Araştırma makalesi

Uzun kodlamayan RNA IRAIN, gliomada IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 ekseni üzerinden immünometabolik yeniden programlamaya yol açar

328 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69711

⸱

12 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Birden fazla kohort arasında entegre makine öğrenimi kullanarak, glioma için sağlam bir IMRG prognostik imzası oluşturduk. IRAIN belirgin şekilde aşağı regülasyondadır, derecelendirme ve hayatta kalma ile ters bağlantılıdır ve IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5 sinyalini baskılar, proliferasyon, göç ve anjiyogenezi engeller. Bulgular, IRAIN ve IMRG'leri biyobelirteç ve terapötik hedefler olarak göstermektedir.

Özet

Glioma, sınırlı tedavi seçenekleri ve kötü prognozu olan agresif bir malignitedir. Gelişimi, metabolik yeniden programlama ve bağışıklık kaçışıyla yakından bağlantılıdır; bu da bu süreçleri entegre eden moleküler düzenleyicilerin belirlenmesi gerekliliğini vurgular. Burada, sağlam bir immünometabolik ilişkili gen (IMRG) prognostik imzası oluşturduk ve uzun kodlamayan RNA IRAIN'in glioma immünometabolizmasını IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 ekseni üzerinden düzenlemedeki rolünü açıkladık. TCGA, CGGA (693/325) ve GEO (GSE43378) kohortlarından alınan transkriptomik ve klinik veriler analiz edildi. Diferansiyel ifade ve ağırlıklı gen ortak ifade ağı analizi (β = 8) ölçeksiz topolojiyi sağladı ve on makine öğrenimi algoritmasını birleştiren bir ara çapraz doğrulama çerçevesi 101 prognostik model üretti. Optimal 17 genli IMRG imzası tüm kohortlarda doğrulandı ve bağımsız olarak genel hayatta kalma tahmini edildi. Fonksiyonel testler, IRAIN aşırı ekspresyonunun IGF1R'yi inhibe ettiğini, JAK2/STAT3 fosforilasyonunu baskıladığını ve BIRC5'i aşağı regülasyonla birlikte apoptozu teşvik ettiğini ve anjiyogenezi azalttığını gösterdi. Düşük IRAIN ekspresyonu, immünosupresif Tregs ve M2 makrofajlarıyla ve tümör-mikroçevre skorlarının yükselmesiyle korelasyon göstererek, bağışıklık kaçıştırıcı bir fenotipi önermektedir. Bu bulgular, IRAIN'i glioma immünometabolik yeniden programlamanın önemli bir düzenleyicisi olarak ortaya koymakta ve IMRG imzasını güvenilir bir prognostik araç olarak doğrulamaktadır; IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 yolunun gliomada bağışıklık ve metabolik düzensizliği birbirine bağlayan mekanik bir köprü olarak ortaya çıktığını ve hassas tedavi için potansiyel hedefler sunduğunu öne çıkarmaktadır.

Giriş

Glioma, merkezi sinir sisteminin en yaygın birincil malignitesini temsil eder ve beyin cerrahisi, radyoterapi ve kemoterapide ilerleme göstermesine rağmen en ölümcül insan kanserlerinden biri olmaya devam etmektedir. Yüksek dereceli gliomalar, özellikle glioblastoma multiforme (GBM), hızlı çoğalma, dağınık infiltrasyon ve kaçınılmaz nüks 1,2 ile karakterizedir. Son zamanlarda, cerrahi müdahaleler, immünoterapi ve kemoterapi gibi etkili bir dizi terapötikyaklaşım ortaya çıkmıştır 3. Ortalama sağlık, maksimum tedaviye rağmen yaklaşık 14-18 ay kalır; bu da yeni terapötik stratejiler ve prognostik biyobelirteçlere olan ihtiyacıvurgular. 4.

Tümör mikro ortamı (TME) ile kanser hücreleri arasındaki etkileşim, gliomaların agresif büyümesini ve moleküler heterojenliğini kritik şekilde tetikler. Mikroglia, nöronal öncü hücreler, damar hücreleri ve adaptif bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere çok sayıda bağışıklık bileşeni, TME 5,6,7'nin şekillenmesinde karmaşık bir şekilde yer almaktadır. Son yıllar, immünoterapide dikkat çekici ilerlemeler yaşandı ve onkolojide dönüştürücü bir dönemin başlangıcına yol açtı. Buna rağmen, bağışıklık kontrol noktası blokajı (ICB) ve diğer immünoterapi yaklaşımlarıglioma 8'de yalnızca sınırlı başarı göstermiştir. Bu bağlamda immünoterapinin başarısızlığı, glioma mikroçevresinin birkaç içsel özelliğinden kaynaklanmaktadır - yani düşük tümör mutasyon yükü, belirgin intratümör heterojenlik, zayıf kan-beyin bariyeri geçirgenliği, ana histokompatibilite kompleks moleküllerinin aşağı regulasyonu ve seyrek T-hücreinfiltrasyonu 9,10,11,12.

