dokusu alanını kazıyın. Bu işlem, çevredeki neoplastik olmayan bileşenleri etkili bir şekilde uzaklaştırarak tümör dokusunun zenginleştirilmesini sağlar ve böylece toplanan materyaldeki tümör hücrelerinin yüzdesini önemli ölçüde artırır.
  6. Aşağıda açıklandığı gibi otomatik bir saflaştırma sistemi kullanarak nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    1. Bir şerit elde etmek için FFPE bloğunu bir mikrotom kullanarak bölümlere ayırın. Şeridi 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Şeridi otomatik ekstraksiyon cihazında belirlenen numune giriş konumuna aktarın.
    2. Otomatik ekstraksiyon kitine sahip bir otomatik ekstraksiyon cihazı kullanın ve manuel pipetlemeyi otomatik manyetik boncuk nükleik asit ekstraksiyon sistemi ile değiştirin.
      NOT: Bu adımın otomatikleştirilmesi, aşağı akış NGS uygulamaları için yüksek hassasiyetli ve tekrarlanabilir DNA üretimi sağlamak için otomatik ekstraksiyonun sağlanmasına yardımcı olur.
    3. Nükleik asidi çıkarmak için tam otomatik nükleik asit arıtıcının ve nükleik asit ekstraksiyon reaktifinin talimatlarına bakın.
    4. Daha sonra C1102 Programını seçin, numune mum alma inkübasyon süresini 16 saat ve elüsyon hacmini 100 μL olarak seçin.
      NOT: Ekstrakte edilen DNA çözeltisi hemen test edilmezse, -20 °C'de 6 aydan fazla saklanmamalıdır.
  7. Nükleik asit kalitesini (Tablo 2) aşağıda açıklandığı gibi değerlendirin.
    1. DNA fragmanı boyutunu belirlemek için agaroz jel elektroforezi kullanın. Düşük girdili numuneler için Agilent2100 ve diğer mikroakışkan kılcal elektroforez analiz sistemlerini kullanın.
    2. 1 g agarozu 100 mL TAE çözeltisi içinde çözün. Karışımı şeffaf olana kadar bir su banyosunda ısıtın. Çözeltiyi yaklaşık 60 °C'ye soğutun.
    3. Elektroforez cihazındaki pozitif elektrota (kırmızı) bağlayın. Negatif kutbu (siyah) 180 V voltaja gerçekleştirin, 15 dakika21,22 çalıştırın.
    4. Agaroz jel elektroforezi sonuçlarına göre, parça boyutlarını dört seviyeye ayırın (AD; Tablo 3) ve sonraki işlemler için AC seviyelerinin nükleik asidini seçin.
    5. Saflığı doğrulamak için spektrofotometri kullanın. OD260/OD280 > 1.8 olduğundan emin olun; OD260/OD230> kabul edilebilir kirletici seviyelerini 23,24 belirtmek için2.0'dır.
    6. DNA konsantrasyonunu hassas bir şekilde ölçmek için florometrik tahlil için diziye özgü floresan boyalara dayalı algılama kiti (Malzeme Tablosu) kullanın.
    7. Test edilecek 1 μL DNA'yı 199 μL çalışma çözeltisine ekleyin, ardından karıştırın, kısaca santrifüjleyin ve bir florometre (Malzeme Tablosu) kullanarak konsantrasyonunu ölçün.

2. Kütüphane hazırlığı ve kalite kontrol (Şekil 1)

  1. Aşağıda açıklandığı gibi ultrasonikasyon (Malzeme Tablosu) kullanarak fragman genomik DNA'sını hazırlayın.
    1. 200 ng genomik DNA'yı 50 μL düşük Tris-EDTA (TE) tamponunda karıştırın. Ardından, numune tüpünü önceden soğutulmuş (8 °C) bir numune rafında tutun.
