Yöntem makalesi

Beyin Organoidleri Kullanılarak Mitokondriyal Hastalığın Modellenmesi: Mitokondriyal Ensefalomiyopati, Laktik Asidoz ve İnme Benzeri Epizodlara Odaklanma

DOI:

10.3791/69303

⸱

10 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin organoidleri, Mitokondriyal Ensefalomiyopati, Laktik Asidoz ve İnme benzeri ataklar (MELAS) çalışmaları için değerli bir model görevi görerek, bunların altında yatan patofizyolojiye dair içgörüler sunar ve ilaç taraması için bir platform sağlar. Hastalığa neden olan genlerin değişen seviyelerde heteroplazmisine sahip hücre dizilerinden türetilen organoidler, önemli fenotipik farklılıklar sergiler.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal Ensefalomiyopati, Laktik Asidoz ve İnme benzeri ataklar (MELAS), en yaygın olarak mitokondriyal tRNALeu'daki bir m.3243A>G varyantının neden olduğu mitokondriyal bozukluklardır. MELAS'ın patofizyolojisini araştırmak için, m.3243A>G varyantını taşıyan MELAS'lı bir hastadan türetilen çoklu indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) hatlarından beyin organoidleri ürettik. Bu çizgiler aynı nükleer genetik arka planı paylaşır ancak m.3243A>G varyantını içeren heteroplazmi seviyelerinde farklılık gösterir. Heteroplazmi derecesi ile ilişkili olan organoid boyutu, morfolojisi ve nöral indüksiyon verimliliğinde önemli farklılıklar gözlemledik. Organoidlerden ayrışmış nöronlar, yüksek verimli ilaç taraması için uygun ve uygun olan bir 2D kültür sistemine aktarıldı. Organoidler ayrıca heteroplazmi seviyelerine bağlı olarak sinir ağlarının oluşumunda önemli farklılıklar sergiledi. Sonuçlarımız, hastadan türetilen iPSC tabanlı organoid modellerin, MELAS mekanizmalarını incelemek ve ilaç taraması için yararlı bir platformu temsil ettiğini göstermektedir. Bu video, organoidlerin üretilmesi ve fenotiplerin değerlendirilmesine yönelik protokoller de dahil olmak üzere kapsamlı ve kullanıcı dostu yöntemler sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal miyopati, ensefalopati, laktik asidoz ve inme benzeri ataklar (MELAS), nörolojik disfonksiyon, inme benzeri ataklar ve çeşitli sistemik semptomlarla karakterize mitokondriyal hastalıklardır. En yaygın neden, mitokondriyal lösin tRNA geni MT-TL11'deki bir m.3243A>G varyantıdır. Bu varyantın antikodondaki taurin modifikasyonunu bozduğuna, böylece lösin translasyon etkinliğini azalttığına ve MELAS 2,3,4'te mitokondriyal disfonksiyona katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. Özellikle, yüksek doz taurin uygulamasını takiben semptomlarda iyileşmeler bildirilmiştir 5,6. Bununla birlikte, yanıt vermeyenlerin varlığı, henüz tanımlanamayan ek patofizyolojik mekanizmaların, m.3243A>G varyantını barındıran bireylerde hastalığa katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir.

Genetik varyantların neden olduğu hastalık mekanizmalarını aydınlatmak için, nedensel varyant dışında tüm değişkenlerin aynı olduğu ve doğru fenotipik karşılaştırmalara olanak tanıyan deneysel modellerin kullanılması idealdir. Genomu düzenlenmiş hücre dizileri ve düzeltilmiş varyantlara sahip hayvan modelleri genellikle nükleer gen bozuklukları için kontrol olarak kullanılır. Bununla birlikte, mtDNA varyantlarının onarımı, gelişmiş genom düzenleme teknolojileriyle bile teknik olarak zor olmaya devam etmektedir7. Bu nedenle, aynı nükleer geçmişe sahip deneysel modellerin oluşturulması zorlu olmaya devam etmektedir. Bu sorunu çözmek için, MELAS'lı aynı hastadan türetilen ve yalnızca heteroplazmi seviyelerinde (yani, MT-TL1 m.3243A>G varyantı8'i taşıyan mitokondriyal DNA oranı) farklılık gösteren iki indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) dizisi kullandık ve bir hastalık modeli olarak beyin organoidleri ürettik. Heteroplazmi seviyeleri, hücre geçişi veya farklılaşması sırasında dalgalanabilse de, potansiyel olarak fenotipleri etkileyebilir ve deneysel sonuçlarda partiden partiye değişkenliğe neden olabilir, mitokondriyal gen varyantları taşıyan hasta kaynaklı hücreler, hastalık patogenezini araştırmak için değerli olmaya devam etmektedir.