Artan kanıtlar, metabolik işlev bozukluğu gösteren tümör mikro ortamının (TME) asidik koşullar, besin eksikliği ve bağışıklık yanıtlarını baskılayan metabolitlerin birikimiyle işaret ettiğini göstermektedir. Bu durum, tümörlere sızan bağışıklık hücrelerinin işlevsizliğine yol açar ve immünoterapininetkinliğini azaltır 13. Aynı zamanda, TME içindeki bağışıklık hücreleri, farklılaşma ve efektör işlevlerini belirleyen bağlama bağlı metabolik değişimler geçirir. Örneğin, aktive T hücreleri hızlı proliferasyon için glikolize ihtiyaç duyarken, düzenleyici T hücreleri (Tregs) ve tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'lar), özellikle M2 alt tipi, immünosupresif aktivitelerini sürdürmek için oksidatif fosforilasyon ve yağlı asit metabolizmasına bağlıdır14,15.

Bu nedenle, bağışıklık ve metabolik imzaların entegrasyonu, gliomaları daha iyi sınıflandırmak ve hasta prognozunu tahmin etmek için mantıklı bir çerçeve sunar. Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), son zamanlarda kromatin mimarisi, gen transkripsiyonu ve transkripsiyon sonrası modifikasyonun çok yönlü düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır. Glioma patogenezinde rol oynamış olup, çoğalma, istila ve bağışıklık modülasyonu16. Bunlar arasında, baskılı antisens transkript IRAIN (IGF1R antisens baskılı protein kodlamayan RNA), insülin benzeri büyüme faktörü 1 reseptörü (IGF1R) genini cis-etkili kromatin etkileşimleri yoluyla düzenlemedeki rolüyle dikkat çekmiştir; bu genin, özellikle meme kanseri, lösemi hücre hatları gibi kanser hücrelerinde cis rekabet kontrolünü azalttığı kanıtlanmıştır. larenks kanseri ve akut miyeloid lösemi ile doğrudan IGF1R 17,18,19'un yukarı regulasyonuna yol açıyor. IGF1R sinyalizasyonu, tümör büyümesi ve bağışıklık düzenlemesi için merkezi olan JAK-STAT ve PI3K-AKTyollarını aktive ettiği için — IRAIN ifadesindeki değişiklikler tümör immünometabolizmasını kritik şekilde etkileyebilir. Ancak, IRAIN'in gliomadaki rolü ve immünometabolik ortam üzerindeki potansiyel etkisi henüz açıklanmamıştır. Bu bilgi boşluğunu gidermek, kodlamayan RNA'ların gliomada metabolik adaptasyon ve bağışıklık kaçamayı nasıl koordine ettiğine dair mekanik bir bakış sunabilir.

Bu çalışmada, gliomada immünometabolik düzenlemeyi incelemek için çoklu kohort transkriptomik verileri deneysel doğrulama ile birleştirdik. TCGA, CGGA (693/325) ve GEO (GSE43378) kohortları arasında entegre makine öğrenimi çerçeveleri kullanılarak, veri setleri arasında hasta hayatta kalmalarını tabakalayabilen sağlam bir 17 genli immünometabolik ilişkili gen (IMRG) prognostik imzası tespit ettik. Daha sonra, IGF1R-JAK-STAT sinyal ekseni ile öngörülen etkileşimi göz önüne alındığında, bu ağın potansiyel bir üst akış düzenleyicisi olarak IRAIN'e odaklandık. Fonksiyonel testler, IRAIN aşırı ekspresyonunun glioma proliferasyonunu ve anjiyogenezi baskıladığını, IGF1R ekspresyonunu ve aşağı akım STAT3 fosforilasyonunu inhibe ederek bunun sonucunda anti-apoptotik protein BIRC5'in (Survivin olarak da bilinir) ekspresyonunun azaldığını ortaya koydu. Bu bulgular bir arada ele alındığında, IRAIN'in gliomda bağışıklık düzenlemesi ile metabolik yeniden programlamayı birbirine bağlayan mekanik bir köprü işlevi gördüğü çalışma modelini destekler. Düzensiz IRAIN ifadesinin bu dengeyi bozarak tümör ilerlemesini teşvik ettiğini, böylece bağışıklık baskısı mikro ortamı oluşturduğunu ve tedaviye direnç sağladığını hipoteziz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan dokularıyla ilgili tüm prosedürler, kurumsal yönergeler ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olup, Fujian Tıp Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı (Onay No. 2021KYB089). Tüm katılımcılardan doku alımından önce yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

Gen ifadesi ve hayatta kalma analizi
RNA dizileme verileri ve ilgili klinik bilgiler birden fazla kamuya açık veri tabanından elde edilmiştir. 1) TCGA kohortu: 175 glioblastoma multiforme (GBM) ve 534 düşük dereceli glioma (LGG) örneği için RNA-seq (FPKM) verileri The Cancer Genome Atlas (https://portal.gdc.cancer.gov/)'dan indirildi; 2) Normal kontroller: UCSC Xena veritabanından 211 normal beyin dokusu ve 662 glioma dokusunun ifade profilleri indirildi (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) Dış doğrulama: CGGA693 ve CGGA325 kohortlarından veriler Çin Glioma Genom Atlası'ndan (http://www.cgga.org.cn) alındı; 4) GEO veri seti: 50 glioma örneği için ifade ve klinik verileri içeren GSE43378 veri seti, Gen İfadesi Omnibus'tan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) indirildi. Tüm ham sayım verileri milyonda transkriptlere (TPM) dönüştürüldü ve log2-dönüşümlü oldu. Zaten normalleştirilmiş veri setleri için, karşılaştırılabilir dağılımlar sağlamak amacıyla ifade matrisleri incelendi. TPM değeri %80'den fazla %80'den fazlasında 1 < genler hariç tutuldu. Eksik klinik bilgiler (yaş, IDH durumu, 1p/19q kodelesiyonu, MGMT metilasyonu) tam vaka filtreleme ile kaldırıldı. Veri setleri arasındaki toplu etkiler, R paketi sva'da uygulanan ComBat algoritması kullanılarak ayarlandı. İfade değerleri, her veri setinde z-skor dönüşümü ile standartlaştırıldı. Sağ kalma analizleri, R paketleri olan hayatta kalma ve survminer kullanılarak gerçekleştirildi. Hastalar, IRAIN'in medyan ekspresyon seviyesine göre yüksek ve düşük ekspresyonlu gruplara ayrıldı. Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri oluşturuldu ve istatistiksel anlamlılık log-rank testi ile değerlendirildi. Tehlike oranları (HR'ler) ve %95 güven aralıkları (CI'ler) Cox orantılı tehlike regresyon modelleri kullanılarak tahmin edilmiştir.