    2. Cihaz parametresini Tablo 4'e göre ayarlayın. Ardından parçalanmayı başlatın.
    3. Parçalanma etkisini doğrulamak için agaroz jel elektroforezi kullanın. Bu adım, sonraki adımlar için onları kör uçlara dönüştürmek için uç onarımı gerektiren hasarlı uçlara sahip DNA parçaları üretir.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi 3'te uç onarımı ve A ilavesini gerçekleştirin.
    1. FFPE DNA'nın hasarlı uçlarını enzimlerle onararak düz uçlar oluşturarak 3'-OH ve 5'-P sağlayın. Düzleştirilmiş çift sarmallı 3' uçlara A ekleyin.
    2. 7 μL uç onarım tamponu ve 3 μL uç onarım enzimi ekleyerek ERA karışımını hazırlayın, 3x-5x'i manuel olarak hafifçe hafifçe vurun ve 1-3 saniye santrifüjleyin.
    3. 50 μL kırık DNA örneğine ERA karışımı ekleyin, hafifçe karıştırın ve 1-3 saniye santrifüjleyin.
    4. PCR cihazına yerleştirin ve ERA programını seçin (30 dakika boyunca 20 °C; 30 dakika boyunca 65 °C; 4 °C Basılı Tutun; Kapak 85 °C). Bir sonraki işlemi 2 saat içinde gerçekleştirin.
  3. Adaptör ligasyonunu aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    1. 30 μL ligasyon tamponu, 10 μL DNA ligaz ve 10 μL DNA adaptörü ekleyerek reaksiyon sistemi LIG karışımını hazırlayın. Ardından, 3x-5x'i hafifçe manuel olarak hafifçe vurun ve 1-3 saniye santrifüjleyin.
    2. Önceki adımdaki 60 μL'lik ürüne 50 μL LIG karışımı ekleyin, hafifçe karıştırın, ardından 1-3 saniye santrifüjleyin.
    3. Karışımı bir PCR cihazına yerleştirin, ardından LIG programını seçin (kapağı ısıtmadan 15 dakika boyunca 20 °C; 10 dakika boyunca 70 °C (ısıtma kapağı); 4 °C Beklet; Kapak 85 °C).
  4. Manyetik boncuk saflaştırması gerçekleştirin.
    1. 1,5 mL düşük adsorpsiyonlu bir santrifüj tüpü alın ve 88 μL homojenize manyetik boncuk ve 110 μL adaptörle bağlanmış ürün ekleyin. Vorteksleyin ve iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    2. İnkübe edilmiş numuneyi hemen 1-3 saniye santrifüjleyin ve santrifüj tüpünü manyetik bir rafa yerleştirin. Çözeltinin temizlenmesini bekleyin (yaklaşık 3-5 dakika).
    3. Tüp mıknatısa sabitlenmiş haldeyken, kapağı açın ve boncuk peletini bozmadan bir pipet kullanarak temizlenmiş süpernatanı dikkatlice aspire edin.
    4. Tüpü mıknatısın üzerinde tutun ve her tüpe 300 μL taze hazırlanmış% 75 etanol ekleyin.
    5. Manyetik boncukların tamamen yerleşmesi için 1 dakika bekleyin. Etanolü emmek için santrifüj tüpünü yatay olarak bir kez yavaşça döndürün.
    6. 2.4.4 ve 2.4.5 adımlarını toplam 2x olacak şekilde bir kez tekrarlayın.
    7. 1-3 saniye boyunca anlık santrifüjleme yapın, tüpü manyetik rafa geri koyun ve 30 saniye bekleyin. Kalan etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın ve tüp kapağını açık tutun.
    8. Manyetik boncukları, boncuk yüzeyi mat görünene ve çatlak görünmeyene kadar oda sıcaklığında 2 dakika kurutun.
    9. Ligasyon ürününü 28 μL elüsyon tamponu (EB) ile ayrıştırın.
      NOT: Manyetik boncukların kullanımdan önce en az 30 dakika oda sıcaklığında dengelenmesi gerekir.
