Method Article

Pankreas Kanseri İçinde Enzim Duyarlı Skualen-Kidamid Nanopartiküllerinin Geliştirilmesi ve Etkinliği

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, folik asitle modifiye edilmiş skualen-kitozan nanopartiküllerinin sentezini ve karakterizasyonunu detaylandırır, enzim yanıtlı ilaç salınımını ve hücresel alımlarını in vitro değerlendirir ve bunları pankreas kanseri tedavisini hedefli bir şekilde geliştirmek için uygular.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, pankreas düktal adenokarsinomunun (PDAC) yoğun ekstrasellüler matrisi (ECM) nedeniyle küçük moleküllü ilaçların sınırlı intratümörsel penetrasyonunu ele almak için bir protokol sunuyoruz. Proilaçlar, ilaç nüfuzunu ve tümör öldürme etkinliğini artırarak bu zorluğu aşmak için büyük potansiyel sunar. Skualen (SQ), kolesterol biyosentezinin doğal öncüsü olan ve mükemmel biyogüvenlik ve biyouyumluluk özelliğine sahip olup, hidrofilik ilaçların membran uyumluluğunu artırabilir ve kemoterapi ajanları veya biyoaktif küçük moleküllerle bağlandığında hücresel alımlarını artırabilir. Bu çalışmada, yeni bir lipofilik SQ tabanlı prodrug sistemi geliştirdik: hidrofilik antikanser ilacı chidamide (CHI), pankreatin ve katepsin B'ye (PDAC mikroçevresinde aşırı ekspreslenen anahtar enzimler) yanıtlı bir bağ aracılığıyla SQ'ya konjuge edildi. Bu konjugasyon, amfifilik bir SQ-CHI prodrugu elde etti ve bu ilaç daha sonra folat (FA) ile modifiye nanopartiküllere (FA-SQ-CHI NP) DÖNÜŞTÜ. Optimize edilmiş NP'ler, 173,3 ± 1,5 nm arasında uniform hidrodinamik çap, 0,181 ± 0,18 polidispersite indeksi (PDI), %59,0 ± %0,77 yüksek ilaç yükleme kapasitesi ve -13,10 ± 0,86 mV stabil Zeta potansiyeli sergilemiştir. In vitro salınım çalışmaları, NP'lerin %0,25 pankreatin varlığında 72 saat içinde %80,2 ± %4,22 kümülatif ilaç salınımına ulaştığını, enzimler olmadan pH ayarlanmış tamponlarda (pH 4,5 veya 7,4) ise sadece %33-%38 salınım gözlemlediğini göstermiştir. Hücresel alım testleri, FA modifikasyonunun hücre içi teslimat verimliliğini önemli ölçüde artırdığını doğruladı; PDAC hücrelerinde (PSN-1 ve CFPAC-1) hedefsiz NP'lere kıyasla 12-24 saat daha yüksek floresans yoğunluğu sağladı. Mevcut protokol, prodürün sentezi ve karakterizasyonu, enzim yanıtlı salınım kinetiklerinin in vitro değerlendirmesi ve terapötik etkinlik ile doku nüfuzunun karşılaştırmalı analizleri için kapsamlı bir metodoloji sunar; nanotaşıyıcının hedefli teslimat, yüksek ilaç yüklemesi ve enzim tetikleyici kontrollü salınım gibi temel avantajlarını vurgular.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas kanal adenokarsinomu (PDAC), sindirim sisteminin son derece kötü huylu bir tümörüdür; görülme oranı neredeyse ölüm oranına eşittir ve 5 yıllık hayatta kalma oranı sadece %8%-9'dur. Karmaşık tümör mikro ortamı (TME), PDAC2'nin ayırt edici özelliğidir. Esas olarak anormal bir ekstrasellüler matriks (ECM), aktif kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler) ve derin bağışıklık baskısı olan bir hücresel ortamdan oluşur. PDAC ECM, tip I kolajen açısından zengindir. Hem değişmiş içeriği hem de anormal yapısı tümör ilerlemesini teşvik eder ve kötüprognoz 3 ile ilişkilidir. CAF'lar en çok bulunan stromal hücrelerdir ve fonksiyonel olarak farklı alt tiplerden oluşur; örneğin, matris üreten myCAF'lar ve fenotipik plastisiteye sahip inflamatuar iCAF'lar4.

İmmünolojik olarak, PDAC TME pro-tümör miyeloid hücreler tarafından domine edilir. Anti-tümör lenfositler nadir veya işlevsiz bir durumdur. Olgun B lenfositleri de immünosupresyonakatkıda bulunur 3,4. Bu bileşenler topluca, birden fazla terapötik engel oluşturur. Yüksek interstisyel sıvı basıncıyla karakterize edilen yoğun stroma, terapötik ajanların derin tümör bölgelerine ulaşmasını ciddi şekilde engelleyen önemli bir penetrasyon bariyeri oluşturur ve böylece kemoterapî ilaçlarının klinik etkinliğini önemli ölçüdesınırlar. Bu nedenle, bu stromal bariyeri aşabilen ve pankreas tümörü dokusuna derinlemesine nüfuz edebilen ilaç dağıtım sistemleri geliştirmek kritik öneme sahiptir.

