Yöntem makalesi

Çok Tür Antikorlar İçin Uyumlu Ekonomik ve Evrensel Telafi Boncuklarının Hazırlanması

DOI:

10.3791/70114

⸱

17 Nisan 2026

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 2Center for gene and immunotherapy, The Second Qilu Hospital of Shandong University, 3Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 4Department of Urology, The second hospital of Tianjin Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, rekombinant Protein A/G/L ile bağlı polistirol mikrosferleri kullanarak akış sitometrisinde floresan telafisi için çok türle uyumlu telafi boncukları hazırlamak için maliyet etkin bir yöntem tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, çok renkli akış sitometrisinde floresan telafisi için çok türle uyumlu telafi boncuklarının hazırlanmasında maliyet etkin ve tekrarlanabilir bir yöntem tanımlar. Burada, birden fazla immünoglobulin bağlayıcı domaini içeren immünoglobulin bağlayıcı protein A/G/L (Protein A/G/L) rekombinant Escherichia coli (E. coli) içinde eksprese edildi, nikel affinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve EDC/NHS kimyası yoluyla karboksilelenmiş polistiren mikrosferlere kovalent olarak bağlandı. Ortaya çıkan boncuklar, çeşitli türlerden ve alt sınıflardan antikorları bağlayarak, telafi kurulumu için uygun güçlü ve belirgin floresan sinyalleri üretir. Bu sonuçlar, farklı tazminat gereksinimlerine uygun floresans yoğunluklarına ulaşmak için boncuk çapı ve protein yükü seçiminde pratik rehberlik sağlar. Protokolün başarılı uygulanması, akış sitometrisi analizinde kontrol boncuklarına kıyasla verimli protein arıtımı ve yüksek yoğunluklu konjuge boncukların net, yüksek yoğunluklu floresans zirvesi ile gösterilir. Bu basit ve ölçeklenebilir yaklaşım, standart laboratuvarlarda stabil ve çok yönlü tazminat boncuklarının rutin hazırlanmasını sağlar, maliyeti azaltırken akış sitometrisi uygulamaları için esnekliği artırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış sitometrisi, immünoloji, hücre biyolojisi ve hücre popülasyonlarının çok parametrik analizi için klinik araştırmalarda vazgeçilmez bir araçhaline gelmiştir 1,2,3. Geleneksel çok renkli akış sitometrisindeki kritik bir zorluk, florokromun emisyon spektrumunun birden fazla dedektör kanalına bakıştığı ve sinyal kirlemesine ve yanlış yorumlanmaya yol açtığı flororesansyayılmasıdır 4,5. Bu nedenle, doğru veri yorumu için doğru ücretlendirme gereklidir.

Geleneksel olarak, telafi kontrolleri tek renkli boyalı hücreler kullanılarak hazırlanır. Ancak, sınırlı hücre sayıları, değişken antijen ekspresyonu ve antikorların hücrelere farklı bağlanması zorluklaryaratır 6. Sonuç olarak, florokrom ile konjuge edilmiş antikorlara bağlanacak şekilde modifiye edilen sentetik boncuklar pratik bir alternatifolarak ortaya çıkmıştır 7,8. Boncuklar, tutarlı bağlanma kapasitesi, yüksek floresans yoğunluğu ve hücresel antijen ekspresyonseviyelerinden bağımsızlık 9. avantajları sunar. Tek tür veya Fc kısıtlı yakalama reaktifleriyle karşılaştırıldığında, birden fazla immünoglobulin bağlayan domainin (Protein A, G ve L) dahil edilmesi, tür kapsamını ve antikor formatı uyumluluğunu genişleterek tek bir boncuk hazırlamanın çeşitli florokrom konjuge antikorları barındırmasını sağlar.

Telafi için kullanılan boncuklar arasında, Protein A, Protein G ve Protein L gibi immünoglobulin bağlayan proteinlerin birleşmesi, farklı türlerden antikor izotipleriyle geniş bir uyumluluk sağlar. Protein A ve G, birçok IgG alt sınıfının Fc bölgesine bağlanırken, Protein L κ hafif immünoglobulin zincirlerine bağlanır ve böylece Fab-fragmentlerine ve tek zincirliantikorlara bağlanma kapasitesini genişletir 10,11.