  5. Ön kitaplığı aşağıda açıklandığı gibi yükseltin ve arındırın.
    1. 10 μL PCR tamponu, 10 μL PCR primeri, 1.5 μL dNTP karışımı, 1 μL PCR enzimi ekleyerek reaksiyon sistemi ön karışımını hazırlayın. Hafifçe manuel olarak 3x-5x'e dokunun ve 1-3 saniye santrifüjleyin.
    2. Önceki adımdaki 27,5 μL saflaştırılmış ürüne 22,5 μL ön karışım ekleyin, hafifçe karıştırın, ardından 1-3 saniye santrifüjleyin.
    3. PRE: 98 °C 45 s programını seçin; (98 °C 15 sn, 60 °C 30 sn, 72 °C 30 sn) 12 döngü; 72 °C 2 dak; 4 °C Tutun; Kapak 105 °C.
    4. PCR programı tamamlandıktan sonra, taze hazırlanmış %75 etanol kullanarak manyetik boncuk saflaştırması gerçekleştirin. Ürünü 18 μL EB ile seyreltin.
  6. Hibriti aşağıda açıklandığı gibi yakalayın.
    1. 15 μL ön kitaplık ve 4 μL bloker karışımı ekleyerek reaksiyon sistemi A'yı hazırlayın.
    2. PCR'ye yerleştirin ve PCR programı HYB'yi çalıştırın (5 dakika boyunca 95 °C; 65 °C Beklet; Kapak 105 °C).
    3. 10 μL hibridizasyon tamponu, 0,5 μL RNaz inhibitör blokeri ve 1 μL prob ekleyerek reaksiyon sistemi B HYB karışımını hazırlayın. Yavaşça 3x-5x hafifçe vurun ve 1-3 saniye santrifüjleyin.
      NOT: Prob adı LCOO1'dir ve prob genleri EGFR, KRAS, BRAF, ALK, vb. içerir.
    4. PCR cihazının sıcaklığı 65 dereceye düştüğünde, reaksiyon sistemi A'ya 11,5 μL HYB karışımı ekleyin, hafifçe karıştırın, ardından PCR cihazının kapağını kapatın ve 16-24 saat inkübasyona devam edin.
    5. Yıkama tamponu 2'yi 15 mL'lik konik bir tüp içinde metal ısıtıcılı 65 °C'de numune başına 600 μL'lik bir dozajda inkübe edin.
    6. SCB manyetik boncuklarını alın, ters çevirin ve 5x karıştırın, 10 saniye vorteks yapın ve oda sıcaklığında 30 dakika dengeleyin. 10 saniye vorteksleyin, 25 μL'yi 1,5 mL'lik düşük adsorpsiyonlu bir santrifüj tüpüne aktarın, 3 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı atın.
    7. 25 μL SCB manyetik boncuklara 200 μL Boncuk Yıkama Tamponu ekleyin, vorteks yapın ve 3 saniye karıştırın, 1-3 saniye boyunca geçici olarak santrifüjleyin, manyetik rafta 3 dakika bekletin ve süpernatanı atın.
    8. 2.6.7 adımını 2x toplam üç kez tekrarlayın.
    9. Manyetik boncuklara 200 μL boncuk yıkama tamponu ekleyin, vorteks yapın ve 3 saniye karıştırın, daha sonra kullanmak üzere yeniden askıya alın.
    10. Hibrit numunenin yaklaşık 30 μL'sini yeniden süspanse edilmiş SCB manyetik boncuklarına aktarın, vorteksleyin ve karıştırın, dönen bir karıştırıcıya yerleştirin, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve 1-3 saniye santrifüjleyin.
    11. Karışım tüpünü 3 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin, ardından yaklaşık 230 μL süpernatan aspire edin. 500 μL Yıkama tamponu 1 ekleyin, 5 saniye vorteksleyin, döner bir karıştırıcıya yerleştirin, ardından oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 1-3 saniye boyunca anlık santrifüj.