Son yıllarda, kolesterol biyosentezinin doğal öncüsü olan skualen (SQ), mükemmel biyogüvenlik ve biyouyumluluk özellikleri nedeniyle büyük ilgiçekmiştir 6. Oldukça hidrofobik olan SQ, hidrofilik ilaçlarla konjuge edilerek amfifilik proilaçlar oluşturabilir; böylece hidrofilik küçük moleküllü ilaçların hücre zarlarıyla biyouyumlulukunu artırır ve hücresel alım verimliliğiniartırır 7. Önceki çalışmalar, SQ'nun sisplatin, paklitaksel ve gemsitabin gibi çeşitli kemoterapî ajanlarla kovalent olarak konjuge edilebileceğini, yüksek ilaç yükleme kapasitesine sahip prodrug nanopartikülleri oluşturabildiğini göstermiştir; bu da katı tümörlere ilaç teslimatınıiyileştirir 8,9. Bu özellikler, SQ'nun ilaç dağıtım sistemi geliştirmede geniş uygulama potansiyelini vurgulamaktadır.

Tümör hedeflemesini artırmak için, bu çalışma folik asit (FA) hedefleme ligandı olarak kullanılmıştır. FA, bir karbon metabolizması,biyosentez 10, redoks homeostazı11 ve metilasyonreaksiyonları 12 için kritik öneme sahip suda çözüneýän bir vitamindir. FA'nın karboksil grupları aracılığıyla nanotaşıyıcıya konjugasyonu, folat reseptörüne (FR) spesifik tanıma ve bağlanma sağlar, ardından reseptör aracılıendositoz 13 gelir. Tümör hücrelerinin artırılmış geçirgenliği ve retansiyon etkisinden yararlanarak, Zheng ve ark.14 , Western blotting ve immünohistokimya kullanarak pankreas kanseri, normal pankreas, bitişik dokular ve kronik pankreatitte folat reseptörü α (FRα) ekspresyonunu değerlendirmiş ve bunun klinikopatolojik özelliklerle ilişkisini analiz etmiştir. FRα, pankreas kanseri vakalarının %94,7'sinde (%72/76) metastaz ile ilişkili olarak ekspresyona geçti, ancak normal pankreas dokularında yoktu. FA modifiye edilmiş nanopartiküller, FR-pozitif dokularda seçici olarak birikebilir ve moleküler hedefli tedaviyi mümkün kılar.

Kidamid (CHI), yeni bir histon deasetilaz inhibitörüdür. Preklinik çalışmalar, pankreas ve meme kanseri gibi katı tümörlere karşı güçlü antitümör aktivitesi gösterdiğini ve tümör hücrelerinde ilaç direncini tersine çevirebildiğinigöstermiştir 15,16. Ancak, güçlü hidrofilik, tümör mikroçevresine düşük nüfuz etkinliği ve katı tümör dokularındaki kötü dağılımla ilişkilidir; bu da pankreas kanseri için klinik terapötik potansiyelini ciddi şekildesınırlar. Model ilaç olarak chidamid (CHI) kullanılarak, bu çalışma, CHI'nin SQ ile konjugasyonu ve ardından FA ile modifikasyon yoluyla kendi kendine oluşan nanopartiküllerin hazırlanmasını önermektedir. Bu strateji, CHI'nin pankreas kanserine karşı antitümör etkinliğini, tümör mikro ortamına zayıf nüfuzunu ve katı tümör dokusunda optimal olmayan dağılımını aşarak artırmayı amaçlar. Ayrıca, pankreas kanser hücre hatlarında CHI'nin in vitro etkinliği değerlendirilen, bu yaklaşımın pankreas tümörü mikroçevresinde CHI'nin — temsil eden hidrofilik küçük moleküllü bir ilaç — penetrasyonunu ve sitotoksik etkilerini önemli ölçüde iyileştirmesi beklenmektedir; böylece pankreas kanserinde CHI tabanlı tedaviyi yönlendirmek için deneysel bir temel sağlar.