Bu çalışmada, MELAS'lı bir hastadan türetilen iPSC'lerden beyin organoidleri ürettik ve hastalık mekanizmalarını daha iyi anlamak için patofizyolojilerini araştırdık. Yüksek ve düşük heteroplazmi seviyelerine sahip iki iPSC hattı kullanarak, heteroplazmi derecesi ile ilişkili olan nöral indüksiyon verimliliğinde önemli farklılıklar gözlemledik. Bulgularımız, hasta kaynaklı iPSC tabanlı beyin organoidlerinin, MELAS'ın altında yatan mekanizmaları aydınlatmak ve ilaç taramasını kolaylaştırmak için değerli bir platform sağladığını göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki iPSC çizgisi (2-6 ve 2-8), aynı MELAS hastasının fibroblastlarından iyi bilinen yöntemler kullanılarak türetilmiştir8. Sadece heteroplazmi seviyelerinde farklılık gösterirler. Kontrol olarak sağlıklı bir bireyden oluşturulan 414C2 iPSC hattı kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan protokol, Kitasato Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu'nun (#G22-02) yönergelerini takip etti.

1. Hücre kültürü

  1. Dondurulmuş hücre stoklarının çözülmesi
    1. Üreticinin talimatlarına göre laminin ile kaplayarak 6 oyuklu plakalar hazırlayın.
    2. 10 μM ROCK inhibitörü içeren besleyici içermeyen iPSC'ler için kültür ortamını 37 °C'ye ısıtın.
    3. Dondurulmuş iPSC şişesini sıvı nitrojen (LqN2) tankından alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün.
    4. Çözülmüş süspansiyonu 10 mL önceden ısıtılmış ortama aktarın. Oda sıcaklığında (22 °C) 5 dakika boyunca 120 × g'da santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve tüpe dokunarak peleti yavaşça yeniden süspanse edin. Taze ortam ve tohum hücrelerini, laminin ile önceden kaplanmış 6 oyuklu plakalara ekleyin. %5CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.
  2. Orta değişiklik
    1. Ortamı (ROCK inhibitörü olmadan) her 1-2 günde bir değiştirin.