    12. Manyetik boncuk numune karışım tüpünü manyetik bir rafa yerleştirin ve 3 dakika bekletin. Ardından, yaklaşık 500 μL süpernatan ve artık sıvıyı aspire edin.
    13. 150 μL yıkama tamponunu 2 ila 65 °C'ye önceden ısıtın, 10 saniye vorteksleyin, sabit sıcaklıkta bir karıştırıcıya yerleştirin, çalkalayın ve 65 °C'de 10 dakika boyunca 600 rpm hızında inkübe edin. 1-3 saniye boyunca anlık santrifüjleme yapın, 3 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve yaklaşık 150 μL süpernatan ve artık sıvıyı aspire edin.
    14. 2.6.13 adımını 3 kez toplam dört kez tekrarlayın.
    15. Numune tüpünden kalan sıvıyı çıkarmak için anında 1-3 saniye santrifüjleyin. 20 μL EB ekleyin, 8x-10x yukarı ve aşağı karıştırın, iyice karıştırın ve daha sonra kullanmak üzere buzun üzerine koyun.
  7. Son kütüphanenin hazırlanması ve saflaştırılması.
    1. 25 μL amplifikasyon karışımı, 5 μL indeks ve 20 μL manyetik boncuk kütüphanesi ekleyerek reaksiyon sistemi POST karışımını hazırlayın. Hafifçe 3x-5x vurun ve 1-3 saniye santrifüjleyin. Yavaşça karıştırın, 1-3 saniye santrifüjleyin.
    2. Program seçin POST: 98 °C 45 sn; (98 °C 15 sn, 60 °C 30 sn, 72 °C 30 sn) 12 döngü; 72 °C 10 dk; 4 °C Tutun; Kapak 105 °C.
    3. PCR programı tamamlandıktan sonra, taze hazırlanmış %75 etanol kullanarak manyetik boncuk saflaştırması gerçekleştirin. Son kitaplığı 20 μL EB ile seyreltin.

3. Tam otomatik kütüphane hazırlığı (Tablo 5)

  1. Sistemi etkinleştirmek ve başlatmayı beklemek için Güç düğmesine basın. Program Ayarı'na gidin ve Protokolü Çalıştır'ı seçin, ardından Protokol: Burning Rock HS'yi seçin.
  2. Alikot QC parametrelerini Numune Tipi: Yüksek Kaliteli DNA olarak ayarlayın; Giriş Miktarı (ng): 50; PCR Öncesi Döngüler: 12; PCR Sonrası Döngüler: 12. ÇALIŞTIR'a tıklayın.
  3. Önceden paketlenmiş reaktif kartuşunu belirlenen yuvaya yerleştirin (reaktif yerleşimini ve durumunu otomatik olarak doğrular).
  4. Numuneleri yükledikten sonra, sistemin bağımsız olarak çalışmasını sağlamak için Başlat'a basın. İlerlemeyi izlemek için LED göstergeleri gözlemleyin.
  5. Program sona erdikten sonra Tamam'a tıkladığınızda program son kitaplığı otomatik olarak kitaplık tüpüne aktararak kitaplık hazırlığını tamamlayacaktır.

4. Sıralama ve Kalite Kontrol

  1. Aşağıda açıklandığı gibi kitaplık ölçümü ve kalite kontrol gerçekleştirin.
    1. Florometri kullanarak ön kütüphane ve toplam kütüphane konsantrasyonunu ölçün.
    2. Kitaplığın parça boyutunu algılayın. Kitaplığın parça boyutunu ve bağdaştırıcıların varlığını değerlendirmek için bir kit kullanın (Malzeme Tablosu).
