Method Article

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

DOI:

10.3791/69095

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Washington State University, 2Department of Biosciences, Biotechnology and Environment, University of Bari Aldo Moro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğrudan gözlem, bilimsel keşif ve anlayış için temel bir yöntemdir. Zaman geçişli tek moleküllü floresan görüntüleme, bireysel proteinlerin hareket ederken ve çevreleriyle etkileşime girerken gözlemlenmesini sağlar ve normalde topluluk ölçümlerinde gizlenen durumları görünür hale getirir. Tek protein izleme, özellikle zar proteinlerinin incelenmesi için uygundur; çünkü iki boyutlu yapısı tek florofor hassasiyetiyle hızlı, geniş alan görüntüleme sağlar. Transmembran veya periferik membran proteinlerinin bulunduğu membranları taklit eden yapay lipid çift katmanlarının kullanılması, plazma zarları veya çeşitli hücre tiplerinden hücre içi organellerin membranları gibi, neredeyse doğal ortamlarda spesifik etkileşimlerin ölçülmesini sağlar. Ayrıca, floresans ve Raman saçılmasından kaynaklanan arka plan girişimini bastırırken, her aşamada bir bileşen olarak karmaşıklığın kademeli olarak eklenmesine olanak tanır. Sıcaklık kontrolü eklenerek, tek parçacık etkileşimlerinin termodinamik özelliklerini de belirlemek mümkün olur. Bu çalışmada, Aquaporin-4 kullanılarak lipid çift katmanlarında örnek hazırlama, veri toplama, tek moleküllü floresan takibi ve membran protein yörüngelerinin analizi için bir protokol tanımlıyoruz. Bu çalışma, temel bir örnek olarak hizmet vermektedir ve farklı proteinler ile çift katmanlı bileşimlere uyarlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal biyolojik koşullarda, zar proteinleri geniş bir etkileşim ağı ile çevrilidir; bu ağlar diğer membran proteinlerini, hücre içi ve ekstrasuellerdeki sıvılardaki proteinleri, çeşitli lipid ve kolesterol türlerini, substratları veya ligandları, çözelti etkileşimlerini ve hücre dışı ile hücre içi matrisler arasındaki etkileşimleri içerir. Belirli ve kolektif etkileşimleri daha iyi anlamak için klasik biyofiziksel yaklaşım, tek bir bileşenle başlar ve kademeli olarak ek bileşenler teker teker eklenerek karmaşıklık doğal çevreyi yansıtır—biyofiziğe "Böl ve Fede et" yaklaşımı. Bu etkileşimleri inceleyen modern moleküler ölçekli bir yöntem, bireysel proteinlerin hareket ederken ve çevreleriyle etkileşime girerken takip edilmesi için zaman geçişli tek moleküllü floresan görüntüleme kullanılarak doğrudan gözlem yapmaktır. Bu makalede, kuvars örtü kapaklarında lipid çift katmanlarının oluşumu ve bu önceden yapılmış çift katmanlara tek proteinli görüntüleme için uygun şekilde büyük bir membran proteini yerleştirilmesi gibi bu yaklaşımın temel adımlarını açıklıyoruz. Bunu, desteklenen çift katmanlarda tek proteinleri takip etmek için 'çalışma atı' protokolü takip edilecek.

Bu makale, hidrofilik kuvars kapak kapaklarında patlayan küçük unilamellar veziküller (SUV'lar) kullanılarak katı destekli lipid çift katmanların nasıl oluşturulacağını anlatır. Kuvars yüzeyleri ya asit yıkama ya da ultraviyole (UV) ozon temizliği ile hazırlanır. SUV'ların oluşturulmasında kullanılan lipid, mümkün olduğunda ilgi duyulan biyolojik zarın ana kimyasal bileşimiyle eşleşmelidir (örneğin, astrositlerin plazma zarında aquaporin-4 (AQP4) bulunur ve ana bileşenler POPC (%46,4), POPE (%8,5), PS (%5,6), kolesterol (%30), PI (%2,5) ve SM (%5,6)1,2'dir. Katı substratla etkileşimi önlemek için, bir lipide aşılanmış polietilen glikol (PEG) gibi katkı maddeleri, çift tabakayı yüzeydenkaldırır 3,4. Her katkı maddesinin miktarı, protein difüzyonu engellenmez ve aynı zamanda membranı substrat yüzeyinden kaldırmak için yeterli destek sağlamak için dikkatlice ayarlanmalıdır. PEGilated lipidler gibi katkı maddeleri genellikle iki aşama gösterir: 'fırça fazı' ve 'mantar fazı'. Fırça fazı, PEG yüksek konsantrasyonda olduğunda oluşur ve polimer dik durur ve sterik engeli azaltır. Mantar fazı, polimerlerin rastgele spiraller olarak var olacak kadar ayrıldığı düşük konsantrasyonlarda gerçekleşir. Genel olarak, fırça evresi difüzyonu engeller, ancak mantar evresi çok az destek sağlar. Fırça ve mantar fazları arasındaki konsantrasyon optimaldir; bu da difüzyon 3,4 üzerinde minimum etkiyle destek sağlar.

Bazı zar proteinleri, P450 ve sitokrom P450redüktaz 5 gibi katı destekli lipid membranlarına kendiliğinden yerleşirken, diğerleri deterjan kullanılarak yerleştirilmesi gerekir ki bu hassas bir süreçtir. Bu deterjanları ve tek protein takimini engelleyebilecek dahil edilmemiş proteinleri çıkarmak için dikkatli yıkama gereklidir - bu süreç ayrıntılı olarak açıklanacaktır. Bu makalenin ana odağı, zaman geçişli floresan görüntüleme kullanılarak tek molekül izleme (SMT) için bir örnek hazırlamaktır. Bu, yüksek büyütme ve sayısal açıklığa (NA) sahip bir objektif gerektirir — genellikle 100x ve 1.45 NA yağ batırılmahedefi 6,7. Ayrıca hızlı ve son derece hassas bir kamera (EMCCD, CMOS veya ICCD kamera) ve lazer uyarıma gerektirir. Lazer uyarım, uzun protein yörüngelerini ölçmek için yeterince geniş bir görüş alanını kapsaymalıdır; bu genellikle toplam iç yansıma kullanılarak yaklaşık 50 μm x 100 μm evanesans alan oluşturulur; veya ışın şekillendirme optikleriyle (Gauss'tan üst hat'a kadar) yaklaşık 80 μm x 80μm 8 μm 8 veya TIRF'e benzer alana sahip yüksek eğimli ve lamine optik levha (HILO) ile epi-aydınlatma yapılır. Toplam iç yansıtma floresansı (TIRF) mikroskopisi, arka plan sinyalini azaltma avantajına sahiptir. Aşağıda basit ve nispeten uygun fiyatlı bir TIRF mikroskop tasarımı sunulmaktadır. Sıcaklık kontrolleri ekleyerek, entalpi, entropi ve Gibbs serbestenerjisi gibi birkaç termodinamik özelliği ölçmek mümkündür 9. Bu teknik, membran proteininin floresan etiketlenmesini gerektiren bir etiketleme derecesinde membran proteininin floresan etiketlenmesini gerektirir.