2. Serebral organoidlerin üretimi

  1. Farklılaşmanın başlatılması (0.
    1. Ortamı iPSC (~%70-80 birleşik) kültür plakalarından çıkarın. Hücreleri PBS ile yıkayın.
    2. Enzim çözeltisi ekleyin ve 37 derecede 5 dakika inkübe edin.
    3. Reaksiyonu durdurmak için ortam ekleyin. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında (22 °C) 5 dakika boyunca 190 × g'da santrifüjleyin.
    4. Peleti 30 μM ROCK inhibitörü, 5 μM SB431542 ve 2.5 μM IWP-2 içeren 1 mL farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.
      NOT: Temel ortam, adım 1.1.2'de kullanılanla aynıdır.
    5. Hücreleri sayın. Tohum 3 × 103 hücre, U şeklinde, 96 oyuklu, düşük bağlantılı plakalarda kuyu başına 100 μL'de bulunur. 37 °C'de, %5CO2'de 6 gün inkübe edin.
  2. Orta değişim (6.
    1. Geniş çaplı bir pipet kullanarak organoidleri (adım 2.1.5'ten itibaren) 96 oyuklu bir plakadan 10 cm'lik bir kaba aktarın. Yeni bir 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 50 μL ortam (%1 N2, %1 glutamin ikamesi %1 NEAA, 2,5 μM IWP-2, 5 μg/mL heparan sülfat ve %1 PS içeren DMEM/F12) ekleyin.
      NOT: 3D yapılarını bozmamak için organoidleri aktarırken deneyler boyunca geniş çaplı pipetler kullanın. Ayrıca 8 kanallı pipetler deneylerin hızlı ve doğru bir şekilde gerçekleştirilmesine yardımcı olur.
    2. Organoidleri 2 mL'lik tüplere toplayın. Organoidleri aspire etmemek için ortamı dikkatlice çıkarın ve 1,5 mL DMEM/F12 ekleyin. Organoidleri yıkamak için 3x tekrarlayın.
    3. Ortamı çıkarın ve organoidli tüplere 500 μL taze ortam ekleyin. Tüm organoidleri 10 cm'lik bir kaba aktarın, ardından her bir organoidi almayı kolaylaştırmak için 5 mL ortam ekleyin.
    4. 50 μL'ye ayarlanmış bir mikropipet kullanarak tek bir organoid alın ve 96 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Tüm organoidler 96 oyuklu plakaya aktarılana kadar tekrarlayın (son hacim 100 μL). 37 °C, %5 CO2'de 3 gün inkübe edin.
  3. Orta değişiklik (9.
    1. (İsteğe bağlı) 8 kanallı pipetler kullanırken organoidleri 10 cm'lik bir kaba aktarın. Tek kanallı mikropipetler kullanırken adım 2.3.1'i atlayın ve adım 2.3.2'ye geçin.
    2. Organoidleri 2 mL'lik tüplere toplayın. Adım 2.2.2'de olduğu gibi DMEM/F12 ile 3 kez yıkayın.
    3. A vitamini içermeyen %1 N2, %2 B27, 100 μM 2-merkaptoetanol (ME), 2,5 μg/mL insülin, %1 glutamin ikamesi, %0,5 NEAA ve %1 bazal membran ekstraktı içeren farklılaşma ortamında (1:1 DMEM/F12 ve nörobazal) yeniden süspanse edin.
      NOT: Tek kullanımlık küçük bazal membran ekstraktı parçaları hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın. Ekstraktı 8 °C'yi aşmasına izin vermeden 4 derecede çözdürün, ardından soğuk ortama karıştırın ve ortamı oda sıcaklığında yaklaşık 30 dakika ısıtın.
    4. Kuyu başına ~10 organoidi 6 oyuklu bir plakaya aktarın. Ortamın son hacmini 1 kuyu için 2 mL'ye ayarlayın. 37 °C'de 6 gün boyunca statik olarak kültür,% 5 CO2 .
  4. Orta değişim (15.
    1. Organoidleri 15 mL'lik tüplere toplayın. Tüm organoidler yerleşene kadar tüpü rahatsız etmeyin. Süpernatanı çıkarın ve taze farklılaşma ortamı ekleyin (adım 2.3.3 ile aynıdır ancak B27 + A vitamini ile).
      NOT: Genellikle organoidler santrifüjleme yapılmadan tüpün dibine yerleşir. Bununla birlikte, hasta iPSC'lerinden türetilen küçük organoidler verimli bir şekilde batmayabilir. Bu durumda, organoidleri toplamak için tüpleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 120 × g'da santrifüjleyin.
    2. Kuyu başına ~10 organoidi 6 oyuklu bir plakaya aktarın. 37 °C'de 15 gün boyunca statik olarak kültür,% 5 CO2.
    3. 30. Güne kadar her 5-7 günde bir ortamı değiştirin.

3. 2D kültür için serebral organoidlerin ayrışması (30.

  1. Poli-L-ornitin (PO) ile kaplama plakaları
    1. 10 mg PO'yu 66.7 mL H2O içinde çözerek PO stok çözeltisi hazırlayın ve tek kullanım için küçük alikotlar yapın. Kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
    2. PO stok çözeltisini 1:5 oranında H2O ile seyreltin ve kültür plakalarını seyreltilmiş çözelti ile kaplayın. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  2. Laminin kaplama
    1. PO'yu çıkarın ve kuyuları PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    2. Laminin (PBS'de 1:1.000) ekleyin ve 37 °C'de 3 saat veya gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Lamininin stok çözeltisi 1 mg / mL'dir. Küçük parçalar hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.
  3. Tek nöronlara ayrışma
    1. Kullanmadan önce ayrışma solüsyonunu 4 °C'de 1 saat çözdürün.
    2. Organoidleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve tüm organoidler yerleşene kadar tüpü rahatsız etmeyin. Süpernatanı çıkarın ve organoidleri durulamak için 5 mL PBS ekleyin.
    3. PBS'yi çıkardıktan sonra 1 mL enzim solüsyonu ekleyin ve 1-2 kez hafifçe pipetleyin. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin; birkaç kez pipetleyin. Gerekirse, 2-3 dakika daha inkübe edin. Ayrışmayı tamamlamak için tekrar pipetleyin.
    4. 200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, 1 mL dispersiyon solüsyonu ekleyin ve pipet kullanın.
    5. Altına izolasyon solüsyonu koyun ve 200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    6. 1 mL nöronal ortam (%1 B27, %0.25 glutamin ikamesi, %1 PS ile nörobazal) ekleyin ve karıştırın. Süspansiyonu 70 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik bir tüpe geçirin.
    7. Hücreleri sayın. PO/laminin kaplı plakalar üzerinde 1 × 105 hücre/cm2'de tohum hücreleri. 60. Güne kadar her 4-7 günde bir besiyeri değiştirin.