Ticari tazminat boncukları mevcut olsa da, nispeten yüksek maliyetleri sınırlı bütçeli laboratuvarlar için aşırı olabilir ve bu da yaygın uygulamalarınıkısıtlar. Bu zorluklar göz önüne alındığında, araştırmacıların boncuk boyutunu, antikor bağlama alanını ve telaffize kontrollerinde kullanılan antikor tiplerini tanımlamasına olanak tanıyan esnek ve özelleştirilebilir boncuk platformlarına ihtiyaç vardır. Bu protokolün amacı, çok renkli akış sitometrisi için çok türle uyumlu telafi boncukları hazırlamak için basit, ekonomik ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlamaktır. Bu protokol, A, G ve L proteinlerinden birden fazla immünoglobulin bağlayıcı domaini içeren rekombinant füzyon proteininin tasarımını, ekspresyonunu ve saflaştırılmasını, ardından tanımlanmış çaplarda karboksil modifiye polistiren boncuklarına kovalent konjugasyonunu açıklar.

Protokol, füzyon proteininin moleküler tasarımını, E. coli'de ekspresyonunu ve saflaştırılmasını ve çoklu florokrom konjuge antikorlarla uyumlu boncuk bazlı telafi reaktiflerinin hazırlanmasını özetlemektedir. Bu protokol, özellikle maliyet azaltımı, türler arası uyumluluk ve esnek tazminat kontrollerinin gerektirdiği çeşitli araştırma ortamlarında çok renkli akış sitometrisi yapan laboratuvarlar için tasarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm tamponları ve reaktifleri Tablo 1'de listelendiği gibi taze hazırlayın. Kullanımdan hemen önce EDC ve NHS çözümleri hazırlayın; Saklama. Diğer tüm tamponlar için (Lysis, Binding, Washing, Elution, MES, PBS, Tris) önceden stok çözeltileri hazırlanın ve 4 °C'de saklanın. Depolanmış tamponları kullanımdan önce uygun reaksiyon sıcaklığına (oda sıcaklığı veya 4 °C) dengeleyin. FACS tamponu ve depolama tamponunun taze hazırlandığından veya 4 °C'de saklandığından emin olun.