Bu makalede ilgi duyulan transmembran protein AQP4'tür. AQP4, astrositlerin uç ayaklarında ve merkezi sinir sisteminin damarlarının diğer bölgelerinde polarize olmuş bir sukanalıdır 10. Saniyede 3 milyar su molekülü taşıyabilir ve su homeostazı, hücre göçü, beyin ödemi, öğrenme ve sinaptik plastiklik yoluyla hafıza oluşumunda rol oynar11. AQP4 fonksiyonunun düzensizliği, beyin ödemi, nöromiyelit optika ve epilepsi gibi çeşitli nörolojikdurumlarla ilişkilendirilmiştir 12,13,14,15. AQP4, izoformasına bağlı olarak 32-37 kD büyüklüğünde bir proteindir ve birleşen döngülerle bağlı sekiz hidrofobik membran bölgesi, hücre içi N-terminal alanı ve büyük bir hücre içi C-terminaldomeni 16 içeren tetramerik dörtlüder yapıya sahiptir. AQP4'ün iki ana izoformu vardır: M1 ve M23; Fark, metionine 1 kalıntısı veya methionine 23 kalıntısında başlatmadan kaynaklanır. Araştırmalar, M1 izoformunun, palmitoylasyon durumuna bağlı olarak kendisiyle diad veya üçlüoluşturabildiğini göstermiştir 9. M23 izoformu, Ortogonal Parçacık Dizileri (OAP) olarak bilinen büyük protein agregalarına birleşir. Birlikte eksprese edildiğinde, M1 izoformu dış yüzeyinin etrafında periferik bir protein tabakası oluşturarak OAP büyümesinisınırlar; 17,18,19. OAP agregasyonunun dinamikleri, beyinde su geçirgenliği ve homeostazın modülasyonunda kilit bir faktör olabilir. Bu makalede, bir membrandaki bireysel AQP4'leri takip etmek ve tek protein-protein etkileşimlerini gözlemlemek için gerekli adımları açıklıyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Küçük unilamellar veziküllerin hazırlanması

  1. Lipid stok çözeltilerini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına getirin.
  2. Fırından temiz bir 10 mL'lik şişe alın ve oda sıcaklığına kadar soğumasına izin verin.
  3. Soğuk yuvarlak tabanlı şişeye 900 μL spektroskopik kalitede kloroform ve 100 μL spektroskopik derecede metanol ekleyin, ardından karışımdaki her lipidden uygun miktarları ekleyin. Lipidlerin iyi karıştığından emin olmak için matayı karıştırın.
    NOT: Diğer yazarlar farklı kloroform:metanol oranları kullanıyor, ancak uniform lipid kekler oluşturmak için en iyi oranın 9:1 olduğunu bulduk.
    Doğru lipid miktarlarının hesaplanması için bir tablo, Ek Dosya 1'de sağlanmıştır. Alt tabaka yüzeyinde lipid çift katmanlı oluşumunu doğrulamak için lipid hazırlarken, floresan etiketli bir lipid kullanın.
  4. Şekil 1'de gösterildiği gibi yuvarlak tabanlı şişenin üstüne bir vakum damıtma konnektörü yerleştirin ve azot hattına (kurutma cihazı) bağlayın.
    NOT: Saflaştırılmış N2(g) kullanın ve kurutma cihazına bağlanmadan önce 0,22 μm filtreden geçirin.
  5. N2(g)'yi açın ve basıncı öyle ayarlayın ki akış elin arkasında neredeyse hiç hissedilmesin.
    NOT: El arkasını ıslatmak buharlaşmanın hissedilmesine yardımcı olabilir.
  6. Numunenin N2(g) akışında 2,5-3 saat kurumasına izin verin, azotun akmaya devam ettiğinden emin olmak için periyodik olarak kontrol edilin. Örnek muhtemelen ilk yarım saat içinde kuru görünecektir; Ancak, kalan çözücüleri çıkarmak için azotun akmasına 2-2,5 saat ek devam edin.
    NOT: Numune gece boyunca da kurutulabilir.
  7. Yuvarlak tabanlı şişedeki her 5,0 μmol toplam lipid için 1 mL tampon ekleyin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan tampon 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 ve 140 mM NaCl'den oluşuyordu; Bu, numunenin hazırlanması boyunca kullanılan aynı tampon yöntemidir.
  8. Şişeye bir cam tıpkı yerleştirin ve parafin filmiyle sarın.
  9. Matayı bir halka standına bir kelepçeye yerleştirin ve mataşa altını 60 °C'ye ayarlanmış bir sonikatör banyosuna batırın. Termosun 1 saat kuluçkalaşmaya başlamasına izin verin, her 15 dakikada bir nazikçe dönerek çok lamellar lipozomlar oluşturulur; bu çözelti şişeye lipid bağlı olmayan opak bir çözelti olarak ortaya çıkar.
  10. 1 saatlik kuluçkadan sonra, sonikatörü (~35 kHz) açın ve genliği en yüksek ayarına ayarlayın. Sonra, şişeyi banyoda hareket ettirerek en büyük karıştının olduğu yeri bularak çözeltinin şişe içine sıçrayıp püskürtmesini sağlar. 30 dakika sonikasyon yapın, opak bir değişimden şeffaf ve hafif opalesans'a geçiş arıyorum.
  11. Lipid çözeltisini mataradan çıkarıp mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, ardından 100.000 × g ile 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj yapın. Mikrosantrifüj tüpünden süpernatantı çıkarın.
    NOT: Tüpün tabanında küçük bir pelet oluşabilir. Eğer pellet büyükse, onu atın ve işlemi tekrarlayın.
  12. Santrifüjlemeden sonra SUV'ları kullanın, bir hafta boyunca 4 °C'de saklayın veya biraz trehalozla -80 °C'de tutun.
    NOT: Önerilen trehaloz miktarı lipid çözeltisi başına mL başına 1 mg'dır. En iyi sonuçlar için yeni SUV'lar haftalık olarak üretilebilir ve buzdolabında saklanabilir.
    NOT: Bu, SUV'ları hazırlamak için sadece bir yöntemdir. SUV'ların yanı sıra, küçük, orta ve büyük unilamellar veziküller, ekstrüzyon veya dev unilamellar lipozomlar kullanılarakelektroformasyon 20,21,22,23 yoluyla üretilebilir.

2. Protein etiketleme

NOT: Proteinlerin çeşitli konjugatlarla, örneğin NHS esterleri ve maleimidler kullanılarak floresan problarla etiketlenmesi iyi belgelenmiş ve iyi anlaşılmıştır. Ancak, etiketleme derecesi (DOL) tek protein takibinde özellikle önemlidir. Bu çalışmada, transmembran proteinlerin hangi yüzdesinin etiketlendiğini ve her AQP4 tetramerinde floroforların dağılımını belirlemek çok önemliydi.

  1. Diyaliz tüpünü pH 8.3 olan 0.1 M fosfat tamponu içeren bir beaker'e yerleştirin ve bu tampon 0.22 μm filtreden geçirildi. Sonra, tamponda gece boyunca ters pozisyonda bekletin ve zarın konditör hale gelmesini sağlasın.
  2. Ertesi gün, diyaliz tüpünün içindeki tamponu protein çözeltisiyle değiştirin.
    NOT: Protein çözeltisi hacmi 20-250 μL arasında olmalıdır. Çözeltide ~1-5 mg çözünmüş protein olmalıdır.
  3. Protein diyaliz tüpüne yerleştirildikten sonra, 0.1 M fosfat tamponunda gece boyunca ters bekletilsin.
  4. Diyalizden sonra proteini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Yeni bir diyaliz tüpü hazırlayın ve 2.1. adımı tekrarlayın.
  6. NHS boyasını birkaç tane (3-4) küçük bir tartı kağıdına yerleştirerek hazırlayın, ardından 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 100 μL DSMO içinde çözün. Bunu DMSO'da iki adet 1 mL 10 kat seyreltme ile takip edin; son seyreltme kullanılarak her numunenin konsantrasyonları UV-vis spektroskopisi kullanılarak belirlenir. Ortalama 2-3 DOL elde etmek için, protein çözeltisine nazikçe sallayarak üç kat fazla reaktif boya ekleyin.
    NOT: Bu amaçla standart bir UV-vis spektrometresi yeterli olacaktır, ancak örnek boyutu nedeniyle küçük hacimli bir spektrometre avantajlıdır.
  7. Reaktif boya ile aynı hacimde proteini içeren mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Reaktif boya ve protein eklendikten sonra en az 8 saat mutasyon yapın.
  8. Nutasyonun ardından, etiketlenmiş proteini 2.5. adımda hazırlanmış diyaliz tüpüne aktarın ve taze fosfat tamponu içeren bir beaker'e yerleştirin. Bir karıştırma çubuğunu tampona yerleştirin ve 6 saat boyunca hafifçe dönmesine izin verin, ardından tampon değişimi ve 6 saat diyaliz daha yapın.
  9. İki tampon değişiminden sonra, etiketlenmiş proteini içeren diyaliz tüpünü son çalışma tamponunu içeren temiz bir beakere yerleştirin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan son çalışma tamponu 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 ve pH 7.4 seviyesinde 140 mM NaCl'den oluşuyordu.
  10. Diyalizden sonra DOL'u UV-vis spektrometresi ile ölçün.
    NOT: DOL'u ölçmek için standart yöntemleri takip etmek önemlidir. Aşağıda hesaplama için bir denklem yer almaktadır.
    figure-protocol-1(1)
    Boyanın figure-protocol-2 zirvesinde ölçülen absorbans ve 280 nm'de figure-protocol-3protein zirvesi . Proteinin figure-protocol-4 sönme katsayısı (proteinin moleküler ağırlığından hesaplanır), figure-protocol-5 ve figure-protocol-6 ise boya üreticisi tarafından sağlanır.