      NOT: Son kitaplık primer dimerler içeriyorsa, numuneleri makinede karıştırmadan önce ek bir saflaştırma adımı eklenmelidir. Parçaların yerleştirilmesi için nitelikli standart ≥ 150 bp'dir ve beklenen yakalama verimliliği %40'≥tır.
    3. Sıralama işlemleri için dizileme kitaplığını 1.6 pM ve 1300 μL'ye seyreltin.
  2. Sıralama ortamı izlemesini aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    1. İç ortam sıcaklığı (19-25 °C), iç ortam nemi (%20-%80) dahil olmak üzere sıralama ortamını kontrol edin.
    2. Q30'un üzerindeki taban ve küme yoğunluğu geçiş filtresi (PF) dahil olmak üzere eksiksiz cihaz çıkış verileri QC.

5. Veri analizinin ve kalite kontrolün sıralanması

  1. Aşağıda açıklandığı gibi ham veri işleme ve moleküler profil oluşturma gerçekleştirin.
    1. Sıralama verilerini hg19'a hizalamak için Burrows-Wheeler Aligner'ı (sürüm 0.7.10) kullanın.
    2. Genom Analizi Araç Kiti (sürüm 3.2) ve Vardict'i (sürüm 1.5.1) kullanarak yerel hizalama, optimizasyon, çoğaltma işaretleme ve varyant çağrısı gerçekleştirin.
    3. VarScan (sürüm 2.4.3) fpfilter ardışık düzenini kullanarak varyantları filtreleyin ve derinliği 50'den az olan lokusları kaldırın. ExAC, 1000 Genom, dbSNP veya ESP6500SI-V2 veritabanlarında popülasyon sıklığı %0,1'in üzerinde olan varyantları tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) olarak sınıflandırın ve hariç tutun.
    4. SnpEff (sürüm 3.6) kullanarak kalan varyantlara açıklama ekleyin.
    5. MarkSV'yi (Burning Rock algoritma aracı) kullanarak büyük genomik yeniden düzenlemeler (LGR'ler) dahil olmak üzere Yapısal varyantları (SV'ler) analiz edin. Yakalama aralıklarının kapsama derinliği verilerine dayalı olarak kopya sayısı varyantlarını (CNV'ler) analiz edin.
    6. Guanin-sitozin içeriğinden ve prob tasarımından kaynaklanan sıralama yanlılıkları için doğru kapsama verileri.
  2. Ortalama derinlik, medyan derinlik, benzersiz derinlik, kesici uç boyutu, lib karmaşıklığı, kapsam, Q30 oranı ve eşleştirilmiş numune korelasyon oranı dahil olmak üzerenumune kalitesini 25'te açıklandığı gibi değerlendirin.
  3. Rapor oluşturma için, biyoinformatik incelemesini tamamlamak üzere işlem hattı sürümünü ve parametrelerini doğrulayın. Mutasyonların patojenitesini değerlendirmek için ilgili kılavuzları kullanın 26,27. Nihai raporu yayınlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvar, sıkı kalite kontrolleriyle otomatik bir NGS analizi iş akışı kullanarak, KHDAK örneklerinin kapsamlı genomik profilini çıkardı. Optimize edilmiş tespit iş akışı (Şekil 2), temsili tümör örneklerinde klinik olarak eyleme geçirilebilir birkaç genomik değişikliği güvenilir bir şekilde tanımladı (Şekil 3).