1. Rekombinant protein A/G/L'nin ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Rekombinant protein A/G/L'nin ekspresyonu
    1. pET28-Protein A/G/L plazmidini standart bir ısı şoku protokolü kullanarak E. coli BL21(DE3) yetkin hücrelere dönüştürün.
    2. Dönüştürülmüş hücreleri 50 μg·mL-1 kanamisin içeren LB agar üzerine levha yapın ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
    3. Tek bir kolonini kanamisin (50 μg·mL-1) içeren 5–10 mL LB suyu ile aşılayın ve gece boyunca 37 °C'de 200 × g'de sallanarak kültürlenin.
    4. Gece kültürünü, kanamisin içeren 200 mL LB'ye (son konsantrasyon 50 μg·mL-1) 1:100 seyreltme ile aktarın.
    5. Kültürü 37 °C'de yetiştirerek optik yoğunluk 600 nM (OD600) 0.6–0.8'e ulaşana kadar artırılır.
    6. Protein ekspresyonunu indüke etmek için İzopropil β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) nihai konsantrasyona 0,5 mM ve 28 °C'de 12–16 saat kuluçka yapın.
    7. Hücreleri 4 °C, 4000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjle hasat edin.
    8. Süpernatantı atın ve hücre pelletini lizis tamponuna yeniden süzültün. Hemen devam edin veya peletleri -80 °C'de saklasın.
      Duraklama noktası: Hücre pelletleri lizisden önce birkaç hafta boyunca -80 °C'de saklanabilir.
  2. Hücre Lizisi
    1. Bakteriyel pelleti, ıslak hücre kütlesi başına 10 mL lizin tamponunda yeniden askıya alın.
    2. Hücreler, 1000 bar'a ayarlanmış yüksek basınçlı homojenizatör ile lizle, süspansiyonu 2–3 döngü boyunca geçirerek çözeltiyi daha az viskoz ve saydam hale getirin.
      Not: Alternatif olarak, hücre bozulması, 8–12 döngü boyunca darbe modu (5 s ON / 10s KAPALı) kullanılarak buz üzerinde sonikasyon yoluyla gerçekleştirilebilir ve aşırı ısınmayı önleyebilir. Mikroskop altında küçük bir aliquot inceleyerek tam lizisi garanti edin.
    3. Lizat 12000 × g sıcaklığında 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Süpernatantı çözünür protein fraksiyonu olarak toplayarak arındırın.
  3. Ni-NTA affinite arındırması
    1. Kolon dengelenmesi ve örnek yüklemesi
      1. Ni-NTA kolonununu, 10 mM imidazol içeren 10 sütun hacmi (CV) bağlanma tamponu ile dengelendirin.
      2. Arıtılmış lizat 0,45 μM filtreyle filtreleyin, imidazol eklenerek 10 mM'lik nihai konsantrasyona eklenin ve 0,5 CV·min-1 ile kolona yüklenin.
      3. Bağlantı verimliliğini izlemek için akış kesirini toplayın.
    2. Yıkama
      1. Kolon, 10 CV bağlayıcı tampon ve 20 mM imidazol içeren yıkama tamponu ile 1 CV·min-1 akış hızında yıkayın.
    3. Elution
      1. Hedef proteini 1 CV·min-1 akış hızında elution tamponu ile elüasyonla geçirin.
      2. Fraksiyonları toplayın ve protein içeren fraksiyonları belirlemek için A280'i izleyin.
    4. Tampon Değişimi ve Protein Depolama
      1. Arıtılmış protein çözeltisini 50 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüj ultrafiltrasyon tüpüne aktarın.
      2. Santrifüj 3.500 × g boyunca 4 °C'de 15–20 dakika boyunca istenen konsantrasyona ulaşana kadar kullanılır.
      3. Akışı atın ve buffer değişimi için retentata eşit hacimde PBS tamponu (pH 7.4) ekleyin.
      4. Santrifüj ve PBS değişimini 2–3 kez tekrarlayarak orijinal tamponu tamamen PBS ile değiştirin.
      5. Son konsantrasyon adımından sonra retentatı topla ve protein konsantrasyonunu ölçün.
      6. Elut edilen kesirleri SDS-PAGE ile doğrulayın; Protein A/G/L'nin beklenen moleküler ağırlığı yaklaşık 90 kDa'dır.
      7. Saflaştırılmış proteini Aliquot ile -80 °C'de saklayıp daha fazla kullanıma kadar saklayın.
        NOT: Protokol bu adımda duraklatılabilir. Arındırılmış Protein A/G/L, daha sonra boncuk konjugasyonu için -80 °C'de depolanabilir. Konsantrasyon sonrası, 200 mL bakteriyel kültürden yaklaşık 10 mg saflaştırılmış Protein A/G/L alındı ve nihai konsantrasyon 2–5 mg·mL⁻1 oldu.