Bağışıklık ve metabolik gen kümelerinin tanımı
Bağışıklık ilişkili genler (IRG, n = 2.483) ImmPort veritabanından (https://www.immport.org/shared/) alındı, metabolik ilgili genler (MRGs, n = 948) ise Moleküler İmza Veritabanı'ndan (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/) alındı. Bu genlerin birleşimi immünometabolik ilişkili genler (IMRG) olarak tanımlandı. Bu gen listeleri, sonraki diferansiyel ifade ve ağ analizleri için referans olarak hizmet etti.

Diferansiyel ifade ve ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi
Normal beyin ve glioma dokuları arasında farklı ekspresyoner genler (DEG) R paketi limma kullanılarak tanımlandı. İfade verileri, doğrusal bir model ve ardından ampirik Bayes moderasyonu ile donatıldı. |log₂ katlama değişimi olan genler| > 1.5 ve yanlış keşf oranı (FDR) < 0.05 anlamlı şekilde farklı olarak ifade edilmişti. Ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi (WGCNA), R paketi WGCNA kullanılarak gerçekleştirildi. Dış örnekler hiyerarşik kümeleme yoluyla dışlandı. Yumuşak eşik gücü, ölçeksiz bir topoloji uyum indeksi (R2 ≥ 0.85) elde etmek için β = 8 olarak ayarlandı ve yeterli ortalama bağlantıyı korudu. Topolojik örtüşme matrisleri (TOM) oluşturuldu ve genler, dinamik ağaç kesim algoritması kullanılarak minimum 50 boyutlu modüllere gruplandı. Modül özgenleri klinik özelliklerle ilişkilendirildi ve glioma ile en güçlü ilişkili modül (Pearson r > 0.7, P < 1×10-10) hub gen tanımlaması için seçildi.

Makine öğrenimi tabanlı prognostik model inşası
Prognostik modeller oluşturmak ve değerlendirmek için on makine öğrenimi algoritmasını entegre eden kapsamlı bir baskı (LOOCV) çerçevesi uygulandı. Toplamda, TCGA kohortu eğitim veri seti olarak kullanılarak 101 kombinatoryal iş akışı uygulandı. Prognozla ilişkili immünometabolik genler (IMRG'ler) ilk olarak tek değişkenli Cox regresyonuyla (P < 0.05) tanımlanmıştır. Optimal model, üç doğrulama veri setinde (CGGA693, CGGA325 ve GSE43378) ortalama Harrell'in uyum indeksinin (C-indeksi) maksimize edilmesiyle belirlendi. Ortaya çıkan RSF-Enet modeli (α = 0.3) en yüksek tahmin performansını gösterdi ve bağımsızkohortlar 22 arasında sağlam genellenebilirliği korudu.

TME ve bağışıklık sızması
İmmünogenomik dünyayı kapsamlı bir şekilde tanımlamak için çok katmanlı bir analitik yaklaşım kullandık. İlk olarak, bağışıklık ve stromal infiltrasyon seviyeleri ESTIMATEalgoritması 23 kullanılarak nicelendirildi. PDCD1, CTLA4 ve LAG3 dahil olmak üzere anahtar bağışıklık kontrol noktası moleküllerinin diferansiyel ekspresyonu limma tabanlı analizle değerlendirildi ve kontrol noktası genleri arasındaki korelasyonlar korelasyon matrisleri kullanılarak görselleştirildi. TCGA kohortunda 903 glioma örneğinden alınan somatik mutasyon profilleri, tümör mutasyon yükü (TMB), mikrosatellit instabilitesi (MSI) ve tümör bağışıklık disfonksiyonu ve dışlanma (TIDE) skorlarını hesaplamak için kullanıldı ve immünoterapiye potansiyel yanıtlar tahmin edildi. Hastalar daha sonra birleşik TMB durumu (yüksek/düşük) ve risk puanları (yüksek/düşük) olarak dört prognostik gruba ayrıldı ve sağlıktaki sonuçlar Kaplan-Meier analiziyle karşılaştırıldı.