3. 25 mm çapında kuvars kapak kapaklarının hazırlanması

NOT: Aşağıda iki farklı yöntem bulunmaktadır:

  1. Asit yıkama
    NOT: Piranha ve baz aşındırma gibi birkaç yayımlanmış asit yıkama prosedürü bulunmaktadır. Aşağıdaki prosedürün, gravür olmadan son derece temiz ve hidrofilik bir yüzey sağladığını gördük; bu, floresan görüntüleme ile yapılan tek moleküllü çalışmalar için tercih edilir.
    1. Asit Yıkama yöntemi, çözeltiyi ısıtırken bir buhar davlumbazı ve PPE (gözlük, laboratuvar önlüğü, eldiven) gerektirir. Dökülme ihtimali için kaputun içinde bir sodyum bikarbonat fışesi bulundurulmalıdır.
    2. Kapak kapaklarını bir bedeklere yerleştirin ve nanosaf su, %30 hidrojen peroksit ve konsantre nitrik asit ile hacme göre eşit oranlarda (1:1:1 çözeltisi) doldurun.
    3. Kapak kapaklarını bu çözeltide 30 dakika ısıtın, ta ki çözelti kabarmaya başlayana kadar.
    4. Çözeltiyi kontrol edin ve örtü örtülerinin birbirine yapışmasını önlemek için her 10 dakikada bir nazikçe karıştırın. Çözeltiyi döndürürken, kayan kayışların ayrıldığını ve sonra ayrıldığını gözlemleyin. Ayrıldıktan sonra yavaş yavaş yavaşlayın ve birbirlerinden ayrı kalmasını sağlayın; böylece köpüren çözelti slipleri sarsın.
      NOT: Çözelti çok fazla ısıtmamalıdır, çünkü reaksiyon ısı üretir. Sıcak plakayı genellikle en düşük ayarda hafif bir köpükle ayarlayın. Bu ayarlarda çözelti ~70 °C'de kalır. Taze hidrojen peroksit de önerilir.
    5. 30 dakika geçtikten veya çözelti köpüklenmesini durdurduğunda, 1:1:1 oranındaki çözeltiyi oda sıcaklığına kadar soğutun, ardından kapakları nazikçe dönerek saflaştırılmış suyla iyice durulayın.
  2. UV Ozon
    1. Kuvars kapak kapaklarını n-heksan ve sonra metanol ile lens mendilleriyle temizleyin.
    2. Kaplama örtülerini UV ozon temizleyiciye yerleştirin, işlem yapılacak yüzey lambaya bakacak şekilde yerleştirin.
    3. 5 dakika boyunca 5 psi hızında odaya oksijen akışı; Sonra oksijen akışını kapatın.
    4. Sonra, UV ışıklarını 15 dakika açın ve ozonun dışarı çıkması için kapakların en az 10 dakika beklemesine izin verin.
    5. Her iki temizlik yöntemini kullandıktan sonra, temizlenmiş kapakları hemen kullandığınızdan emin olun. Daha önce temizlenmiş slipler kullanıyorsanız, yüzeyi yenilemek için işlemi tekrarlayın.
      NOT: UV ozonasyonu, ozonun havadan uzaklaştırılması için düzenli bir dolaşım gerektirir. Sistem, bir hava işleyici şnorkelin altına veya bir duman davlumbasına yerleştirilmelidir.

4. İki katmanlı membranın oluşumu ve AQP4'ün iki katmanlı membrana dahil edilmesi

NOT: Bu çalışmada kullanılan tampon 100 mM HEPES, 5 mM CaCl2 ve pH 7.4 seviyesinde 140 mM NaCl'den oluşuyordu.

  1. Yeni temizlenmiş kapak parçasını 1/4 inç SM1 lens tüpü kullanarak 25 mm numune tutucuya yerleştirin. Daha sonra, 8 mm çapında çift katmanlı bir parafilm contasını kesin ve örnek tutucusunun ortasına yerleştirin (bkz. Şekil 3).
  2. 8 mm contanın ortasına 50 μL SUV damlası uygulayın, sızdırmazlayın ve ardından 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
    NOT: Bu, lipozomların hidrofilik kuvars yüzeyiyle birleşip patlamasını sağlar ve sürekli bir çift katman oluşturur.
    Conta bölgesine eklenen lipozom miktarının değişken olabileceği çok muhtemeldir ve daha büyük bir conta, sürekli çift katman oluşturmak için daha fazla lipozom gerektirebilir. Ancak, 4.2. adımda belirtilen miktarlar neredeyse her zaman sürekli çift katmanlı oluşumu teşvik eder.
  3. İnkubasyondan sonra, örneği pipetle durulayarak çözeltiyi çıkarın. Sonra, çift tabakaya 50 μL taze tampon ekleyin. Sonra, işlemi toplamda 10 kez tekrarlayın.
    NOT: Pipet ucunun lipid çift tabakaya temas etmemesi ve çift tabakayı nemli tutmak için bir miktar çözelti kalması çok önemlidir. Ucu damlanın üstüne getirdiğinizde, temas ettiğini göreceksiniz. Damla yüzeyiyle minimum temas koruyarak çift tabakaya zarar vermeden çözeltiyi çıkarabilirsiniz. Sonunda, damla ters döner ve contaya doğru emilir; Çözüm çıkarmayı bırakmak için ideal zamandır. Yansıyan ışık bu noktada değişmeli ve durma sinyali olarak hizmet verebilir. Çok fazla çözelti çıkarmaktan endişe ediyorsanız, yıkama sırasında pipet ayarını aşağı indirerek lipid çift katmanının üzerinde rahat bir tampon bırakın.
    Bu koşullar altında lipid çift tabakalı oluşumun bütünlüğü, fotobeyazlama (FRAP) sonrası floresans geri kazanımı kullanılarak önceden değerlendirilebilir. Bu, lipid karışımında floresanolarak 6,7,24,25 etiketlenmiş bir bileşenin olmasını gerektirir.
  4. Son yıkama tamamlandıktan sonra, tamponu tekrar çıkarın ve kritik miseller konsantrasyonu veya altında deterjanda istenen proteinden 50 μL aliquot ekleyin. 37 °C'de proteinin dahil edilmesi için en az 1 saat bekleyin.
    NOT: Deterjan çift tabakayı nazikçe yumuşatır ve proteinin membrana entegre olmasına yardımcı olur. Bu protokolde kullanılan deterjan 50 μM n-Dodesil-beta-D-tiomaltozid (DOTM) idi; bu da iyon dışı bir deterjan idi ve protein konsantrasyonu 2 nM idi.
  5. Bir saat sonra, numuneyi tampon ile durulayarak dahil edilmemiş protein ve deterjan giderin.
  6. Numuneye 5 mg koşullu polistirol boncukları (Bio-boncuklar) ekleyin, çıkarılmadan önce en az 1 saat bekletin. Örnek görüntülemeye hazır olur (aşağıya bakınız).