2. Boncukları Protein A/G/L olarak konjuge edin

  1. Boncuk ön yıkama
    1. Girdap boncuk stoku oda sıcaklığında (20–25 °C) maksimum hızda 20–30 saniye boyunca eşit şekilde yeniden süzülür. 0,2 mL 8 μM boncuk (5 mg) 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. Pellet boncukları santrifüjle yapıldı, 5000 × g oda sıcaklığında 3 dakika boyunca.
    3. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve pelleti rahatsız etmeden atın.
    4. 1 mL 0.1 M MES tamponu ekleyin, pipetleme veya nazik vorteksle nazikçe tekrar süsleyin, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 5000 × g tekrar santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın (toplamda iki MES yıkama).
  2. EDC/NHS ile Aktivasyon
    DIKKAT: EDC ve NHS tahriş edicilerdir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla duman davlumanında ele alınmalıdır.
    1. 0.5 mL MES tamponunda boncukları yeniden süskü, ardından sırayla 50 μL 50 mg·mL-1 NHS ve 100 μL 50 mg·mL-1 EDC ekleyin.
      Not: EDC ve NHS çözümleri kullanımdan hemen önce taze hazırlanmalıdır.
    2. Vortex boncukları ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca döner bir sallayıcıda kuluçka geçirin ve aktive olun.
  3. Aktivasyon reaktiflerini çıkarın ve yıkayın
    1. Pellet boncuklar: 5000 × g, 3 dakika, oda sıcaklığında. Dikkatlice üst yüzeyi çıkarın.
    2. 1 mL PBS tamponu ekleyin, nazikçe yeniden süzülür, santrifüj (5000 × g, 3 dakika, oda sıcaklığında) ve süpernatantı çıkarın. Aktivasyon reaktiflerini çıkarmak için bir PBS yıkaması yapın.
  4. Protein Bağlanması
    1. Aktive boncuk pelletini 0,4–0,5 mL PBS (nihai reaksiyon hacmi hedefi 0,5–0,6 mL) ile yeniden askıya alın. Etkili protein konsantrasyonunu artırmak için hacmi düşük tutun.
    2. 100 μg Protein A/G/L ekleyin. Nazikçe karıştırın.
    3. Reaksiyonu hızlı bağlanma için oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Boncukların yerleşmesini önlemek için nazikçe yuvarlamaya devam edin.
  5. Söndürme/sonlandırma reaksiyonu
    1. Pellet boncukları (5000 × g, 3 dakika) ve üst kısmı çıkar.
    2. Kalan NHS esterlerini soğutmak için 1 mL 0.1 M Tris (pH = 7.4) ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca rulo çalkalayıcıda tekrar askıyıp kuluçka yapın.
    3. Pellet boncukları ile aynı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde 1 mL PBS ile yıkayın. Tekrar santrifüj yapın (5000 × g, 3 dakika) ve süpernatantı atın. Sonra, 0.5 mL depolama tamponu ile boncukları yeniden askıya alın.
      Duraklama noktası: Protokol bu adımda duraklatılabilir. Yeniden askıya alınmış boncuklar 4 °C'de saklanabilir.
  6. Karıştır ve sakla
    1. Çekimli boncuklar ve konjuge olmayan boncuklar sayılır. Yeni 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde konjuge ve konjuge olmayan boncukları %25–%75 oranında karıştırın.
    2. Boncuk karışımını 1 mL depolama tamponu içinde askıya alın (PBS, %1 BSA ve %0,05 antimikrobiyal koruyucu içerir).
    3. Süspansiyonu etiketli bir tüpe aktarın ve 4 °C'de saklayın. Işık koruması zorunlu değildir. Kullanımdan önce yumruk dağılımı için nazikçe tekrar askıya alın. Bu koşullar altında boncuklar en az 6 ay stabil kalır.