Fonksiyonel zenginleştirme analizi
Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirme analizleri R paket kümesi Profiler kullanılarak gerçekleştirildi. Ayarlanmış P değerleri < 0,05 ile zenginleştirme sonuçları istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Aşırı temsil edilen biyolojik süreçler, hücresel bileşenler ve moleküler fonksiyonlar, nokta grafikleri ve çubuk grafikleri kullanılarak görselleştirildi. Protein-protein etkileşimi (PPI) ağları STRING veritabanı (≥ 0.4) kullanılarak oluşturulmuş ve Cytoscape'te görselleştirilmiştir. PPI ağı içindeki fonksiyonel modüller MCODE algoritması kullanılarak tanımlandı. Gen-gen etkileşimi ve ortak ifade ağları GeneMANIA ile daha fazla analiz edildi (https://string-db.org; güven puanı ≥ 0.4) ve Cytoscape'de görselleştirildi. PPI ağı içindeki fonksiyonel modüller MCODE algoritması kullanılarak tanımlandı. GeneMANIA (https://genemania.org) ile gen-gen etkileşimi ve ortak ifade ağları, fiziksel ve genetik etkileşimler, paylaşılan yollar ve ortak ifade kalıpları hakkında bilgileri entegre ederek potansiyel fonksiyonel ilişkiler çıkaran GeneMANIA () kullanılarak daha fazla analiz edilmiştir.

Klinik örnekler
Fujian Tıp Üniversitesi'nin Zhangzhou Bağlı Hastanesi'nde primer glioma rezeksiyonu geçiren hastalardan taze glioma dokuları (n = 6) ve çift bitişik tümör olmayan beyin dokuları (n = 6; tümör kenarından en az 3 cm uzakta bulunan ve histolojik olarak tümörden arınmış olduğu doğrulanmış) toplandı. Hastaların hiçbiri ameliyattan önce kemoterapi veya radyoterapi almamıştı. Tüm patolojik tanılar, 2021 Dünya Sağlık Örgütü (WHO) merkezi sinir sistemi tümörleri sınıflandırmasına göre iki nöropatolog tarafından bağımsız olarak doğrulandı. Cerrahi eksizyondan hemen sonra, doku örnekleri buz gibi fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PBS) ile durulandırılarak kalan kan alındı, sıvı azotta (-196 °C) donduruldu ve -80 °C'de saklanarak RNA çıkarımı yapıldı.

Hücre hatları ve hücre kültürü
İnsan glioblastoma hücre hatları SHG44, U251, A172 ve T98G ile normal insan glial hücreleri (HEB), doğrulamalı depolardan alınmış ve kullanımdan önce mikoplazma kontaminasyonundan arındırılmış olduğu doğrulanmıştır. Hücreler, %10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin ve %1 penisillin-streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco'nun Modified Eagle's Medium (DMEM, yüksek glikoz) içinde nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, %5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde tutuldu. Hücreler %80-90 birleşime ulaştıklarında her 4-5 günde bir geçiş yapıldı. IRAAN aşırı ekspresyona ve kontrol hücre hatlarını oluşturmak için, hücreler tam uzunlukta IRAIN transkripti taşıyan lentiviral vektörlerle veya kontrol olarak boş bir vektörle transdüksiyon yapıldı. Stabil klonlar 14 gün boyunca puromisin (2 μg/mL) kullanılarak seçildi. Aşırı ifade verimliliği, sonraki testlerden önce nicel ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) ile doğrulandı.

3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) hücre proliferasyon testi
Hücreler, 100 μL tam kültür ortamında 1 ×10-4 hücre yoğunluğunda 96 kuyu tabakalarına tohumlanmıştır. Tohumlamadan 24, 48 ve 72 saat sonra, her kuyuya 20 μL MTT çözeltisi (fosfatla tamponlanmış tuzlu salinde 5 mg/mL) eklendi ve 37 °C'de 4 saat kuluçka edildi. Süpernatant çıkarıldı ve formazan kristallerini çözmek için 150 μL dimetil sülfoksit (DMSO) eklendi. Plaka tam çözünürme sağlamak için 10 dakika boyunca hafifçe çalkalandı. Absorbans 490 nm olarak mikroplaka spektrofotometresi kullanılarak ölçüldü. Boş kuyulardan alınan arka plan okumaları çıkarıldı. Hücre canlılığı 24 saat veya kontrol grubuna göre hesaplandı (1.0 olarak ayarlandı). Tüm deneyler altı teknik kopya ve üç bağımsız biyolojik replika ile gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir ve istatistiksel anlamlılık iki kuyruklu t-testi kullanılarak belirlenmiştir.

Apoptoz için akış sitometrisi (Ek V - FITC/PI boyama)
Hücreler %60-70 birleşimde tohumlanarak belirtilen koşullarda 24 saat boyunca tedavi edildi. Yüzen ve yapışkan hücreler, EDTA-sız tripsin kullanılarak toplandı, birleştirildi ve buz gibi PBS ile iki kez yıkandı. Hücre pelletleri, 1 × 106 hücre/mL aralığında Annexin V bağlanma tamponunda (10 mM HEPES pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) yeniden süspansiyona getirildi. Her örnek için, 100 μL süspansiyon, 5 μL Annexin V-FITC ve 5 μL propidium iyodid (PI; 50 μg/mL stok) ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karanlıkta kuluçka altına alındı. 400 μL bağlanma tamponu eklendikten sonra, örnekler buzda tutuldu ve 1 saat içinde akış sitometresinde analiz edildi (488 nm uyarılma; FITC için 530/30 nm ve PI için >585 nm). Uygun tek boyalı ve floresans-eksi bir kontroller telaffuz için dahil edildi. Her örneklem için en az 10.000 olay kaydedildi. Veriler dörtgen kapıştırmalara göre analiz edildi: canlı (Annexin V⁻/PI⁻), erken apoptotik (Annexin V⁺/PI⁻), geç apoptotik (Annexin V⁺/PI⁺) ve nekrotik (Annexin V⁻/PI⁺) popülasyonlar. Erken + geç apoptotik hücrelerin yüzdeleri rapor edildi (ortalama ± SD, n = 3).

Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)
Toplam RNA, üreticinin protokolüne göre asit fenol-guanidinyum reaktifi kullanılarak izole edildi. RNA saflığı spektrofotometri ile doğrulandı (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1), bütünlük ise jel elektroforezi ile doğrulandı (RNA bütünlük numarası ≥ 7). Toplam RNA'nın bir mikrogramı DNase I ile işlendi ve rastgele heksamerler ve oligo(dT) primerleri kullanılarak 20 μL reaksiyonunda ters transkribe edildi. Reaksiyon 25 °C'de 10 dakika, 50 °C'de 30 dakika ve 85 °C'de 5 dakika gerçekleştirildi. Nicel PCR, 5 μL 2× SYBR Green Master Mix, 0,3 μM primer ve 1 μL cDNA (≈ 20 ng RNA eşdeğeri) içeren 10 μL sistemde gerçekleştirildi. Termal döngü koşulları 5 dakika 95 °C, ardından 15 saniye için 95 °C ve 30 saniye 60 °C 40 döngü, ardından 0,3 °C aralıklarla 65 °C'den 95 °C'ye erime eğrisi analizi yapıldı. Tüm reaksiyonlar üçlü olarak, şablonsuz ve eksi-RT kontrolleri ile birlikte gerçekleştirildi. CT değerleri > 35 veya teknik kopya SD > 0.5 hariç tutuldu. Göreli ifade, GAPDH ile iç kontrol olarak 2⁻ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Üç bağımsız biyolojik kopyadan ortalama ± SD değerleri raporlandı ve grup farklılıkları iki kuyruklu bir t-testi kullanılarak analiz edildi.

Western Blot analizi
Hücreler, proteaz ve fosfataz inhibitörleriyle takviye edilmiş RIPA tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, %1 NP-40, %0,5 sodyum deoksikolat, %0,1 SDS) üzerinde lizize edildi. Lizatlar aralıklı girdaplarla 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka yapıldı ve 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjle temizlendi. Protein konsantrasyonları BCA testiyle ölçüldü, 1-2 μg/μL olarak ayarlandı ve 1:3 oranında 4× Laemmli tamponu (son 1× tamponu 100 mM DTT içerir) karıştırıldı. Örnekler 95 °C'de 5 dakika boyunca denatüre edildi. Eşit miktarda protein (50 μg) %100 V'da %12 SDS-PAGE ile 90 dakika çözüldü ve 250 mA'da PVDF membranlarına 90 dakika elektro olarak aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de %5 yağsız süt (%0,1 Tween-20) ile bloklandı (fosfoproteinler için %5 BSA) ve IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 ve β-aktin (tipik seyreltme 1:1000, β-aktin 1:5000) karşısında primer antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi. TBST'de üç 10 dakikalık yıkamadan sonra, zarlar HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikor (1:5000) ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçka altına alındı, tekrar yıkandı ve kemilyünesan substrat kullanılarak geliştirildi. Bant yoğunlukları ImageJ ile nicelendirildi, β-aktin veya toplam protein olarak normalize edildi ve üç bağımsız deneyden ortalama SD ± olarak ifade edildi.

İmmünositokimya
Steril cam kapak örtülerinde yetiştirilen hücreler PBS ile iki kez duruldu ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Üç PBS yıkamasından sonra, hücreler %0,2 Triton X-100 ile 10 dakika permeabilize edildi, %5 sığır serum albümini (BSA) ile 1 saat bloklandı ve gece boyunca 4 °C'de primer anti-CD31 antikoru ile inkubasyon edildi (%1 BSA'da 1:200 seyreltme). Üç PBS yıkamasının ardından, hücreler Alexa Fluor ile konjuge edilmiş ikincil antikor (1:500 seyreltme) ile 1 saat karanlıkta inkübe edildi, DAPI (1 μg/mL, 5 dakika) ile karşı boyandı ve antiifade ortamına monte edildi. Görüntüler, aynı pozlama ve kazanç ayarlarında floresan mikroskobu kullanılarak çekildi. CD31-pozitif alan yüzdesi, ImageJ yazılımı kullanılarak her örneklemde rastgele seçilmiş beş örtüşmeyen alanda nicelendirildi. Bu test, doku kesitleri yerine hücre modellerinde gerçekleştirildi.