Çalışmamız, pankreas kanseri tedavisi için CHI-SQ-PEG-FA kendi kendine oluşturulan prodrug nanopartiküllerinin hazırlanmasına yönelik deneysel prosedürleri detaylandırmaktadır. Özellikle, CHI-SQ-PEG-FA nanopartiküllerinin hazırlanma sürecinin optimizasyonu ve karakterizasyonunu ile in vitro ilaç salınım çalışmalarını tanımlıyoruz. Süreç şunları içerir: öncelikle formülasyonun tek faktörlü deneysel bir yaklaşımla optimize edilmesi ve optimal partikül boyutu ile ilaç yükünün belirlenmesi; ikincisi, nanopartiküllerin UPLC ve MTS testleriyle karakterize edilmesi; ve son olarak, in vitro birlikte kültürlenmiş tümör sferoid modeli oluşturuldu. Hedeflenen nanopartiküllerde floresan prob olarak kumarin-6 (C6) kullanarak, nanopartiküllerin üç boyutlu tümör sferoidleri içindeki nüfuzunu ve dağılımını daha da doğruluyoruz ve ilgili verileri elde ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SQ-CHI ve SQ-PEG-FA Sentezi

  1. SQ-CHI sentezi: 1,1',2-triskualenoik asit 120,4 mg (0,3 mmol) ağırlığında alın ve 1 mL N, N-Dimetilformamid (DMF) içinde çözünür. Sıralı olarak NHS (46 mg, 0,4 mmol) ve EDCI (72 mg, 0,38 mmol) eklenir ve reaksiyonun azot koruması altında 90 dakika devam etmesine izin verilir.
  2. Kidamid (58,56 mg, 0,15 mmol) 1 mL DMF'de çözün ve reaksiyon karışımına damla damla ekleyin. Reaksiyonu oda sıcaklığında, azot atmosferinde 72 saat karıştırın.
  3. Tamamlandıktan sonra, ham ürün elde etmek için solvent 5-15 kPa basınçla azaltılmış basınçla buharlaştırılır. Ham ürün, DCM/MeOH'nun gradyan elülasyonu kullanılarak flash sütun kromatografisiyle saflaştırın (99:1, 99:5, 85:5).
  4. SQ-CHI'nin yapısal doğrulaması: Sentezlenen SQ-CHI ürününü cam şişeye yerleştirip 24 saat boyunca kurutucu vakumda kurutma. Ürünü yaklaşık 1 mL deuterated kloroformda (CDCl 3) çözüp bir NMR örnek tüpüne aktarın. Ürünün kimyasal yapısını doğrulamak için 1saat NMR analiziyapın 17.
  5. SQ-PEG-FA SENTEZI: 41,12 mg 1,1',2-tris-norskualenoik asit 35 μL DMF'de çözünür. Bu çözeltiye sıralı olarak N-hidroksisuskinim (NHS, 15,71mg) ve 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDCI, 24,59 mg) eklenin.
  6. Reaksiyonun azot atmosferi altında 90 dakika boyunca devam etmesine izin verin. 20 mg FA-PEG-NH2'yi 35 μL DMF'de çözün ve reaksiyon karışımına damla olarak ekleyin.
  7. Ortaya çıkan karışımı oda sıcaklığında azot altında 72 saat karıştırın. Ham ürün, reaksiyona girmemiş serbest asit almak için 3.200 x g 5.200 x g seviyesinde 3 kDa'lık MWCO ultrafiltrasyon santrifüj tüpü ile saflaştırın. Arıtılmış SQ-PEG-FA kompleks sulu çözeltiyi cam şişeye koyup -50 °C'de önceden dondurun. Dondurulmuş çözeltiyi dondurucu kurutucuda liyofilize ederek SQ-PEG-FA kompleksini liyofilize toz olarak elde edin.