4. Hücresel ve moleküler analiz için hücre ve organoidlerin toplanması

  1. İmmünofloresan için organoid fiksasyon (30.
    1. Organoidleri (adım 2.4.3) mikrotüplere toplayın.
    2. Organoidleri aspire etmemek için ortamı dikkatlice çıkarın ve organoidleri durulamak için 1 mL PBS ekleyin.
    3. Organoidleri aspire etmemek için PBS'yi dikkatlice çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika sabitlemek için %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin.
    4. PBS ile 3x yıkayın.
    5. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. RT-qPCR için organoid toplama (30.
    1. Organoidleri (adım 2.4.3) mikrotüplere aktarın. Adım 4.1.2'de açıklandığı gibi PBS ile yıkayın.
    2. Lizis tamponu ekleyin ve sıvı nitrojen (LqN2) içinde anında dondurun . Kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
  3. İmmünofloresan için hücre fiksasyonu (60.
    1. Kültür ortamını çıkarın ve yıkama hücrelerine PBS ekleyin.
    2. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 PFA'da sabitleyin.
    3. PFA'yı çıkarın ve yıkama hücrelerine PBS ekleyin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
    4. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.

5. RT-qPCR

  1. Kit üreticisinin talimatlarına göre organoidlerden toplam RNA'yı çıkarın.
  2. Adım 5.1'de hazırlanan 1 μg toplam RNA'dan cDNA'yı kit üreticisinin talimatlarına göre toplam 20 μL reaksiyon hacminde sentezleyin.
  3. Aşağıdaki primerleri kullanarak kantitatif PCR gerçekleştirin: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Her reaksiyon için nihai konsantrasyonu aşağıdaki gibi ayarlayın: 1x floresan ana karışım, 0.25 μM ileri primer, 0.25 μM ters primer. Toplam reaksiyon hacmi, Adım 5.2'den itibaren 0,2 μL cDNA dahil olmak üzere 15 μL'dir. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 95 °C'de 1 dakika boyunca ilk denatürasyon; 15 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C'lik 40 döngü.
  4. FOXG1 ifadesini iç kontrol olarak ACTB'ye normalleştirin.

6. İmmünofloresan boyama

  1. Organoidleri (Gün 30) %10 sükrozda 4 °C'de 1 saat, ardından %30 sükrozu 4 °C'de ≥3 saat inkübe edin.
  2. Organoidleri gömme ortamına monte edin ve kriyostat kullanarak kriyoseksiyon (10 μm) hazırlayın. Bölümleri kullanana kadar -20 °C'de slayt camlarında saklayın.
  3. Gömme ortamını PBS yıkama ile çıkarın (2 x 5 dakika).
  4. 10 dakika boyunca %0,3 PBST'de geçirgenleştirin. PBS ile yıkayın.
  5. 1 saat boyunca %0.1 PBST'de %10 normal keçi serumunu bloke edin. Birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edin: anti-FOXG1 (1:200), anti-TUBB3 (1:500-1:1.000). PBS ile 3x yıkayın.
  6. İkincil antikor (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) ile 1 saat inkübe edin. PBS ile 3x yıkayın.
  7. Konfokal mikroskop altında monte edin ve gözlemleyin.