5. Antifade ekleme

  1. 5 mg Trolox ve 80 mg D-glikozu 10 mL tamponda çözün (yukarıya bakınız). Katı maddeler kalana kadar sarsın ve girdabla hareket edin. Nutate gece boyunca karanlıkta geçirin, ardından çözeltiyi 0,22 μm filtreyle filtreleyin. Haftalık taze hazırlayın.
  2. 6,5 mg Glikoz Oksidaz (1650 U) ve 8 μL Katalaz (29.200 U/mL tamponda) 92 μL tamponda çözün. Çözeltiyi girdap yapmadan nazikçe karıştırın, sonra santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. 4 °C'de sakla ve ışıktan koruyun.
    NOT: Bu çözelti buzdolabında birkaç ay saklanabilir; ancak herhangi bir bulanıklık belirirse, onu atın ve yeni bir çözüm hazırlayın.
  3. 5.1'den 99 μL çözeltiyi 5.2. adımdan 1 μL ile yeni bir tüpe karıştırın. Numunenin son durulamasından sonra, antifade çözeltisi numunenin üzerine eklenir (görüntüleme çözeltisi olarak adlandırılır).
    NOT: Antifade çözeltileri transmembran proteinlerin işlevlerini değiştirebilir; Sistemle uyumluluğun doğrulanması önemlidir.

6. Mikroskop kurulumu ve ayarları

NOT: Bu tek moleküllü çalışma için özel bir TIRF mikroskobu kullanılmıştır. Bu bölüm, hızlı zaman geçişli görüntüleme için uygun temel floresan mikroskobunun ana bileşenlerini ve temel hizalama tekniklerini (Şekil 4) tanımlar; bu mikroskop güvenilir bir cihazdır.

  1. Örnekleri uyarmak için 633 nm He:Ne lazer kullanın. Lazer, bir bant geçirici filtre ve 1/4 dalga plakasından geçerek lazer hattını incelemiş ve uyarılmayı doğrusal olarak polarize ışıktan dairesel polarize ışığa dönüştürür.
    NOT: Dairesel polarizasyon, probun yöneliminin etkisini azaltır.
  2. Işın, 300 mm lens ve 633 nm lazer çizgi filtresinden geçer, 633 nm uzun geçişli dikroik aynadan yansıyor ve 100x, 1.45 N/A yağ mikroskobu objektefinin arkasına odaklanıyor. Hedefin ortasından pürüzsüz geçmesi ve hedeften çıkarken düz kalması için ışını hizalayın.
    NOT: Bu noktada mikroskop epifloresans (epi) için yapılandırılmıştır. Şeffaf tabanlı bir küvete az miktarda toz süt eklenebilir. Kuvet, mikroskop objektif üzerine yerleştirilir ve arasına bir damla daldırma yağı sürülür. Bu, ışının hedefin içinden doğrudan geçtiğini gözlemlemenize olanak tanır.
  3. Flüoresans olarak işaretlenmiş proteinlerden çıkan emisyon, objektif dikroik ayna, uzun geçişli filtre ve 300 mm lens üzerinden geçer ve ardından EMCCD kameraya görüntülenir. Kameradaki görüntüleri büyütmek ve yavaş hareket eden transmembran proteinler ve agregalar için faydalı, süper-lokalizasyon doğruluğunu artırmak için daha uzun odak mesafeli tüp lensleri kullanın. Kamera piksellerini nanometre olarak kalibre ettiğinizden emin olun.
    NOT: Ancak, nesnenin üreticisi tarafından belirlenen tüp lensiyle 1x büyütme sağlanır; bu da floresansı daha az piksele odaklayarak sinyal-gürültü oranını artırır. Yaygın odak mesafeleri arasında 200 mm, 180 mm, 165 mm ve 164,5 mm lensler bulunur. 1951 USAF büyütme hedefi kullanmanızı öneririz. Bu kurulumda 300 mm lens kullanılarak, toplam 170x büyütmede 74 nm piksel kalibrasyonu ölçüldü.
  4. Örnek sıcaklığını, objektif bir tasma ve Peltier ısıtıcı/soğutucu 26 ile donatılmış bir numune tutucu kullanarak kontrol edin.
    NOT: Sabit bir sıcaklık sağlamak, mikroskobun termal stabilitesini sağlamak ve doğru sıcaklığa bağlı ölçümler ile cihaz odaklamasını sağlamak için çok önemlidir.
  5. Piezo aktüatörler örneği XYZ yönlerinde hareket ettirir. Bir örnek odakta bulunduğunda, ışını mikroskop nesnesinin kenarına ( bkz. Şekil 4) son döner aynaya bağlı aşamayı kullanarak kritik bir açıya ayarlayın. Bu, geçici bir uyarılma alanı oluşturur. Mikroskop artık TIRF'de konumlandırılmıştır.
    NOT: Mikroskobun TIRF'de olduğunu, lazerin geri yansıması bir çizgi (nokta değil) olduğunda ve numuneden alınan arka planın yoğunluğu azalıp uzadığında tespit edebilirsiniz.

7. Veri toplama

NOT: Kamera hızlı veri toplama için ayarlanmalıdır.

  1. Dikey piksel kaydırma hızını yaklaşık 600 ns'e ayarlayın ve dikey saat voltajını (genellikle +4) overclock edin. Sonra, yatay piksel okumasını maksimum ayarına (bu örnekte 16 bitte 30 MHz) ayarlayın. Ön amplifikatör kazancını 2'ye ayarlayın ve amplifikatör çıkışını elektron çarpımı için yapılandırın. Son olarak, elektron çarpanı kazancını en yüksek seviyeye ayarlayın.
  2. Pozlamayı 25 ms'ye ayarlayın. 25 ms pozlamada, kare hızının biraz daha uzun olduğundan emin olun (burada kullanılan kamerada 25.802 ms).
  3. Lazer gücünü sinyalin arka planın üzerinde net bir şekilde göstermesi için ayarlayın.
    NOT: Lazer gücünü ayarlamak zor olabilir. Çok yüksekse, prob çok hızlı ağarır; Çok düşük olduğunda, sinyal-gürültü oranı takip etmeyi zorlaştırır. Gücü en zayıf sinyali parçacıklar için sinyalin arka planı 3-5 kat aşacak şekilde ayarlamanızı öneriyoruz. Bölüm 2, moleküler parlaklığın neden bir dağılım gösterdiğini açıklar.
  4. Her sample için en az 1.000 parça sağlayacak kadar veri toplamak.

8. Takip analizi

NOT: Laboratuvarlarımızda, tek parçacık takip analizi genellikle Crocker ve Grier'in çalışmalarına dayanan veyazarlar 3,26,27 tarafından modifiye edilen özel MATLAB betikleri kullanılarak yapılır. Aşağıda, araştırma topluluğu için ücretsiz erişilebilir bir yazılım olan ImageJ kullanılarak yapılan bir açıklama yer almaktadır. Her iki yöntem de aynı sonuçları verir.