2. SQ-PEG-FA'nın yapısal doğrulaması

  1. Liyofilize SQ-PEG-FA kompleksini 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve 24 saat boyunca bir kurutucuda vakumda kurutulun. Ürünü yaklaşık 1 mL deuterated dimetil sülfoksit (DMSO-d 6) içinde çözüp bir NMR örnek tüpüne aktarın. Kompleksin kimyasal yapısını doğrulamak için 1saat NMR analizi yapın.
  2. SQ-CHI-PEG-FA NP'LERIN HAZıRLANMASı VE KARAKTERIZASYONUNUN OPTIMIZE EDILMESI
  3. 6,64 mg SQ-CHI tartın ve 2 mL mutlak etanolde çözerek 3,32 mg/mL (4,3 μM) stok çözeltisi hazırlanın.
  4. SQ-CHI etanolik stok çözeltisini (1, 0.2, 0.1 veya 0.05 mL) damla olarak 1 mL deiyonize suya karıştırarak ekleyin. 5 dakika karıştırın, ardından düşük basınçlı buharlaştırma ile etanolü çıkarın. Ortaya çıkan karışımı 30 dakika sonikleyerek CHI-SQ nanoparçacık süspansiyonu elde edin. Nanopartiküllerin hidrodinamik çapı ve polidispersite indeksini (PDI) bir Zetasizer ile ölçerek optimal formülasyonubelirleyin 18.
  5. Farklı karıştırma sürelerinden sonra (0, 5, 10 veya 20 dakika) 1 mL deiyonize suya damla damla 0.1 mL SQ-CHI etanolik stok çözeltisi ekleyin. İlgili karıştırma süresinden sonra, basıncı azaltıcı buharlaştırma ile etanol alın, ardından 30 dakika sonikasyon uygulanarak CHI-SQ nanopartikül süspansiyonları elde edilir. Optimum karıştırma süresini belirlemek için hidrodinamik çapı ve PDI'yı ölçün.
  6. 5 dakika karıştırarak 1 mL deiyonize suya damla damla SQ-CHI etanolik stok çözeltisi ekleyin. Karıştırdıktan sonra, basınçla buharlaştırarak etanol alın. Ortaya çıkan karışımı farklı sürelerde (0, 5, 20 veya 30 dakika) sonikleyerek CHI-SQ nanopartikül süspansiyonları elde edin. Optimal sonikasyon süresini belirlemek için hidrodinamik çapı ve PDI'yı ölçün.
  7. Yukarıdaki sonuçlara dayanarak optimal koşulları doğrulayın. Burada, elde edilen su ile stok çözeltisi hacmi oranı = 10:1, karıştırma süresi = 5 dakika ve sonikasyon süresi = 30 dakika. Tüm deneyleri bağımsız olarak üç kez tekrarlayın, böylece güvenilirliği garanti edin.
  8. Tek faktörlü yöntemi kullanarak diğer parametreleri sabit tutun. Nanoparçacıkların parçacık boyutu dağılımı ve Zeta potansiyeli üzerindeki etkilerini değerlendirmek için aşağıdaki faktörleri sıralı olarak değiştirir: bileşenlerin kütle oranı (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0.05, 1:0.5, 1:0.7), faz hacmi oranı (sulu faz: organik faz = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) ve sonikasyon süresi (5, 15, 30, 45 dakika).
  9. Optimize edilmiş protokole göre, SQ-CHI ve SQ-PEG-FA stok çözeltilerini belirlenen oranda karıştırın. Bu karışımı sürekli karıştırarak deiyonize suya damla damla ekleyin. Iyice karıştırmak için 5 dakika karıştırmaya devam edin. Etanolü basınçla azaltıcı buharlaştırma ile çıkarmak, ardından 30 dakika boyunca sonikasyon uygulanarak nihai CHI-SQ-PEG-FA nanoparçacık süspansiyonu elde edilir.
  10. Nanoparçacıkların hidrodinamik çapı, boyut dağılımı (PDI) ve Zeta potansiyelini lazer parçacık boyutu analizörüyle dinamik ışık saçılması kullanarak ölçün. Nanopartiküllerin morfolojisini geçirimli elektron mikroskopisi (TEM, 150.000x büyütme) ve taramalı elektron mikroskopisi (SEM, 80.000x büyütme) ile gözlemleyin.
  11. Ultra Performans Sıvı Kromatografisi (UPLC) ile ilaç yükleme içeriğinin belirlenmesi
  12. Kromatografik koşulları şu şekilde ayarlayın: C18 sütunu (2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm); Hareketli faz: %0,1 formik asit sulu çözeltisi - asetonitril (75:25, v/v); Algılama dalga boyu: 258 nm; akış hızı: 0.2 mL/da; sütun sıcaklığı: 23 °C; enjeksiyon hacmi: 5 μL; Çalışma süresi: 10 dakika.
  13. CHI-SQ-PEG-FA NP süspansiyonunu yeniden yapılandırın ve 7.500 x g ile 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı toplayın ve 0,22 μm mikrogözenekli bir membrandan filtreleyin. Ortaya çıkan filtratı test çözümü olarak kullanın. Test çözeltisini belirtilen kromatografik koşullar altında enjekte edip analiz edin. Filtrattaki ölçülen CHI konsantrasyonuna göre nanopartiküllerin ilaç yükleme içeriğini hesaplayın.