7. Heteroplazmi analizi

  1. Hücre kazıyıcıları kullanarak iPSC'leri toplayın ve mikrotüplere aktarın. 0,5 mL PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 100 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve Adım 7.2'ye geçin.
  2. Kit üreticisinin talimatlarına göre toplam DNA'yı çıkarın.
  3. Her PCR reaksiyonu için son konsantrasyonu ayarlayın: 1x floresan ana karışım, 0.25 μM ileri primer, 0.25 μM ters primer. Toplam reaksiyon hacmi, Adım 7.2'deki 50 ng toplam DNA dahil olmak üzere 15 μL'dir. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 95 °C'de 1 dakika boyunca ilk denatürasyon; 15 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C'lik 40 döngü. Primer dizileri aşağıdaki gibidir: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ ileri: gccaggaggtcttcgctgta; FBXO15_ tersi: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. Mitokondriyal DNA kopya sayısını (mutant ve vahşi tip) hesaplamak için eşik döngüsü değerlerini kullanın.
  5. FBXO15 nükleer gen kopya numarasına normalleştirin.

8. Organoid boyut ve şeklinin değerlendirilmesi

  1. TIFF formatlı mikroskop kullanarak organoidlerin görüntülerini yakalayın.
  2. Açık kaynaklı görüntü analiz yazılımını kullanarak boyutu ve daireselliği ölçün. Adım 8.1'de kaydedilen TIFF dosyalarını Dosya | Dosyayı açın ve seçin. Serbest el seçimlerini seçin ve organoidi izleyin. Ardından Analiz Et | Ölçün. Sonuçlardaki Alan ve Dairesellik değerleri Adım 8.3'teki analiz için kullanıldı.
  3. İstatistiksel yazılım kullanarak kontrol hatlarına kıyasla önemli farklılıklar olup olmadığını değerlendirmek için bir t-testi yaparak verileri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin organoidleri oluşturduk ve Nakamura ve ark.9'a dayanan küçük değişikliklerle nispeten basit bir protokol kullanarak 2D nöronal kültürler gerçekleştirdik (Şekil 1). Önceki protokolde, V-şekilli 96 oyuklu plakalar kullanılırken, bu çalışmada, hücrelerin her bir kuyucuğun merkezinde doğal olarak toplanmasını sağlamak için U-şekilli 96 oyuklu düşük bağlantılı plakalar kullandık. Sağlıklı kontrol iPSC hattı 414C2'yi kullanarak, 30. g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan embriyonik kök hücrelerinden (ESC'ler)/iPSC'lerden indüklenen organoidler, nadir görülen inatçı hastalıklar için umut verici hastalık modellerini temsil ederken, beyin organoidlerinin üretimi tipik olarak birkaç ay süren uzun kültür periyotlarıgerektirir 10 ve kültür ortamını sürekli karıştıran ve uzun vadeli 3D hücre kültürü için stabil koşulları koruyan tasarlanmış bir kap gibi pahalı ekipmanların kullanımını gerektirir. Bu çalışmada, standart hücre kültür...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