  1. Veri setlerini tutarlı bir boyuta kırpın ve ardından ImageJ kullanarak arka plan düzeltmesini yapın.
    NOT: Toplanan veriler setler arasında aynıysa, kırpmaya gerek yoktur. Bu genellikle sadece kamera sensöründe ilgi alanı veri toplamalar arasında kaymışsa yapılır. ImageJ'nin yetenekleri eklentilerle önemli ölçüde genişletilebilir. Bir seçenek, standart eklentilerle birlikte gelen ImageJ'yi kurup kullanmak ve kullanmak olabilir. Bu eklentiler arasında TrackMate var, bu protokoliçin burada 28,29 kullanılacak.
    ImageJ Wiki sitesi, birçok eklenti için rehberler ve örnekler sunar. Ayrıca video eğitimleri de içeriyor.
  2. FIJI'de, analiz edilecek filmi sürükleyip bırakın veya üst üste koyduğunuz *.tif dosyasını ( bkz. Ek Dosya 2).
  3. Piksel kalibrasyon detaylarını girin. Analiz sekmesinde Ölçeği Ayarla seçeneğini seçin ve cihaz için piksel-mesafe kalibrasyonunu uygulayın.
  4. Orijinalinden yapılan değişiklikleri takip etmek için bir kopyasını kaydedin.
  5. Seçilen pencereden arka planı çıkarın ve orijinal verinin kaydedilen kopyasına uygulayın. Süreç sekmesinde Arka Planı Çıkar seçeneğini seçin.
    NOT: Bu verilere göre optimize edilecek. İyi bir başlangıç noktası, görüntülenen parçacıklardan daha büyük bir "yuvarlanan top" kullanmaktır.
  6. Eklentiler sekmesinde Tracking | TrackMate. Bu, kullanıcıyı takip sürecinde yönlendiren TrackMate diyalog penceresini açar.
    NOT: İzleme tamamlandıktan sonra, ImageJ dışındaki daha fazla analiz için izleri dışa aktarmak mümkündür.

9. Veri işleme

NOT: Burada tartışılan konular, temsil verilerin nasıl işleneceği ve adım boyutu dağılımlarının nasıl hesaplanacağı ve ortalama bir difüzyon sabiti elde edilmesi konusudur.

  1. Görsel yığını FIJI'ye sürükle bırakın; Sonra, kalibrasyonu uygulayın (74 nm/piksel).
  2. Arka planı, yuvarlanan top çıkarma yöntemiyle 5 piksel genişliğinde çıkarın. Tarlayı dört ayrı 11 μm x 11 μm kesitlere kırpın ve ayrı ayrı analiz edin.
    NOT: Bu, zar proteinlerini takip ederken uyarılma alanından kaynaklanan eşik varyansını en aza indirmek içindir.
  3. TrackMate eklentisini başlat. Kalibrasyonun piksellere uygulandığını (bkz. Ek Dosya 3) ve zamanın istenen aralığı kapsadığını doğrulayın.
    1. TrackMate'te, parçacıklar için tespit yöntemi olarak Gauss'un Laplacian'ını (LoG) seçin; tahmini çapı 350 nm olarak ön işlem medyan filtresi kullanılır. Tespit edilen parçacıkların makul olup olmadığını doğrulamak için Önizleme butonuna tıklayın.
      NOT: Bazı parçacıklar açıkça arka planda olabilir; Bunlar için endişelenmeyin—bir sonraki adımda elenecekler.
    2. Sayma ayarlarından memnun kaldığınızda, yığının geri kalanını işleyin ve ardından eşik belirleme yapılır. Eşik ayarlamak için otomatik eşik kullanın veya seçim kutusunu sürükleyin.
    3. Tespit edilen parçacıkların görselleştirilmesini seçtikten sonra, bu veri seti için takip yöntemini seçin: Gelişmiş Kalman Tracker, aşağıdaki ayarlarla: arama yarıçapı için 350 nm ve maksimum 2 kare aralığı.
      NOT: Ayrıca cezalar, parça bölmesi ve parça birleştirme eklemek de mümkündür. Bu veri seti için yalnızca takip yapıldı.
    4. Parçaları nasıl filtreleyeceğinize ve görselleştireceğinize karar verin.
      NOT: Bu veri setinde yalnızca tespit edilen noktalar gösterilir (bkz. Ek Dosya 4).
    5. Bireysel izler işlendikten sonra, takip verilerini bir tablo düzenleme yazılımında kullanmak üzere XML dosyası olarak dışa aktarın ( bkz. Ek Dosya 5).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol 2. bölümünde tanımlandığı gibi, lizinler NHS-esterleri floresan boya molekülüne (NHS-boya) konjuge edilerek etiketlenmiştir. Proteine konjugasyondan sonra, UV-Vis spektrometresi ile DOL'u ölçün. Bu deney için AQP4 tetramerlerinin DOL değeri 4.12 idi. Sonra, aşağıda verilen Poisson dağılımı kullanarak her AQP4 tetramerinin en az bir boya molekülüne sahip olma olasılığını belirleyin.

figure-results-1(2)

P, her AQP4'ün etiketlenme olasılığı olduğunda, denklem 2 kullanılarak, her AQP4 tetramerinin üzerinde floresan bir etiket olma olasılığı %98'dir. Tetramer başına etiketlerin dağılımı Şekil 2'de gösterilmekte olup, örnekte gözlemlenen parlaklık dağılımını yansıtır.

Bu örnek veride elde edilen sinyal-gürültü oranı, tek bir florofor için arka planın 8-9 katı üzerinde, en parlak parçacıklar için ise 15-20 arası değişmiştir. Bu varyans, protokol adım 2'de tanımlanan uyarılma ışını ve DOL'daki konumundan kaynaklanır.

Oluşturulan XML dosyası içinde, ilgi çekici sütunlar J, K, L ve M'dir; bunlar sırasıyla parçacık numarası ID'si, parçacığın tespit edildiği çerçeve, parçacığın X konumu ve parçacığın Y konumu ile eşleşir ( bkz. Ek Dosya 6). Dosyanın ikinci sayfasında, adım boyutu dağılımı ve ortalama difüzyon katsayısı hesaplanır; burada adım boyutları bir parçacığın çerçeveler arasında hareket ettiği mesafelerdir ve ortalama difüzyon denklem 3 ile verilir:

figure-results-2(3)

Burada Dave ortalama difüzyon katsayısı, Δt ise kare hızıdır. Bu denklem, genellikle küçük yer değiştirmeler için geçerlidir ve 3,30,31 bireysel izlerden alınan ortalama kare yer değiştirme ile zaman etiketi analiz edilerek doğrulanabilir.

Adım boyutlarının histogramı, farklı boyutlarda OAP'lere atfedilen parçacıkların dağılımını gösterir (Şekil 5).