3. In vitro ilaç salınım çalışması

  1. Ya yeni hazırlanmış CHI stok çözeltisi ya da CHI-SQ-PEG-FA nanopartikül süspansiyonundan oluşan 2 mL aliquot'u 3 kDa moleküler ağırlık kesimi olan bir diyaliz torbasına doğru şekilde pipetleyin.
  2. Diyaliz torbasını pankreatin (%0, %0,05%, %0,1%0,25) içeren serbest bırakma ortamına daldırın. Önceden belirlenmiş zaman aralıklarında (0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 saat) salgılama ortamından 1 mL örnek alın ve hemen aşağı salınma koşullarını korumak için eşit hacimde önceden ısıtılmış taze ortamla değiştirin.
  3. UPLC yöntemiyle (bölüm 3'te belirtilen kromatografik koşullar) tüm örneklerdeki CHI konsantrasyonunu belirleyin ve kümülatif ilaç salınımını hesaplayın.
  4. Salgılama ortamı olarak amonyum asetat tamponu (pH 4.5) kullanın. Nanopartikül süspansiyonunun 2 mL'sini diyaliz torbasına (3 kDa) doğru şekilde pipetleyin. Cathepsin B'nin farklı aktivite birimlerini (0, 0.7, 1.4, 2.8 U) doğrudan diyaliz torbasına ekleyin. Torbayı 40 mL serbest bırakma ortamına batırın ve 37 ± 0,5 °C ve 75 rpm'de sabit sıcaklık çalkalayıcıda kuluçka yapın. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında (0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 saat) 1 mL numune çekilir ve sistem dengesini korumak için hemen aynı pH'da eşit hacimde taze, önceden ısıtılmış ortamla değiştirir.
  5. Toplanan örnekleri 0,22 μm mikrogözenekli bir membrandan geçirin. Filtratları UPLC ile analiz ederek ilaç konsantrasyonunu belirleyin. CHI'nin kümülatif salınım yüzdesini hesaplayın ve ilaç salınım profillerini çizin.
  6. CHI stok çözeltisi veya CHI-SQ-PEG-FA NP süspansiyonundan oluşan 2 mL aliquot'u doğru şekilde diyaliz torbasına (3 kDa MWCO) pipetleyin. Diyaliz torbasını pankreatin (%0, %0,05%, %0,1%0,25) içeren serbest bırakma ortamına daldırın. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında (0.1, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 saat) 1 mL örnekler çekilir ve hemen aynı miktarda taze, önceden ısıtılmış salınım ortamı ile değiştirir, böylece batma koşullarını korursun.
  7. Örneklerdeki ilaç konsantrasyonunu UPLC ile nicelikle ölçün. Kümülatif ilaç salınımını hesaplayın ve salınım eğrilerini oluşturun.
  8. PBS'de nanopartikül kararlılığının değerlendirilmesi
  9. CHI-SQ-PEG-FA NP'LERI PBS (PH 7.4) ile 1:20 (v/v) oranında karıştırın. Karışımı 37 ± 0,5 °C ve 100 rpm'de sabit sıcaklıkta çalkalayıcıda kuluçka yapın. Hidrodinamik çapı ve Zeta potansiyelini ölçmek için 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 saat aralığında örnekler alın.
  10. MTS yöntemiyle hücre proliferasyon testi
  11. PSN-1 pankreas kanser hücreleri tam RPMI-1640 ortamında kültürlendi. Logaritmik büyüme evresindeki hücreler, 37 °C'de %0,25 tripsin ile sindirimle hasat edildi ve tam ortamda 4-6 x 104 hücre/mL yoğunlukta yeniden süspansiyona getirildi. Süspansiyon, 100 μL kapasitede 96 kuyu tabaklarına tohumlanmış, tam hücre yapışmasını sağlamak için 37 °C, %5CO2 kuluçka avahiyinde 2 saat önceden kültürlenmiştir.