414C2 iPSC'ler RIKEN BRC'den alınmıştır. Finansman desteği JSPS KAKENHI (24H00648'den M.F.'ye, 23K08971'den C.S.'ye) ve AMED Translasyonel Araştırma Ağı Programı (25yf0126001j002'den M.F.'ye) tarafından sağlandı. Bu çalışma, Alman Akademik Değişim Servisi'nin (DAAD) FB'ye verdiği bir bursla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm hücre kültürü çanakıCorning353003
6 kuyu plaka ultra düşük bağlantı yüzeyiCorning3471
70 μ M hücre süzgeciCorning352350
AccutaseNacalai Tesque12679-54iPSC'leri ayırmak için kullanılan enzimler
B27 takviyesiThermofischer scientific17504001
B27 takviyesi A vitamini hariçThermofischer scientific12587010
β-merkaptoetanol (2-ME)SigmaM3148Kurumun kurallarına göre at.
Hücre Kültürü 6 iyi çoklu plakaCorning353046
Hücre tasarrufcusu ipucuBMBio ECOBMT-200WGeniş Çaplı Pipett Uç
Hücre kazıyıcılarıSUMITOMO BAKELITECO., LTD.MS-93100
Konfokal mikroskopZeissLSM710
KriyostatLeicaCM3050
Kültür Fare Laminin 1R& D3400-010-02Dissosiyasyon nöronların 2B kültürleri için kaplama plakalarında kullanılır
DMEM/F12FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.042-30795
Floresans Montaj OrtamıDAKOS302380-2montaj ortamı
FOXG1 antikoruabcamAB196868
GlutamaxThermofischer scientific35050061
Keçi Anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 488Thermofischer scientificA32723
Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 555Thermofischer scientificA32732
Heparan Sülfat (HS)SigmaH7640
Yüksek Kapasiteli RNA-cDNA KitiThermofischer scientific4387406RNA'dan cDNA sentezlemek için kullanılır
Hoechst 33258Thermofischer scientificH3569
ImageJSürüm 1.52aorganoidlerin boyutunu ve daireselliğini ölçmek için kullanılır
iMatrix-511 ipekTakara Bio Inc.892021iPSC kültürü için plakalar için kaplama
İnsülinFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.  090-06481
IWP2Tocris Bioscience3533
Keyence BZ-X810KeyenceBZ-X810Şekil 3A için görüntü yakalamak için kullanılmıştır
LSM710Carl Zeiss AGKonfokal mikroskop
LSM980Carl Zeiss AGKonfokal mikroskop
LUNA Universal qPCR Master MixNew England BiolabsM3003
MatrigelCorning354277
N2 takviyesiThermofischer scientific17502001
Nörobazal ortamThermofischer scientific21103049
Nöron Dissosiyasyon Çözümü FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.291-78001
Esansiysel olmayan amino asitler (NEAA)Nacalai Tesque06344-56
Normal Keçi SerumuJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera ile İşlenmiş, U şeklinde-taban mikroplakasıThermofischer scientific174929
paraformaldehit (PFA)Nacalai Tesque09154-85Kurumun kurallarına göre at.
PBSNacalai Tesque14249-24
PBSNacalai Tesque27575-31
Penisillin/streptomisin (PS)Nacalai Tesque26253-84
Poli-L-ornitin (PO)SigmaP3655
Polioksisten(10) Oktilfenil Eter (Triton)FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.168-11805
PRISM GraphPadsürüm 9.5.0
QIAamp DNA Mini Kit  QIAGEN51304toplam DNA çıkarmak için kullanılır
RNeasy Mini KitQIAGEN74104toplam RNA çıkarmak için kullanılır
SB-431542Cayman Chemical13031
Kaydırmalı gözlüklerMATSUNAMICRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02Nfarklılaşmamış iPSC'lerin kültürü için ve Gün 0'dan Gün 6'ya kadar kullanılan ortam
SucroseFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.196-00015
Tissue-Tek O.C.T. BileşimiSakura Finetek Japan Co.,Ltd.4583Kriyokoruma ortamı
TUBB3 antikoruPromegaG712A
Y27632FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.030-24021ROCK inhibitörü
ZENCarl Zeiss AG2.3SP1 (siyah baskı)çekilen görüntüleri analiz etmek için yazılım ve nbsp; konfokal mikroskopla (LSM710)
ZENCarl Zeiss AG2.6 (mavi baskı)çekilen görüntüleri analiz etmek için yazılım ve nbsp; konfokal mikroskopla (LSM980)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
  6. Ohsawa, Y., et al. Taurine supplementation for prevention of stroke-like episodes in MELAS: a multicentre, open-label, 52-week phase III trial. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 90 (5), 529-536 (2019).
  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
  9. Nakamura, M., et al. Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in patient-derived iPSCs. Stem Cell Rep. 13 (4), 684-699 (2019).
  10. Pagliaro, A., Artegiani, B., Hendriks, D. Emerging approaches to enhance human brain organoid physiology. Trends Cell Biol. 35 (6), 483-499 (2025).
  11. Kodaira, M., et al. Impaired respiratory function in MELAS-induced pluripotent stem cells with high heteroplasmy levels. FEBS Open Bio. 5, 219-225 (2015).
  12. Homma, K., et al. Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in the patient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium. Redox Biol. 41, 101921(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MELAS Sendromund klenmi Pluripotent K k H crelerOrganoid Olu turmaSinir A n n Olu umuHeteroplazmi SeviyeleriY ksek Kapasiteli Taramamm nofloresan BoyamaRT qPCR Analizi

İlgili makaleler