Dizileme sonuçları, önemli EGFR gen kopya sayısı amplifikasyonunun (CN=14.7) e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Her nitelikli NGS raporu, karmaşık ve zaman alıcı olmaya devam eden titiz bir sürecin arkasında yatmaktadır28. Bu sorunları çözmek için laboratuvar tam otomatik bir NGS sistemi geliştirdi. Bu işlem, manuel müdahaleyi önemli ölçüde azaltır, deneysel hataları en aza indirir ve geri dönüş süresini önemli ölçüde kısaltır. Dolayısıyla bu sistem, NGS için daha güvenilir ve verimli bir strateji sunarak genomik araştırmalarda veri kalitesi için yeni bir düşünce oluşturdu....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Halk Cumhuriyeti Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7252122), Çin Halk Cumhuriyeti Pekin Xisike Klinik Onkoloji Araştırma Vakfı (Y-HS202402-0021), Kanser Hastanesi Uzmanlık Eğitimi Öğretim Araştırma Fonu, Çin Tıp Bilimleri Akademisi ve Pekin Birliği Tıp Fakültesi (E2025004) ve Ulusal Üst Düzey Hastane Klinik Araştırma Fonu (2025-LYZX-R-B03).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  Agilent  Yüksek Duyarlılıklı DNA Kiti  Çevik5067-4626the  ile kullanım için; Agilent 2100 Biyoanalizör Sistemi
  Agilent DNA 1000 Reaktif Kiti  Çevik5067-1504the  ile kullanım için; Agilent 2100 Biyoanalizör Sistemi
Agilent 2100 BiyoanalizörüÇevikG2939AKütüphanenin parça boyutunu ve adaptörlerin varlığını değerlendirin. 
Konser Tam otomatik nükleik asit arıtma cihazıKONSERMC1002DNA çıkarımı için kullanılıyor
Equalbit 1× dsDNA HS Test KitiVazymeEQ121-02-AAthe  ile kullanım için; Qubit 3.0 Florometre
İnsan EGRR/KRAS/BRAF/ALK gen mutasyonu birleşik tespit kitiYanan KayaBR-LC00102Kütüphane inşaatı
Magnis BRAgilent TeknolojileriG7595AAOtomatik NGS kütüphane hazırlığı
ME220 Odaklı ultrasonikatorCovaris500396ultrasonikasyon
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-ONE-WTam dalga boylu UV görünür spektrofotometrik algılama
NextSeq 550DxIllumina20005715sıra
NSQ 500/550 Yüksek Çıkış KT v2.5(300CYS)Illumina20024908NextSeq 550Dx ile kullanım için
Nükleik asit ekstraksiyon reaktiviKONSERRC1102DNA çıkarımı için kullanılıyor
Qubit 3.0 FlorometreHayatQ33216Nüklein asit veya kütüphane konsantrasyonu tespit için kullanılır
Qubit dsDNA HS Test KitiHayatQ32851the  ile kullanım için; Qubit 3.0 Florometre

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
  2. Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 75 (1), 10-45 (2025).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Fukuoka, M., et al. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 41 (6), 1162-1171 (2023).
  5. Kris, M. G., et al. Efficacy of gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: A randomized trial. JAMA. 290 (16), 2149-2158 (2003).
  6. Zhou, C., et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): A multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 12 (8), 735-742 (2011).
  7. Wu, K., House, L., Liu, W., Cho, W. C. Personalized targeted therapy for lung cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 16 (8), C21-C34 (2013).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogenic shock: Turning an activated kinase against the tumor cell. Cell Cycle. 5 (24), 2878-2880 (2006).
  9. Kumar, S. S., et al. High early growth response 1 (EGR1) expression correlates with resistance to anti-EGFR treatment in vitro and with poorer outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. Clin Transl Oncol. 19 (6), 718-726 (2017).
  10. Li, D., et al. Status of 10 targeted genes of non-small cell lung cancer in Eastern China: A study of 884 patients based on NGS in a single institution. Thorac Cancer. 11 (9), 2580-2589 (2020).
  11. Wen, S., et al. Genomic signature of driver genes identified by target next-generation sequencing in Chinese non-small cell lung cancer. Oncologist. 24 (11), e1070-e1081 (2019).
  12. Tan, N., Li, Y., Ying, J., Chen, W. Histological transformation in lung adenocarcinoma: Insights of mechanisms and therapeutic windows. J Transl Int Med. 12 (5), 452-465 (2024).