  12. Orijinal kültür ortamını aspire edin. Bir kontrol grubu (boş kültür ortamı) ve chidamide gruplarının birden fazla konsantrasyon gradyanları (0.2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) kurun, her grup başına üç çoğaltma kuyu ekleyin. Her kuyuya 100 μL boşluk veya ilaç içeren ortam ekleyin, ardından hücre plakasını devam ettirmek için kuluçka makinesine aktarın. Deneysel grupları, değişken konsantrasyonlarda (0.2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) SQ-PEG, serbest CHI, CHI-SQ-PEG NP VEYA CHI-SQ-PEG-FA NP IÇEREN 100 ΜL taze ortam ile tedavi edin; kontrol grubu ise eşit hacimde boş ortam alır. 96 saat daha kuluçkadan sonra, her kuyidan ilaç içeren ortamı çıkarın.
  13. Her kuyuya 20 μL MTS çalışma çözeltisi eklenir ve ardından 4 saat kuluçka yapılır. 96 kuyu plakasını 15 saniye boyunca sallayarak homojenliği garanti edin ve hemen her kuyunun emilimini (A değerini) 490 nm dalga boyunda mikroplaka okuyucu kullanarak ölçün. Hücre çorak oranını, boş grubun OD değerini ilaçla tedavi edilen grubun OD değerinden çıkararak, sonucu boş ortam grubunun OD değeri ile boş grubun OD değeri arasındaki farka bölerek ve ardından 100 ile çarparak hesaplayın.
  14. In vitro birlikte kültürlenmiş tümör sferoid modelinin oluşturulması
  15. Logaritmik büyüme fazındaki PSN-1 hücrelerini HPSC hücreleriyle 2:7 oranında karıştırın ve bunları kuyu başına 5.000 hücre yoğunluğunda ultra düşük tutuşlu 96 kuyu tabakalarına tohumlayın. Tümör sferoid oluşumundan sonra, sferoidleri farklı nano-formülasyonlarla (Coumarin 6 etiketli CHI-SQ-PEG/C6 NP'ler ve CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP'ler) veya DMSO (kontrol olarak) tedavi edin ve ilaç etkinliğini değerlendirmek için 48, 96 ve 144 saat boyunca birlikte inkübe yapın.
  16. İnkubasyon sonrası, her kuyuya eşit hacimde hücre canlılığı testi reaktifi ekleyin. Plakayı yörünge sallayıcısına yerleştirin ve tam lizisi sağlamak için 15 dakika çalkaladım, ardından oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın.
  17. Hücre lizatını siyah bir 96 kuyu plakasına aktarın. Hücre yaşamlılığını ölçmek için çok fonksiyonlu bir mikroplaka okuyucu kullanarak 562 nm dalga boyunda kemilyümüssans sinyalini ölçün.
  18. Nanopartiküllerin hücresel alımının araştırılması
  19. Hedefli nanopartiküller (CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP'ler) ve hedefsiz nanopartiküller (CHI-SQ-PEG/C6 NP'ler) hazırlayın; bunlar kumarin-6 (C6)'yı floresan prob olarak içermektedir. Logaritmik büyüme fazında PSN-1 hücrelerini 24 saat boyunca rutin olarak kültürleyerek tek katman oluşturulur. Kumarin 6'yı etanolde çözerek 200 μg/mL stok çözeltisi hazırlanır. 10 μL çözeltiyi SQ-CHI ve SQ-PEG-FA (veya SQ-PEG) ile 1:0.7 oranında karıştırın, ardından karıştırarak damla olarak deionize suya enjekte edin. 5 dakika karıştırın, etanolü buharlaştırarak çıkarın ve 30 dakika sonikasyon yapın. Son olarak, ultrafiltrasyon (3 kDa, 12.000 rpm, 20 dakika) ile arındırarak eşyaları elde edin.
  20. Hücreleri şu şekilde ele alın: deneysel gruplar serbest C6, CHI-SQ-PEG/C6 NP'ler veya CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP'ler içeren serumsuz ortam alır (nihai CHI konsantrasyonu 5 μmol/L ve C6 konsantrasyonu 2,6 μmol/L), kontrol grubuna ise eşit hacimde boş ortam verilir.
  21. 4 saat, 12 saat ve 24 saat kuluçkadan sonra, ilaç içeren ortamı aspire edin. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)19 kullanılarak hücre çekirdeklerini boyamak.
  22. Floresans mikroskobu altında gözlemler yapın (40x, uyarılma dalga boyu Ex=360 nm, emisyon dalga boyu Em=477 nm). Kumarin-6'nın floresans yoğunluğunu ölçerek nanopartiküllerin hücresel alımını değerlendirin.