3. Temsilci QC

  1. 10 μL konjuge boncukları 100 μL floresan antikor ile 100 μL FACS tamponunda oda sıcaklığında 15–30 dakika kuluçka edin.
    NOT: Her tüpte yalnızca bir floresan antikor bulunmalıdır.
  2. Boncukları 1 mL PBS ile yıkayıp 300–500 μL PBS ile tekrar askıya alın ve akış sitometresi üzerinde çalıştırın.
  3. Algılama kanalını, antikora konjuge edilmiş florofora göre ayarlayın (örneğin, FITC ile konjuge edilmiş antikorlar için FITC dedektörüyle 488 nM lazer). 0–200 V arasında temsil eden fotoçarpan tüp (PMT) gerilim aralığı başlangıç noktası olarak kullanılabilir ve enstrüman performansına göre ayarlanabilir. Her örnek başına en az 10.000 olay toplayın.
  4. FSC/SSC tarafından boncuklara kapı. Pozitif boncuklar, florofor kanalında yüksek MFI ile açık tek bir zirve göstermelidir; Negatif kontrol sadece arka planı göstermelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant füzyon Protein A/G/L, hesaplanan moleküler ağırlığı 90,5 kDa olan 816 amino asidden oluşur (Ek Dosya 1). Bu füzyon proteini, Protein A'dan beş IgG-bağlayıcı B domainini, Protein G'den iki IgG bağlayıcı domaini ve Protein L'den beş κ hafif zincir bağlayan B domainini korurken, albümin bağlanma domeni çıkarılmıştır (Şekil 1A, Takviye Tablo 1). Kovalent bağlanmayı kolaylaştırmak için C-terminaline bir sistein kalınt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, rekombinant Protein A/G/L temelli floresan telafi boncuklarının hazırlanması için pratik ve verimli bir iş akışını tanımlar. Prosedür, bakteriyel ekspresyonu (Ni-NTA affinity arındırması) ve EDC/NHS kimyası kullanılarak saflaştırılmış proteinin karboksil modifiye polistiren mikrosferlere kovalent bağlanmasını içerir. Ortaya çıkan boncuklar, birden fazla türden ve alt sınıftan antikorları bağlayarak akış sitometrisinde floresans telafisi için çok yönlü ve maliyet etkin bir ar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını ve açıklayacak hiçbir şeylerinin olmadığını belirtir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Tianjin Eğitim Komisyonu Bilimsel Araştırma Programı (2021KJ224) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AF647 Rat Ig2aBioLegend141711
APC Fare IgG1BioLegend353311
BL21(DE3) Yetkin HücrelerSangonB528414
BSASolarbioA8010
EDCThermo Fisher22980CAS: 1892-57-5
FITC Ermeni Hamster IgGBioLegend400905
İmidazoleSigma-AldrichI202CAS: 288-32-4
IPTGGoldBioI2481CCAS: 367-93-1
Kanamycin SangonA600286CAS: 8063-07-8
KClAladdinP112134CAS: 7447-40-7
KH2PO4AladdinP434010CAS: 7778-77-0
MESSigma-AldrichM3671CAS: 145224-94-8
Na2HPO4AladdinS274390CAS: 7558-79-4 
NaClAladdinC111549CAS: 7647-14-5
NHSThermo Fisher24500CAS: 6066-82-6
Ni NTA boncukları 6FFAkıllı Yaşam BilimleriSA005005
PE fare IgG2aBioLegend362603
ProClean 300BeyotimeST853
Tris Sigma-Aldrich252859CAS: 77-86-1 
TriptonOksoidLP0042
Ultra Santrifüj Filtre, 50 kDa MWCOMilliporeUFC9050
Uniform Karboksil Polistiren MikrosferlerTomicro Biyoteknoloji10 ml, 25 mg/mlŞanghay, Çin
Maya EkstraktıOksoidLP0021

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2005).
  2. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  3. Bhowmick, D., Lowe, S. K., Ratliff, M. L. Side-by-side comparison of compensation beads used in polychromatic flow cytometry. Immunohorizons. 7 (12), 819-833 (2023).
  4. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  5. Tang, H., et al. Economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice. J Vis Exp. (185), e63125(2022).
  6. Sun, J., Kroeger, J. L., Markowitz, J. Introduction to multiparametric flow cytometry and analysis of high-dimensional data. Methods Mol Biol. 2194, 239-253 (2021).
  7. Blazer, L. L., Roman, D. L., Muxlow, M. R., Neubig, R. R. Use of flow cytometric methods to quantify protein-protein interactions. Curr Protoc Cytom. 53, 13.11-13.15 (2010).
  8. Zheng, Z., Chinnasamy, N., Morgan, R. A. Protein l: A novel reagent for the detection of chimeric antigen receptor (car) expression by flow cytometry. J Transl Med. 10, 29(2012).
  9. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e5 (2018).
  10. Patella, V., Casolaro, V., Bjorck, L., Marone, G. Protein l. A bacterial ig-binding protein that activates human basophils and mast cells. J Immunol. 145 (9), 3054-3061 (1990).
  11. Eliasson, M., et al. Chimeric igg-binding receptors engineered from staphylococcal protein a and streptococcal protein g. J Biol Chem. 263 (9), 4323-4327 (1988).
  12. Hattori, T., et al. Multiplex bead binding assays using off-the-shelf components and common flow cytometers. J Immunol Methods. 490, 112952(2021).
  13. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic press. (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak SitometrisiProtein A G LAntikor Ba lanmasFloresans KompansasyonuNikel Afinite KromatografisiEDC NHS KimyasPolistiren Mikrok relerProtein Safla t rma

İlgili makaleler