İstatistiksel analiz
İstatistiksel analizler, R sürüm 4.3.0 ve ilgili paketleri kullanılarak gerçekleştirildi. Kategorik değişkenleri karşılaştırmak için ki-kare testi kullanıldı, sürekli değişkenler ise Wilcoxon sıra-toplamı testi veya T testi kullanılarak değerlendirildi. Sürekli değişkenlerin değerlendirilmesi Pearson korelasyon katsayısı ile gerçekleştirilmiştir. Hayatta kalma analizleri, Cox orantılı tehlike modellemesi ve Kaplan-Meier eğrilerinin oluşturulmasını içeren hayatta kalma paketi kullanılarak gerçekleştirildi; optimal tabakalaşma eşikleri survminer paketi ve Riskscore = Denklem 1formülü ile belirlendi. CompareC paketi, çeşitli değişkenlerin C-indekslerini değerlendirmek için kullanıldı. İkili kategorik değişkenleri tahmin etmeyi amaçlayan alıcı çalışma karakteristik eğrisi (ROC), pROC paketi kullanılarak oluşturuldu. Ayrıca, hayatta kalma ölçütleri için ROC eğrisinin (AUC) altındaki zamana bağlı alan timeROC paketi kullanılarak analiz edildi. Tüm istatistiksel testler iki taraflı bir yaklaşımla gerçekleştirildi. P < 0.05 anlamlılık seviyesi istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

IRAIN gliomda aşağı regülasyonlu ve olumsuz klinikopatolojik özelliklerle ilişkilidir
Analiz süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. IRAIN ekspresyonu ilk olarak primer astrositlerde, glioma dokularında ve glioma hücre hatlarında qRT-PCR ile değerlendirildi. IRAIN seviyeleri, hem düşük hem yüksek dereceli glioma dokularında ve dört glioma hücre hattının tamamında (SHG44, A172, U251 ve T98G) normal astrositlere kıyasla belirgin şekilde azalmıştır (Şekil 2A

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Glioma, merkezi sinir sisteminin en ölümcül malignitelerinden biri olmaya devam etmektedir; derin intratümör heterojenliği ve geleneksel tedaviye dirençle karakterize edilir. Cerrahi rezeksiyon ile kemoradyoterapi birleşmesine rağmen, nüks ve ölüm oranı yüksek olmaya devam etmekte ve özellikle glioblastoma hastalarının medyan sağlıkları son on yıllarda sınırlı iyileşmegöstermiştir 4,24. Artan kanıtlar, tümör mikro ortamında (TME)...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Genotip-Doku İfadesi (GTEx) projesine ve TCGA, CGGA veritabanlarına katılan tüm katılımcılara ve araştırmacılara mevcut verileri paylaştıkları için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Fujian İl Sağlık Teknolojisi Projesi (2024GG01010154) ve Zhangzhou Hastanesi'nin Doktora İş Istasyonu Tırmanma Projesi (PDA202306) tarafından desteklenmiştir. Fon sağlayıcı araştırmamız için fon sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Annexin V-PI Apoptoz Kiti  Southern Biotechnology, Birmingham, AL, ABDNAApoptozun değerlendirilmesi için kullanılır
AnnexinV-PI Apoptosis KitGüney Biyoteknolojisi10010-02Akış sitometrisiyle apoptoz değerlendirmesi için kullanılır.
Anti-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-Survivin, Anti-β-aktinAbcamab182408, ab108596, ab109085, ab76424, ab8227Sinyal yollarının Western Blot analizinde kullanılan antikorlar.
BiocManagerCRAN1.30.25R&ge'de Biyoiletken paketlerini kurmak ve yönetmek; 3.6.
Bio-Rad Cfx96 SistemiBiyoiletken1.5.1STRING proteinine programatik erişim; Protein etkileşimleri.
CaretCRAN0.4Hayatta kalma modelleri için zamana bağlı ROC/AUC.
Çin Glioma Genom Atlası (CGGA)NACGGA693 ve CGGA325 Model konstrüksi ve doğrulama için kullanılır
ClusterprofilerBiyoiletken2.18.0MAF dosyalarını ayrıştırmak; tümör mutasyon yükü (TMB) ve mutasyon manzarasını hesaplayın.
CorrplotCRAN3.5.0Genel grafik (kutu grafikleri, keman grafikleri, dağınıklık, trend çizgileri).
Sükken TakviyesiCRAN7.3-60adım adım Cox model seçimi için stepAIC.
Data.TableCRANreadr2.1.5Sınırlandırılmış dosyaların hızlı okunması; sağlam UTF-8 tutuşu ile devam ediyor.
DozBiyoiletken3.17.0İnsan gen açıklaması (Entrez, Ensembl, SYMBOL eşlemeleri).
DynamictreecutCRAN1.73Ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi; pickSoftThreshold, TOM, modül algılama.