4. İstatistiksel analiz

  1. Bu çalışmada sunulan verileri elde etmek için en az 3 tekrarla tüm deneyleri gerçekleştirin. GraphPad Prism Yazılımı kullanarak istatistikleri analiz edin. Deneysel verileri ortalama ± ortalama hatası (SD) olarak sunun ve uygun olduğunda Student's t testi, tek yönlü ANOVA veya Wilcoxon testini kullanarak gruplar arasında karşılaştırın. İstatistiksel anlamlılık eşiğini P < 0.05 olarak belirleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, yeni hedefli nanoilaç dağıtım sistemini başarıyla tasarladı ve sistematik olarak değerlendirdi -- Chidamide Squalenylation Prodrug-Drug Based Self-Assembled Nanopartiküller (CHI-SQ-PEG-FA NPs; Şekil 1). CHI-SQ-PEG-FA NP'LERI SENTEZLEDIK (Şekil 2) ve yağ-su faz oranı (Şekil 3A), karıştırma süresi (Şekil 3B) ve sonikasyon koşulları (Şekil ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, nanopartikül kendi kendine montaj temelli düşük bel sistemini uygulamak için pratik adım adım bir rehber sunmaktadır. Bu çalışmada elde edilen kendi kendine montaj edilen nanopartiküller, düzenli küresel şekil, iyi dağılım, eşit parçacık boyutu, yüksek ilaç yükleme ve kapsülleme verimliliği gösterdi ve tatmin edici birkararlılık gösterdi 21. Nanopartikül nüfuzunu değerlendirmek için 3D tümör sferoid ortak kültür modeli (PSN-1/HPSC) kullanıldı ve folik ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibeleriyle desteklendi (LZ23H290001, LY19H280001); Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (82474338 ve 82274364); Zhejiang Eyaleti Üç Kırsal Alan ve Dokuz Parti Tarımsal Bilim ve Teknoloji İşbirliği Programı (2025SNJF075); ayrıca Huzhou Bilim ve Teknoloji Büyükhanesi'nin Kamu Refahı Araştırma Projesi (2021GZ261); ayrıca Zhejiang Eyalet Eğitim Departmanı'nın Genel Bilimsel Araştırma Projesi (Y202456442, 2025YKJ10) kapsamında yer aldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% tripsin-EDTAGibco (ABD)25200072
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidroklorür (EDCI)Sigma-Aldrich (ABD)E6383
2 mL kriyojenik şişelerCorning (ABD)430488
96 delikli hücre kültür plakalarıCorning (ABD)3598
mutlak etanolÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)100092680
asetonÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)32201-2.5L
asetonitrilTedia (ABD)A998-4HPLC derecesi
Amonyum asetatÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)10002861
susuz sodyum sülfatSigma-Aldrich (ABD)31481
Biyolojik Güvenlik DolabıThermo Fisher Scientific, ABD1380, 1332, 1356
Hücre kültürü şişeleriCorning (ABD)CLS430372
Hücre kültürü kuluçka makinesiThermo Fisher Scientific, ABDHERA51901126
chidamide (CHI)Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (Çin)saflık >%95
Cytation 5 çok modlu mikroplaka okuyucuBioTek, ABDCYT5MV
DF-101S termostatik manyetik ısıtma karıştırıcıZhengzhou Kechuang Enstrüman Co., Ltd., Çin
diklorometanÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)80047318
dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich (ABD)D2650
dioksanAladdin (Çin)D116156-5ml
DMEM ortamıGibco (ABD)12100046
Dulbecco'nun fosfatla tamponlanmış tuzlu suyu (DPBS)Gibco (ABD)14040141
Etil AsetatÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)10009460
etil eterÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)
FA2004B elektronik bakiyeŞanghay Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., ÇinFA2004B
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco (ABD)10099141C
folat-poli(etilen glikol)-amin (FA-PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biyolojik Teknoloji A., Ltd. (Çin)PS2-NFA-2000
Formik asitAladdin (Çin)F112034HPLC derecesi
Dondurucu kurutucuThermo Fisher Scientific, ABD
insan katepsini BSigma-Aldrich (ABD)SRP0289
İnsan pankreas kanseri hücre hatları (PSN-1, CFPAC-1)Amerikan Tip Kültürü Koleksiyonu (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
insan pankreas yıldız hücreleri (HPaStec, HPSC)Amerikan Tip Kültürü Koleksiyonu (ATCC)
İnsan tripsiniSigma-Aldrich (ABD)
Hidroklorik asitÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)CFSR-10011008
ters mikroskopOlimpos, JaponyaIX83
Iscove'un Modifiye Dulbecco Ortamı (IMDM)Gibco (ABD)12440053
IX 1000 vortex mikseri Hangzhou Ruicheng Enstrüman Şirketi, Ltd., ÇinIX 1000
MetanolÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)M433287-10L
metanol Tedia (ABD)MS1922-001HPLC derecesi
Mikrosantrifüj tüpleri (1.5/2.0 mL)Axygen (ABD)MCT-150-C
mikropipetler (20, 100 ve 1000 μ L)Thermo Fisher Scientific, ABD4642050, 4642070, 4642090
Mill-Q su arıtma sistemi Millipore, ABDZR0Q00800
  MTS test kiti (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfofenil)-2H-tetrazolyum)Promega (ABD)G3582
N,N-Dimetilformamid (DMF)Aladdin (Çin)
N-bromosuccinimide (NBS)Sigma-Aldrich (ABD)B81255
N-Hidroksisüksinimid (NHS)Sigma-Aldrich (ABD)56480
Optima Max ultrasantrifüj Beckman, ABD393490
Penisillin/streptomisin çözeltisiGibco (ABD)15140-122
periyodik asitSigma-Aldrich (ABD)P7875
Petrol eteriÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)
Fenazin metosülfat (PMS)Sigma-Aldrich (ABD)3180806
fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)Gibco (ABD)70011069
Poli(etilen glikol)-amin (PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biyolojik Teknoloji A., Ltd. (Çin)PG2--20k
RPMI-1640 ortaGibco (ABD)31800022
Silika jel tozuSigma-Aldrich (ABD)53698300 mesh
Sodyum bikarbonatSigma-Aldrich (ABD)401676
Sodyum klorürÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)10019318
Sodyum dikromat dihidratSigma-Aldrich (ABD)1.93689
SkualenSigma-Aldrich (ABD)Y0002131
steril santrifüj tüpleri (15 ve 50 mL)Corning (ABD)430791, 430828
Sülfürik asitÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)10021618
TetrahidrofuranÇin Ulusal İlaç Grubu Şirketi (Sinopharm)34865-4X4Lanalitik derecelendirme
ultrafiltrasyon santrifüj tüpleri (moleküler ağırlık kesme noktası: 3.5 kDa)Beckman, ABD344088