figure-results-3
Şekil 1: Lipid kurutma cihazı. Cihaz, vakum damıtma konnektörlü 10 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeden oluşur. Azot, düşük basınçta 0,2 μm bir şırınge filtresi aracılığıyla girer; sarı bir sentez kapağına iğne takılır ve bu kapalı vakum damıtma konnektörüne bağlanır. Basınç, kesilmiş bir iğneyle bir şırıngaya bağlı Tygon borusu aracılığıyla serbest bırakılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 2: Her AQP4 biriminde floresan etiketlerin denklem 2 kullanılarak beklenen dağılımı kullanılıyor. En muhtemel florofor sayısı 4 olup, tüm AQP4'lerin %98'i floresan etikete sahip olacaktır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 3: Numune tutucu montajı. Montaj, mikroskop objektefine parazit önlemek için erkek dişleri çıkarılıp eğimlenmiş 1" SM1 lens tüpünden yapılmıştır. Bir kuvars kapak kaydırması ve parafilm contası içerir. Tüm montaj SM1 tutucu halkası ile sabitlenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 4: Mikroskop. Sağ tarafta mikroskopun basitleştirilmiş bir diyagramı vardır; Yeşil çizgi, lazerden gelen uyarılma ışığını gösterir. Sağdan başlayarak, lazer ışığı 1/4 dalga plakasından geçer ve ardından 300 mm bir lens tarafından odaklanır. Işık, uzun geçişli bir dikroik aynayla nesneye yansıtılır ve arka açıklığa odaklanır. Uyarma ışınını kaydırmak için bir çeviri aynası kullanılarak, ışın hedefin açıklığının kenarına yerleştirilir ve örnekte geçici bir alan oluşur. Odundaki yayılan ışık, objektif tarafından toplanır ve kırmızı çizgi ile temsil edilir. Yayılan ışık daha sonra dikroik, ardından uzun geçişli filtreden geçer ve 300 mm lens tarafından kameraya odaklanır; böylece 1.7x optik büyütme sağlanır (objektif ve tüp lensin toplam büyütmesi 170x kat). Sol tarafta ise mikroskobun bir görüntüsü var. Lazerin doğru konumlandırılması için ek döner aynalar kullanıldığını unutmayın. Aynı zamanda, tespit kolu floresan olarak işaretlenmiş transmembran proteinlerden gelen fotonların toplanmasını maksimize edecek şekilde düzenlenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 5: Adım boyutlarının histogramı. Kırmızı dairelerle birlikte mavi çizgi, tüm basamak boyutlarının histogramıdır. Siyah çizgi, çoklu difüzyon katsayıları için uygundur. Adım boyutu olasılık dağılımı şöyle verilir: figure-results-8 burada fi , her bir difüzyon parçacık türünün kesirli popülasyonudur; her biri Brown hareketine uğradığı varsayıldığı varsayılır. Histogram ve uyum, birden fazla OAP boyutuna atfedilen daha yavaş ve hızlı hareket eden parçacıkların heterojen bir dağılımını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: SUV hazırlığı için mol bileşimlerini, toplam lipid miktarlarını ve isteğe bağlı floresan/FRAP bileşenlerini belirlemek için kullanılan elektronik tablo hesaplayıcısı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Yörünge takibinde kullanılan ham tek moleküllü floresan mikroskopi zaman geçişli görüntü yığını (TrackMate eğitim için kaynak dosya). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: İşleme öncesi yoğunluk ve arka planı gösteren ham tek moleküllü floresans verilerinin animasyonlu önizlemesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Filtrelenmiş parçacık yollarının animasyonu (eşiklendirme sonrası) ve temsil eden AQP4 yörüngelerini zaman içinde göstermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: TrackMate çıktısı kullanılarak AQP4 moleküllerinin tam alan parçacık takibi gösterilen animasyonlu üst katman. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 6: Difüzyon analizi için kullanılan çıkarılan yörünge koordinatlarını ve hesaplanmış adım boyutu dağılımlarını gösteren elektronik tablo. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, katı destekli lipid çift tabakalı membrandan geçip birbirleriyle etkileşime giren bireysel membran proteinlerini doğrudan gözlemlemek için tek parçacıklı bir takip yöntemi sunuyoruz. AQP4, farklı izoformları 32,33,34 tarafından düzenlenen dinamik kendi kendine montajlar oluşturma yeteneği nedeniyle temsilci bir örnek olarak seçilmiştir. Yukarıda, örnek hazırlamak için güvenilir bir yöntem ve milisaniye zaman ölçeklerinde tek zarlı proteinleri takip etmek için temel parametreler ortaya çıkıyor. Adımlar şunları içerir: (1) SUV'ların hazırlanması, (2) uygun floresan etiketleme seviyesinin belirlenmesi, (3) katı desteklerin hazırlanması, (4) katı destekli lipid çift katmanında transmembran protein örnekleri oluşturmak, (5) antiifade ajanlarının hazırlanması, (6) basit tek moleküllü mikroskop oluşturmak, (7) tek molekül takip verilerinin toplanması ve (8) ImageJ kullanılarak takip verilerinin analizi.

Tanımlanan adım adım yöntem kavramsal olarak basittir; ancak her kritik adımın kendi tuzakları ve sınırlamaları vardır. Bunlar arasında örnek hazırlama en zorluğu (1-5. adımlar). Bu nedenle, bazı detaylar akılda tutulmalıdır. İlki, katı destekli bir lipid çift katmanı nasıl oluşturulur. Üç ana yöntem vardır: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) SUV füzyonu ve yırtılması ve (3) spin-kaplama 35,36,37,38,39. Her yöntemin avantajları ve dezavantajları vardır. Örneğin, Langmuir-Blodgett yöntemi, iki yaprak arasındaki asimetrik bileşimler dahil olmak üzere çift katmanların özellikleri ve kimyasal bileşimi üzerinde daha fazla kontrol sağlar ve çok katmanların kontrollü bir şekilde oluşmasına olanak tanır. Ancak, LB-çukuru kullanmak teknik olarak zorlu, zaman alıcı ve35 tane edinmek maliyetlidir. Spin-kaplama, lipid çift katmanları oluşturmak için nispeten basit bir tekniktir; ancak çok katmanlı üretim eğiliminde olur ve genellikle pratik olmayan miktarda malzeme gerektirir39. Vezikül füzyonu ve yırtılma, sadece az miktarda malzeme gerektiren basit süreçlerdir. Ancak, hidrofilik bir yüzey oluşturmak çok önemlidir ve bazı lipid bileşimleri vezikül füzyonu yoluyla diğerlerinden daha kolay çift katmanlar oluşturur (örneğin, laboratuvarımızda, net negatif yüklü veziküllerin sadece iki valentli katyon eklenince ve uzun kuluçka süreleriyle vezikül füzyonu yoluyla çift katmanlar oluşturduğunu gördük)40). Hidrofilik bir yüzey oluşturmanın yanı sıra (adım 3), vezikül füzyonu yoluyla katı destekli çift tabaka oluştururken diğer önemli hususlar arasında yeni oluşmuş çift tabakanın hem membran proteini dahil edilmeden önce hem de sonra yıkanması yer alır. Yerleştirme önü yıkama, fazla SUV ve daha büyük multilamellar vezikülleri (MLV) çıkarırken, membran yerleştirildikten sonraki son yıkama ise inkorpore edilmemiş proteini temizler. Yetersiz yıkama, takip çalışmaları sırasında arka plan sinyalleri oluşturabilir.

C12E9, Tween-20, TritonX-100 ve daha birçok deterjan dahil olmak üzere, katı destekli lipid çift katmanlarına transmembran protein yerleştirmeye uygun olup olmadığını belirlemek için çok sayıda deterjan taraması yaptık. Tercih ettiğimiz deterjan DOTM'dir çünkü kolayca çıkarılabilir ve zar için en nazik olanıdır (zar bütünlüğünü bozma olasılığı daha düşüktür). Eklenen protein miktarı kritik öneme sahiptir. Çok fazla, tek izleri gözlemlemek imkansız olur. Bu prosedür diğer transmembran proteinlere uyarlanırken, miktar deneme yanılma yoluyla ayarlanmalıdır. Ancak, bu prosedürde verilen miktarlar mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Deterjan miktarı kritik miseller konsantrasyonu altında veya altında tutulmalıdır; aksi takdirde, çift katman çözünür ve kuvars alt tabakasından çıkarılır.

Desteklenen lipid çift tabakasına membran proteinlerinin yerleştirilmesi, her deneysel koşullar seti için optimize edilmelidir. Ancak, bunu başarmak için proteolipozomların kullanımı ve membran proteinlerinin önceden oluşturulmuş çiftkatmanlı 41'e doğrudan dahil edilmesi gibi birkaç yaygın yöntem vardır. Proteoliposom, SUV gibi bir lipozomdur ve içinde bir protein bulunur. Bu proteoliposomlar, önceden oluşturulmuş katı destekli lipid çift katmanla birleşebilir veya çift katmanlıoluşum 42 sırasında SUV'larla eşzamanlı olarak entegre edilebilir. Füzyon yırtılmaya neden olur ve protein zara salınır. Uygulaması kolaydır, ancak zar proteinlerinin rastgele bir yönümü oluşur. Bu, katı destekle güçlü etkileşimlere yol açabilir ve proteinin yönümüne bağlı olarak farklı difüzyonözelliklere yol açabilir 3. Bu protokol, doğrudan inkorporasyonu kullanan bir yöntemi tanımlar; bu yöntem, 2,5,43,44 proteininin bir tarafında büyük hidrofilik alanlara sahip AQP4 ve diğer membran proteinlerine yönsel tercih sağlar.