EdgerBiyoiletken3.56.2Diferansiyel ifade (voom/lineer modeller); Wilcoxon/ampirik Bayes; Volkan/ısı haritası girişleri.
EnrichplotBiyoiletken3.26.2Hastalık Ontolojisi zenginleştirmesi ve GSEA yardımcıları (clusterProfiler ile birlikte kullanılır).
FlashclustCRAN1.63-1WGCNA modül algılama için adaptif dal kesim.
GBMCRAN1.12Hayatta kalma analizi için denetli ana bileşenler.
Gen İfadesi Omnibüsü (GEO)NAGSE43378Model konstrüksi ve doğrulama için kullanılır
GEOqueryBiyoiletkenNAGEO veri setlerini indirin ve ayrıştırın.
Ggplot2CRAN1.0.12İfade imzalarının yayına hazır ısı haritaları.
GlmnetCRAN3.3.1Rastgele hayatta kalma ormanı doğru sansürlenmiş sonuçlar için.
Horseradish Peroksidaz etiketli anti-tavşan ikincil antikorlarıAbcamAB6721Western Blot'ta tespit için ikincil antikorlar.
İnsan glioblastoma hücre hatları (SHG44, U251, A172, T98G)Amerikan Doku Kültürü KoleksiyonuNAGlioma araştırmaları için insan glioblastoma hücre hatları. Hücreler DMEM + %10 FBS, 2 mM L-glutamin içinde kültürlendi.
IgraphCRAN10.0.1MSigDB gen setlerine (örneğin, metabolik MRG'ler) erişim sağlanır; Uygun düzenli çerçeveler.
Image J yazılımı  Media Sibernetik, ABD152Görselleştirme için kullanılanlar
Lentiviral vektör kodlayan lncRNA-IRAINGeneChem, Şanghay, Çin  NAGlioma ve HEB hücrelerinin transfeksiyonu için kullanılan lentiviral vektörler, stabil klonlar oluşturmak için kullanılır.
LimmaBiyoiletken3.48.0Toplu düzeltme (ComBat) ve vekil değişken analizi.
MaftoolsBiyoiletken1.52.0Harrell' s uyum indeksi (C indeksi) ve hayatta kalma karşılaştırma araçları.
AyinCRAN4.1-8Cezalandırılmış Cox modelleri: Lasso, Ridge ve Elastic Net.
MsigdbrCRAN0.0.5Hayatta kalma verileri için vektör makine yöntemlerini destekleyin.
MTTSigma-AldrichM2128Hücre proliferasyon testleri için kullanılır.
Normal glial hücreler (HEB)Amerikan Doku Kültürü KoleksiyonuNAKarşılaştırma çalışmaları için normal insan glial hücre hattı. DMEM + %10 FBS'de kültürlenmiş.
Org.Hs.Eg.DbBiyoiletken4.8.3GO/KEGG zenginleştirme ve GSEA; birden fazla kimlik türünü destekler.
Pheatmap haritasıCRAN2.0.0Veri biliminin dilbilgisi; Dplyr, tidyr, purrr, ggplot2 ile düzenleme ve planlama içerir.
PlsrcoxCRAN1.5Cox modelleri için olasılık temelli artırma.
PVDF ZarlarıMilliporeIPVH00010SDS-PAGE'den sonra protein transferi için kullanılan zarlar.
RandomforestsrcCRAN6.0-94Birleşik yeniden örnekleme (LOOCV dahil), ayar ızgaraları ve model boru hatları.
ReadrCRANNAUCSC Xena'dan matrisler/fenotipler alın (örneğin, TCGA/GTEx hub'ları).
SDS-Page Jeli (%12)Bio-Rad185-5096Nicel PCR için kullanılan sistem.
StringdbBiyoiletken1.20.3Zenginleştirme sonuçları için görselleştirme (nokta grafiki, knetgrafik, ridgegraph).
SuperpcCRAN1.7.7Cox modellerine uyarlanmış kısmi en küçük kare regresyonu.
SurvcompBiyoiletken3.42.4Gerektiğinde normalizasyon ve dağılım tahminini sayar (isteğe bağlı, limma voom'u tamamlayıcı).
Hayatta KalmaCRAN1.01-2WGCNA tarafından kullanılan hızlı hiyerarşik kümeleme (isteğe bağlı).
SurvivalsvmCRAN2.2.2Genelleştirilmiş yükseltilmiş regresyon modelleme (gradyan güçlendirme).
SurvminerCRAN3.8-3Cox orantılı tehlike modelleri; Kaplan– Meier kıvrımlar.
TCGAbiolinksBiyoiletkenT9039TCGA verilerine programatik erişim; İfade ve klinik verileri indirin/hazırlayın.
Kanser Genom Atlası Programı (TCGA)NAhttps://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM ve 534 LGGModel konstrüksi ve doğrulama için kullanılır
TidyverseCRAN1.17.6Büyük matrisler/tablolar için yüksek performanslı veri işlemesi.
TimerocCRAN0.5.0KM görselleştirme ve risk tablosu renderi.
TRIzolInvitrogen15596026Hücrelerden RNA ekstraksiyonu için reaktif.
UCSC XenaNAhttps://xenabrowser.net/datapages/Model konstrüksi ve doğrulama için kullanılır
UcscxenatoolsBio-Rad4561044Western Blot analizinde protein ayrımı için kullanılır.
WGCNACRAN0.95Kontrol noktası genleri ve özellik ilişkileri için korelasyon matrisleri.