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., et al. Role of the microbiome in occurrence, development and treatment of pancreatic cancer. Mol Cancer. 18, 173(2019).
  2. Chen, K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic change in tumor microenvironment during pancreatic ductal adenocarcinoma malignant progression. EBioMedicine. 66, 103315(2021).
  3. Mascharak, S., et al. Desmoplastic stromal signatures predict patient outcomes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep Med. 4 (11), 101248(2023).
  4. Fu, Y., et al. Unbiasedly decoding the tumor microenvironment with single-cell multiomics analysis in pancreatic cancer. Mol Cancer. 23 (1), 140(2024).
  5. Helms, E., Onate, M. K., Sherman, M. H. Fibroblast heterogeneity in the pancreatic tumor microenvironment. Cancer Discov. 10, 648-656 (2020).
  6. Navarro Chica, C. E., et al. Design and characterization of squalene-Gusperimus nanoparticles for modulation of innate immunity. Int J Pharm. 590, 119893(2020).
  7. Rodríguez-Nogales, C., et al. Squalenoylgemcitabine/edelfosine nanoassemblies: anticancer activity in pediatric cancer cells and pharmacokinetic profile in mice. Int J Pharm. 582, 119345(2020).
  8. Emamzadeh, M., et al. Dual controlled delivery of squalenoyl-gemcitabine and paclitaxel using thermo-responsive polymeric micelles for pancreatic cancer. J Mater Chem B. 6, 2230-2239 (2018).
  9. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabinelipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. Chemplus chem. 85, 1283-1291 (2020).
  10. Yang, H., et al. High-level 5-methyltetrahydrofolate bioproduction in bacillus subtilis by combining modular engineering and transcriptomics-guided global metabolic regulation. J Agric Food Chem. 70 (19), 5849-5859 (2022).
  11. De Santis, M. C., et al. Signaling pathways regulating redox balance in cancer metabolism. Front Oncol. 8, 126(2018).
  12. Rushing, B. R., et al. Exploratory metabolomics underscores the folate enzyme ALDH1L1 as a regulator of glycine and methylation reactions. Molecules. 27 (23), 8394(2022).
  13. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  14. Zheng, H. Expression and significance of molecular imaging marker folate receptor α in pancreatic cancer. J Shandong Uni Health Sci. 48 (3), 83-85 (2010).
  15. Zhang, N., et al. Chidamide combined with paclitaxel effectively reverses the expression of histone deacetylase in lung cancer. Anticancer Drugs. 31, 702-708 (2020).
  16. He, M., et al. Chidamide Inhibits Aerobic Metabolism to Induce Pancreatic Cancer Cell Growth Arrest by Promoting Mcl-1 Degradation. PLoS ONE. 11 (11), e0166896(2017).
  17. Chen, Q. B., et al. Extraction and Structural Characterization of Squalene from Siraitia grosvenorii Seeds. Guangxi Zhiwu. 26 (6), 687-689 (2006).
  18. Xu, M. Y., et al. Application Study of Nano Laser Particle Size Analyzer in Silica Sol Particle Size Testing. Diamond Abrasives Eng. 35 (02), 55-58 (2015).
  19. Shen, Z., et al. Study on the binding characteristics of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA. Acta Biophysica Sinica. (03), 352-356 (1991).
  20. Mahajan, R. R., et al. Oral Administration of Neratinib Maleate-Loaded Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles: Optimization, Physical Characterization, and In Vivo Evaluation. Pharmaceutics. 17 (2), 221(2025).
  21. Ouyang, P., Lu, Y. Research progress on dispersion stability of nanoparticles in lubricating oil. Appl Chem Ind. 51 (6), 1843-1847 (2022).
  22. Xiao, S., et al. Development and application of folic acid-conjugated starch nanoparticles as a tumor-targeting drug delivery carrier. Chin Sci Bull. 51 (10), 1151-1155 (2006).
  23. Song, Y., Shi, W., Chen, W. Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells. J Mater Chem. 22 (25), 12568-12573 (2012).
  24. Tie, Y., et al. Targeting folate receptor β positive tumor-associated macrophages in lung cancer with a folate-modified liposomal complex. Signal Transduct Target Ther. 5, 6(2020).
  25. Li, C., et al. Small molecule nanodrug assembled of dual-anticancer drug conjugate for synergetic cancer metastasis therapy. Bioconjug Chem. 29, 3495-3502 (2018).
  26. Dormont, F., et al. Squalene-based multidrug nanoparticles for improved mitigation of uncontrolled inflammation in rodents. Sci Adv. 6, eaaz5466(2020).
  27. Jiang, W., et al. Intravenous delivery of enzalutamide based on high drug loading multifunctional graphene oxide nanoparticles for castration-resistant prostate cancer therapy. J Nanobiotechnol. 18, 50(2020).
  28. Yong, T. Y. Exocytosis of porous silicon nanoparticles and their application in deep tumor penetration and cancer stem cell therapy. [Doctoral dissertation]. , Huazhong Univ Sci Technol. (2017).
  29. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabine lipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. ChemPlusChem. 85, 1283-1291 (2020).
  30. Zhang, W., et al. Prodrug-like acetylmannosamine modified liposomes loaded with arsenic trioxide for the treatment of orthotopic glioma in mice. J Pharm Sci. 109, 2861-2873 (2020).
  31. Fan, X. X., et al. ROS-responsive berberine polymeric micelles effectively suppressed the inflammation of rheumatoid arthritis by targeting mitochondria. Nano-Micro Lett. 12, 76(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzyme Responsive NanoparticlesSqualene Chidamide ProdrugPancreatic CancerExtracellular MatrixDrug PenetrationFolate Modified NanoparticlesControlled Drug ReleaseCellular UptakeTumor TargetingProdrug Synthesis

Related Articles