Doğrudan gözlem, bilimsel keşiflerde kullanılan güçlü bir araçtır. Dinamik tek moleküllü görüntüleme, özellikle membran-protein biyofiziğinde önemlidir; burada bireysel proteinlerin hareketi ve etkileşimleri gözlemlenir; hipotezler test edilir veya proteinin nasıl davrandığını daha iyi tanımlayan yeni hipotezler oluşturulur. Burada açıklanan protokol ve yöntemler, iki boyutlu katı destekli lipid çift katmanları için idealdir, ancak çoklu bileşen2, canlı hücreler 34,45,46,47 ve üç boyutlu 48 daha karmaşık ortamlara da genişletilebilir. Tek molekül takibi, iki renkli tek moleküllü takip49, tek molekül FRET50,51 ve Stokastik Optik Yeniden Yapılandırma Mikroskopisi (STORM) ve Nokta Birikimli Görüntüleme Nano Ölçekli Topografi (PAINT) gibi dinamik süper çözünürlüklü görüntüleme gibi birçok başka deneyin kapısını açmaktadır. Cihazın sıcaklık kontrolünü de dahil etmesi sayesinde membran proteinlerinin termodinamik özellikleri dearaştırılabilir 26,43,52.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi FA9550-20-1-0324, FA9550-23-1-0583 (J.A.B. ve G.P.N.) ve FA9550-18-1-0395 (J.A.B.) tarafından desteklendi.