Kaynaklar

  1. Goodenberger, M. L., Jenkins, R. B. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 205 (12), 613-621 (2012).
  2. Cordier, D., Krolicki, L., Morgenstern, A., Merlo, A. Targeted radiolabeled compounds in glioma therapy. Semin Nucl Med. 46 (3), 243-249 (2016).
  3. Jiang, T., et al. Clinical practice guidelines for the management of adult diffuse gliomas. Cancer Lett. 499, 60-72 (2021).
  4. Huang, X., et al. Immune-Related Gene SERPINE1 Is a Novel Biomarker for Diffuse Lower-Grade Gliomas via Large-Scale Analysis. Front Oncol. 11, 646060(2021).
  5. Cole, A. P., et al. Microglia in the Brain Tumor Microenvironment. Adv Exp Med Biol. 1273, 197-208 (2020).
  6. Vitale, I., Manic, G., Coussens, L. M., Kroemer, G., Galluzzi, L. Macrophages and metabolism in the tumor microenvironment. Cell Metab. 30 (1), 36-50 (2019).
  7. Cheng, W., et al. Bioinformatic profiling identifies an immune-related risk signature for glioblastoma. Neurology. 86 (24), 2226-2234 (2016).
  8. Rodriguez, S. M. B., et al. Glioblastoma and immune checkpoint inhibitors: a glance at available treatment options and future directions. Int J Mol Sci. 25 (19), (2024).
  9. Arrieta, V. A., et al. Immune checkpoint blockade in glioblastoma: from tumor heterogeneity to personalized treatment. J Clin Invest. 133 (2), (2023).
  10. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  11. Wang, Q., et al. Tumor evolution of glioma-intrinsic gene expression subtypes associates with immunological changes in the microenvironment. Cancer Cell. 32 (1), 42-56.e6 (2017).
  12. Jansen, J. A., Omuro, A., Lucca, L. E. T-cell dysfunction in glioblastoma: a barrier and an opportunity for the development of successful immunotherapies. Curr Opin Neurol. 34 (6), 827-833 (2021).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  14. Dong, X., et al. Tumor metabolism-rewriting nanomedicines for cancer immunotherapy. ACS Cent Sci. 9 (10), 1864-1893 (2023).
  15. Kesarwani, P., Prabhu, A., Kant, S., Chinnaiyan, P. Metabolic remodeling contributes towards an immune-suppressive phenotype in glioblastoma. Cancer Immunol Immunother. 68 (7), 1107-1120 (2019).
  16. Xu, X., et al. LncRNA as potential biomarker and therapeutic target in glioma. Mol Biol Rep. 50 (1), 841-851 (2023).
  17. Sun, J., et al. A novel antisense long noncoding RNA within the IGF1R gene locus is imprinted in hematopoietic malignancies. Nucleic Acids Res. 42 (15), 9588-9601 (2014).
  18. Wang, J. Y., Liu, D., Meng, Y. D., Guo, Y. Y., Zhao, M. Aberrant allelic switch of antisense lncRNA IRAIN may be an early diagnostic marker in laryngeal cancer. Oncol Lett. 20 (4), 65(2020).
  19. Pian, L., et al. Targeting the IGF1R pathway in breast cancer using antisense lncRNA-mediated promoter cis-competition. Mol Ther Nucleic Acids. 12, 105-117 (2018).
  20. Salminen, A., Kaarniranta, K., Kauppinen, A. Insulin/IGF-1 signaling promotes immunosuppression via the STAT3 pathway: impact on the aging process and age-related diseases. Inflamm Res. 70 (10-12), 1043-1061 (2021).
  21. Cortés-Ballinas, L., López-Pérez, T. V., Rocha-Zavaleta, L. STAT3 and the STAT3-regulated inhibitor of apoptosis protein survivin as potential therapeutic targets in colorectal cancer (Review). Biomed Rep. 21 (6), 175(2024).
  22. Liu, Z., et al. Machine learning-based integration develops an immune-derived lncRNA signature for improving outcomes in colorectal cancer. Nat Commun. 13 (1), 816(2022).
  23. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  24. Ostrom, Q. T., et al. The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review. Neuro Oncol. 16 (7), 896-913 (2014).
  25. Weidner, N., Semple, J. P., Welch, W. R., Folkman, J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med. 324 (1), 1-8 (1991).
  26. Perrin, S. L., et al. Glioblastoma heterogeneity and the tumour microenvironment: implications for preclinical research and development of new treatments. Biochem Soc Trans. 47 (2), 625-638 (2019).
  27. Justus, C. R., Sanderlin, E. J., Yang, L. V. Molecular connections between cancer cell metabolism and the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 16 (5), 11055-11086 (2015).
  28. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  29. Bernhard, C., Reita, D., Martin, S., Entz-Werle, N., Dontenwill, M. Glioblastoma metabolism: insights and therapeutic strategies. Int J Mol Sci. 24 (11), 9137(2023).
  30. Kesarwani, P., Kant, S., Prabhu, A., Chinnaiyan, P. The interplay between metabolic remodeling and immune regulation in glioblastoma. Neuro Oncol. 19 (10), 1308-1315 (2017).
  31. Pellegrino, M., et al. Manipulating the tumor immune microenvironment to improve cancer immunotherapy: IGF1R, a promising target. Front Immunol. 15, 1356321(2024).
  32. Zhang, W., et al. Polarization of macrophages in the tumor microenvironment is influenced by EGFR signaling within colon cancer cells. Oncotarget. 7 (46), 75366-75378 (2016).
  33. DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17/regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667.e10 (2020).
  34. Pennati, M., Folini, M., Zaffaroni, N. Targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions. Carcinogenesis. 28 (6), 1133-1139 (2007).
  35. Sah, N. K., Khan, Z., Khan, G. J., Bisen, P. S. Structural, functional and therapeutic biology of survivin. Cancer Lett. 244 (2), 164-171 (2006).
  36. Altieri, D. C. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest. 79, 1327-1333 (1999).
  37. Feng, J., et al. A novel long noncoding RNA IRAIN regulates cell proliferation in non-small cell lung cancer. Int J Clin Exp Pathol. 8 (10), 12268-12275 (2015).
  38. Zhang, H., Zhang, D., Luan, X., Xie, G., Pan, X. Inhibition of the signal transducers and activators of transcription (STAT) 3 signalling pathway by AG490 in laryngeal carcinoma cells. J Int Med Res. 38 (5), 1673-1681 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gliom mm nometabolizmasPrognostik mzaA rl kl Gen Ko EkspresyonuMakine renmesi ModelleriT m r Mikro evresimm n Ka

İlgili makaleler