  13. Coco, S., et al. Next generation sequencing in non-small cell lung cancer: New avenues toward personalized medicine. Curr Drug Targets. 16 (1), 47-59 (2015).
  14. Yang, X., et al. The molecular and cellular choreography of early mammalian lung development. Med Rev. 4 (3), 192-206 (2024).
  15. Wang, R., Wang, G., Zhang, N., Li, X., Liu, Y. Clinical evaluation and cost-effectiveness analysis of serum tumor markers in lung cancer. Biomed Res Int. 2013, 195692(2013).
  16. McGinn, S., Gut, I. G. DNA sequencing-spanning the generations. Nat Biotechnol. 30 (4), 366-372 (2013).
  17. Larson, N. B., Oberg, A. L., Adjei, A. A., Wang, L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 18 (2), 143-157 (2023).
  18. McCombie, W. R., McPherson, J. D., Mardis, E. R. Next-generation sequencing technologies. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (11), a036798(2019).
  19. Van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  20. Rao, W., et al. Potential unreliability of ALK variant allele frequency in the efficacy prediction of targeted therapy in NSCLC. Front Med. 17 (3), 493-502 (2023).
  21. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 529, 35-45 (2013).
  22. Holmes, D. L., Stellwagen, N. C. Electrophoresis of DNA in oriented agarose gels. J Biomol Struct Dyn. 7 (2), 311-327 (1989).
  23. Liu, D., et al. Quality control of next-generation sequencing-based in vitro diagnostic test for onco-relevant mutations using multiplex reference materials in plasma. J Cancer. 9 (9), 1680-1688 (2018).
  24. Zhang, C., et al. An improved NGS library construction approach using DNA isolated from human cancer formalin-fixed paraffin-embedded samples. Anat Rec (Hoboken). 302 (6), 941-946 (2019).
  25. Wood, D. E. National comprehensive cancer network (NCCN) clinical practice guidelines for lung cancer screening. Thorac Surg Clin. 25 (2), 185-197 (2015).
  26. Chinese Society of Pathology Quality Control, Chinese Medical Association Chinese Society of Oncology, China Anti-Cancer Association Chinese Society of Lung Cancer, Chinese Thoracic Oncology Group. Guidelines on clinical practice of molecular tests in non-small cell lung cancer in China. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 50 (4), 323-332 (2021).
  27. Rao, W., et al. Developing an effective quality evaluation strategy of next-generation sequencing for accurate detecting non-small cell lung cancer samples with variable characteristics: A real-world clinical practice. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (8), 4889-4897 (2023).
  28. Hutchins, R. J., et al. Practical guidance to implementing quality management systems in public health laboratories performing next-generation sequencing: Personnel, equipment, and process management (Phase 1). J Clin Microbiol. 57 (8), e00261-e00319 (2019).
  29. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), e0178706(2017).
  30. Larguinho, M., et al. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta. 81 (3), 881-886 (2010).
  31. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: Promises and challenges. Cancer Lett. 340 (2), 284-295 (2013).
  32. Senst, A., Bonsiepe, H., Kron, S., Schulz, I. Application of the Agilent 2100 bioanalyzer instrument as quality control for next-generation sequencing. J Forensic Sci. 69 (6), 2192-2196 (2024).
  33. Li, W., Qiu, T., Ling, Y., Gao, S., Ying, J. Subjecting appropriate lung adenocarcinoma samples to next-generation sequencing-based molecular testing: Challenges and possible solutions. Mol Oncol. 12 (5), 677-689 (2018).
  34. Li, W., et al. Potential unreliability of uncommon ALK, ROS1, and RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC. J Thorac Oncol. 16 (3), 404-418 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Targeted TherapyGenomic AlterationsDNA ExtractionAutomated Library PreparationTumor Cellularity AssessmentFormalin Fixed Paraffin EmbeddedBioinformatics AnalysisPrecision Oncology

İlgili makaleler