G.P.N. aşağıdaki finansman kuruluşlarını kabul eder:
(1) NEXTGENERATIONEU (NGEU) Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (MUR), Ulusal İyileşme ve Dayanıklılık Planı (NRRP), proje MNESYS (PE0000006) tarafından finanse edilen - Sağlık ve hastalıkta sinir sisteminin incelenmesine yönelik çok ölçekli entegre yaklaşım (DD n. 1553, 11.10.2022)
(2) Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (MUR) tarafından finanse edilen NEXTGENERATIONEU (NGEU), Ulusal İyileşme ve Dayanıklılık Planı (NRRP), proje CN_00000041 - RNA Teknolojisine Dayalı Ulusal Gen Terapisi ve İlaç Merkezi (DD n.1035, 17.06.2022).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1/4 Dalga PlakasıThorlabsWPQ05M-633Lazerle eşleştiğinden emin olun
100X Petrol HedefiOlympus12-563-6591.45 N/A apokromatik
16:0-18:1 PCAvanti Polar Lipidleri850457POPC Fosfolipidler
18:0 PEG2000 PEAvanti Polar Lipidleri880210Amonyum Tuzu
300mm LensThorlabsAC254-300-A-ML
633 nm He:Ne LazerMelles Griot05-LHP-927Başka kaynaklara ve başka dalga boylarına değiştirilebilir
633nm bant geçirici filtreChroma Tech633/10XKullanılan lazerle eşleşme
655nm Uzun Geçişli FiltreChroma TechET655lpBoya/lazerin dalga boylarına göre değiştirin
Andor Solis IAndor Andor Solis IGörüntü yakalama yazılımı
ATTO 655 ATTO-TECMS 655NHS-Ester modifikasyonu, tek molekül çalışması için uygun modifikasyona sahip herhangi bir boya kullanılabilir. ATTO önerilir ama Cy5/7 kullanılabilir
Biyo-boncuklar SM-2 ReçineBioRad1523922
Kalsiyum klorürMillipore SigmaC4901
KatalazSigma-AldrichC3155-50MGsığır karaciğerinden, sulu solsiyondan, ≥ 30000 birim/mg
KloroformFisher Scientific C547-1HPLC veya spektroskopik sınıf
KolesterolSigma-AldrichC8667-500MG
Kapak SlipleriESCO OptikleriR52500025mm Kuvars
Dikroik Işın BölücüSemrockFF545/650-Di01-25x36Boya/lazerin dalga boylarına göre değiştirin
EMCCD KameraAndor iXon Ultra 888
Falcon Tüpleri 15mL Greiner Bio-one188261Cellestar hücre kültürü tüpleri
Glikoz OksidazSigma-AldrichG2133-50KUAspergillus niger'den, tiper VII, ≥ 100000 birim/g katı (eklenmiş oksijen olmadan)
Isı TabancasıLiman Yük56434Parafilmin ısıtılmasında genellikle herhangi bir ısı tabancası kullanılabilir
HEPESFisher BiyoreagentleriBP310-500
Düşük Otofloresans Daldırma YağıThorlabsMOIL-30
MetanalFisher Scientific A452-1HPLC veya spektroskopik sınıf
Mikro Santrifüj TüpüVMR525-11261,5 mL 
Mikro PipetterlerEpendorfÇeşitli; 1000 µ L, 100 & mikro; L ve 10 µ L önerilmektedir
Ø 1.5" Lens TüpleriThorlabsSM1.5L10Dış diş örnek hazırlığı için kısaltıldı
Optik TabloNewportRPR GüvenTabelin boyutu mevcut alana bağlıdır
Optik dokularThorlabsMC-50EÇeşitli bileşenlerin temizlenmesi
ParafilmMillipore SigmaP7669İşlem sırasında gazlardan floresan bir şey olmadığını doğrulamayın
Piezo AktüatörNewportPZA12
Pnömatik Titreşim İzolatörleriNewportI-2000 Serisioptik tabloyu herhangi bir düzensizlik için stabilize etmek için kullanılır 
Soğutmalı BanyoFisher Scientific Isotemp 3016
Deklanşör KontrolörüThorlabsSC10Görüntüleme yazılımına bağlı
Sodyum KlorürMillipore SigmaS988
Steritop FiltresiMillipore SigmaS2GPT05RE
Switchbox Sürücüsü ve Kontrolcüsü NewportPZC200Sahne kontrolörü
Şırınga FiltresiJ.T. BakerSF01-98PES 25mm 0.2 & mikro; M
TEC ElemanıThorlabsTEC3-2.5Peltirer ısı pompasını örnek tutucuya ve objektif tasmaya bağlamak için kullanılır
Sıcaklık kontrolleyicisiMeerstetter MühendisliğiTEC-1091
Sıcaklık DedektörüThorlabsTH100PT
TermistörThorlabsTH10K
Tube-O-DialyzerG Biosciences786-6114K MWCO
UV Ozon TemizleyiciNovascanPSDP_UVPro Seri - Dijital  
Zoom Optikler ThorlabsSM1NR1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fitzner, D., et al. Cell-type- and brain-region-resolved mouse brain lipidome. Cell Rep. 32 (11), 108132(2020).
  2. Barnaba, C., Taylor, E., Brozik, J. A. Dissociation constants of cytochrome P450 2C9/cytochrome P450 reductase complexes in a lipid bilayer membrane depend on NADPH: a single-protein tracking study. J Am Chem Soc. 139 (49), 17923-17934 (2017).
  3. Poudel, K. R., Keller, D. J., Brozik, J. A. Single particle tracking reveals corralling of a transmembrane protein in a double-cushioned lipid bilayer assembly. Langmuir. 27 (1), 320-327 (2011).
  4. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24 (13), 6820-6826 (2008).
  5. Barnaba, C., Martinez, M. J., Taylor, E., Barden, A. O., Brozik, J. A. Single-protein tracking reveals that NADPH mediates the insertion of cytochrome P450 reductase into a biomimetic of the endoplasmic reticulum. J Am Chem Soc. 139 (15), 5420-5430 (2017).
  6. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. J Vis Exp. (52), e2696(2011).
  7. Zheng, C. -Y., Petralia, R. S., Wang, Y. -X., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence-tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. J Vis Exp. (50), e2568(2011).
  8. Khaw, I., et al. Flat-field illumination for quantitative fluorescence imaging. Opt Express. 26 (12), 15276-15288 (2018).
  9. Carder, J. D., et al. Thermodynamics and S-palmitoylation dependence of interactions between human aquaporin-4 M1 tetramers in model membranes. J Phys Chem B. 128 (3), 603-621 (2024).
  10. Saadoun, S., Papadopoulos, M. C. Aquaporin-4 in brain and spinal cord oedema. Neuroscience. 168 (4), 1036-1046 (2010).
  11. Mader, S., Brimberg, L. Aquaporin-4 water channel in the brain and its implication for health and disease. Cells. 8 (2), (2019).
  12. Salman, M. M., et al. Emerging roles for dynamic aquaporin-4 subcellular relocalization in CNS water homeostasis. Brain. 145 (1), 64-75 (2021).
  13. Graber, D. J., Levy, M., Kerr, D., Wade, W. F. Neuromyelitis optica pathogenesis and aquaporin-4. J Neuroinflammation. 5 (1), 22(2008).
  14. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG-Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), e62(2015).
  15. Takahashi, T., et al. Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO: a study on antibody titre. Brain. 130 (Pt 5), 1235-1243 (2007).
  16. Ho, J. D., et al. Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 Å and its mechanism of conductance. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7437-7442 (2009).
  17. Crane, J. M., Verkman, A. S. Reversible, temperature-dependent supramolecular assembly of aquaporin-4 orthogonal arrays in live cell membranes. Biophys J. 97 (11), 3010-3018 (2009).
  18. Crane, J. M., Verkman, A. S. Determinants of aquaporin-4 assembly in orthogonal arrays revealed by live-cell single-molecule fluorescence imaging. J Cell Sci. 122 (6), 813-821 (2009).
  19. Jin, B. -J., Rossi, A., Verkman, A. S. Model of aquaporin-4 supramolecular assembly in orthogonal arrays based on heterotetrameric association of M1-M23 isoforms. Biophys J. 100 (12), 2936-2945 (2011).
  20. Hamai, C., Cremer, P. S., Musser, S. M. Single giant vesicle rupture events reveal multiple mechanisms of glass-supported bilayer formation. Biophys J. 92 (6), 1988-1999 (2007).
  21. Kurniawan, J., Ventrici De Souza, J. F., Dang, A. T., Liu, G. -Y., Kuhl, T. L. Preparation and characterization of solid-supported lipid bilayers formed by Langmuir-Blodgett deposition: a tutorial. Langmuir. 34 (51), 15622-15639 (2018).
  22. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. In Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  23. Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).
  24. Barnaba, C., Martinez, M. J., Taylor, E., Barden, A. O., Brozik, J. A. Single-protein tracking reveals that NADPH mediates the insertion of cytochrome P450 reductase into a biomimetic of the endoplasmic reticulum. J Am Chem Soc. 139 (15), 5420-5430 (2017).
  25. Barnaba, C., Taylor, E., Brozik, J. A. Dissociation constants of cytochrome P450 2C9/cytochrome P450 reductase complexes in a lipid bilayer membrane depend on NADPH: a single-protein tracking study. J Am Chem Soc. 139 (49), 17923-17934 (2017).
  26. Martinez, M. J., et al. Thermodynamic driving forces of redox-dependent CPR insertion into biomimetic endoplasmic reticulum membranes. J Phys Chem B. 126 (5), 1141-1151 (2022).
  27. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. J Colloid Interface Sci. 179 (1), 298-310 (1996).
  28. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  29. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Poudel, K. R., Keller, D. J., Brozik, J. A. The effect of a phase transition on single molecule tracks of annexin V in cushioned DMPC assemblies. Soft Matter. 8 (44), 11285-11293 (2012).
  31. McCain, K. S., Hanley, D. C., Harris, J. M. Single-molecule fluorescence trajectories for investigating molecular transport in thin silica sol-gel films. Anal Chem. 75 (17), 4351-4359 (2003).
  32. Loughran, G., et al. Evidence of efficient stop codon readthrough in four mammalian genes. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8928-8938 (2014).
  33. Crane, J. M., Verkman, A. S. Reversible, temperature-dependent supramolecular assembly of aquaporin-4 orthogonal arrays in live cell membranes. Biophys J. 97 (11), 3010-3018 (2009).
  34. Crane, J. M., Van Hoek, A. N., Skach, W. R., Verkman, A. S. Aquaporin-4 dynamics in orthogonal arrays in live cells visualized by quantum dot single particle tracking. Mol Biol Cell. 19 (8), 3369-3378 (2008).
  35. Kurniawan, J., Ventrici De Souza, J. F., Dang, A. T., Liu, G. -Y., Kuhl, T. L. Preparation and characterization of solid-supported lipid bilayers formed by Langmuir-Blodgett deposition: a tutorial. Langmuir. 34 (51), 15622-15639 (2018).
  36. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  37. Hardy, G. J., Nayak, R., Zauscher, S. Model cell membranes: techniques to form complex biomimetic supported lipid bilayers via vesicle fusion. Curr Opin Colloid Interface Sci. 18 (5), 448-458 (2013).
  38. Simonsen, A. C., Bagatolli, L. A. Structure of spin-coated lipid films and domain formation in supported membranes formed by hydration. Langmuir. 20 (22), 9720-9728 (2004).
  39. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18 (21), 8172-8177 (2002).
  40. Silva-López, E. I., Edens, L. E., Barden, A. O., Keller, D. J., Brozik, J. A. Conditions for liposome adsorption and bilayer formation on BSA-passivated solid supports. Chem Phys Lipids. 183, 91-99 (2014).
  41. Granéli, A., Rydström, J., Kasemo, B., Höök, F. Formation of supported lipid bilayer membranes on SiO2 from proteoliposomes containing transmembrane proteins. Langmuir. 19 (3), 842-850 (2003).
  42. Puu, G., Artursson, E., Gustafson, I., Lundström, M., Jass, J. Distribution and stability of membrane proteins in lipid membranes on solid supports. Biosens Bioelectron. 15 (1), 31-41 (2000).
  43. Davis, R. W., et al. Nanoporous microbead supported bilayers: stability, physical characterization, and incorporation of functional transmembrane proteins. Langmuir. 23 (7), 3864-3872 (2007).
  44. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  45. Zepernick, A. -L., et al. Single-molecule imaging of aquaporin-4 array dynamics in astrocytes. Nanoscale. 16 (19), 9576-9582 (2024).
  46. Verkman, A. S., Rossi, A., Crane, J. M. Methods Enzymol. 504, 341-354 (2012).
  47. Tajima, M., Crane, J. M., Verkman, A. S. Aquaporin-4 (AQP4) associations and array dynamics probed by photobleaching and single-molecule analysis of green fluorescent protein-AQP4 chimeras. J Biol Chem. 285 (11), 8163-8170 (2010).
  48. Nguyen, T. D., Chen, Y. -I., Chen, L. H., Yeh, H. -C. Recent advances in single-molecule tracking and imaging techniques. Annu Rev Anal Chem. 16, 253-284 (2023).
  49. Schirripa Spagnolo, C., Moscardini, A., Amodeo, R., Beltram, F., Luin, S. Optimized two-color single-molecule tracking of fast-diffusing membrane receptors. Adv Opt Mater. 12 (9), 2302012(2024).
  50. Bartels, K., Lasitza-Male, T., Hofmann, H., Löw, C. Single-molecule FRET of membrane transport proteins. ChemBioChem. 22 (17), 2657-2671 (2021).
  51. Sasmal, D. K., Pulido, L. E., Kasal, S., Huang, J. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer in molecular biology. Nanoscale. 8 (48), 19928-19944 (2016).
  52. Lam, K. T., et al. Direct measurement of single-molecule ligand-receptor interactions. J Phys Chem B. 124 (36), 7791-7802 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Protein TrackingLipid BilayersFluorescence MicroscopyMembrane ProteinsSingle Molecule ImagingTime Lapse ImagingAquaporin 4Protein DiffusionBiomimetic MembranesTrackMate Analysis

Related Articles