Yöntem makalesi

Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi

428 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70365

⸱

12 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Medical Physics, Centre for Systems Medicine, Royal College of Surgeons in Ireland, 2Cellular and Molecular Imaging Core, Royal College of Surgeons in Ireland

Bu makalede

Özet

Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden üretilen hastadan türetilen manyetik gliomakürleri kullanarak 3D glioblastoma göç modeli sunuyoruz. Bu platform, hastaya özgü göç dinamiklerinin görselleştirilmesine ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesine olanak tanır. Test, protein lokalizasyonu ve ifade desenlerini değerlendirmek için göç sonrası çoklu eklenebilir.

Özet

Klinik olarak önemli hipoksik koşullar altında yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden hasta kaynaklı glioblastoma gliomasferlerinin göç ve invaziv potansiyelini modellemek için tekrarlanabilir bir 3D göç testi tanımlıyoruz. Uniform boyuttaki gliomasferler, ince bir hücre dışı matriks tabakasına aktarılır ve manyetik demir oksit nanopartikülleriyle birlikte kültürlenir; bu da manyetik plaka tutucuya yerleştirilerek kültür kuyularında merkezi lokalizasyonlarını sağlar. Tohumlama üzerine manyetik demir oksit nanopartiküllerinin dahil edilmesi, bireysel hastadan türetilen gliomakürlerin hassas ve lokal görüntülenmesini hafif bir manyetik kuvvetle kolaylaştırır ve konumsal değişkenliği azaltarak otomatik görüntü işleme boru hatlarını optimize eder. Bu test, fizyolojik olarak ilgili bir mikro ortamda glioblastoma göç davranışının ayrıntılı incelenmesini destekler ve yeni teşhis edilen ve tekrarlayan hasta kaynaklı gliomaküreler arasında invaziv potansiyel ve göç davranışlarının doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır. Yöntem, canlı hücre görüntüleme ve çoklu analiz ile uyumludur ve glioblastoma göçü, invaziv potansiyel ve terapötik yanıt için preklinik araştırmalar için ölçeklenebilir bir platform sunar.

Giriş

Glioblastoma nöroloji onkolojide en önemli zorluklardan biri olmaya devam etmektedir. Bu hastalık, hastalar arası ve hasta içi kapsamlı heterojenlik, standart bakım yanıtından güçlü kaçınma, apoptotik indüksiyona direnç ve çevresel koşullara karşı olağanüstü plastisiteyle oluşur1. Son zamanlarda, tümör mikroçevresinin (TME) karmaşıklığı, özellikle glioma kök benzeri hücrelerin (GSC'ler) dinamik doğası nedeniyle önemli dikkat çekmiştir; bu hücreler mikroçevresel değişikliklere yanıt olarak fenotip ve hücre durumunudeğiştirebilen 2,3. Bu fenotipik plastiklik, tümörün ilerlemesini teşvik eder ve agresif ön cephe tedavi tedavisine rağmen kaçınılmaz tekrara katkıda bulunur. Cerrahi rezeksiyon, hasta prognozunu iyileştirmek için en etkili müdahale olarak kalmaktadır; ancak glioblastoma'nın yüksek infiltratif ve mikroskobik invaziv yapısı nedeniyle tümörün tamamen çıkarılması mümkün değildir4. Hasta örneklerinin çeşitli hastalık evrelerinde ve tümörle özgün durumlarda invaziv dinamiklerinin modellenmesi, glioblastoma göçünün dinamik ve plastik yeteneğini daha derinlemesine anlamayı kolaylaştıracak ve böylece etkili yeni tedavi yaklaşımlarının belirlenmesine yardımcıolacaktır 5. Bu nedenle, hastaya özgü istila ve göç dinamiklerini yakalayan fizyolojik olarak ilgili modeller geliştirmek, preklinik araştırmaları geliştirmek ve bu hedefleri ilerletmek için gereklidir. Ayrıca, bu tür modeller, teorik olarak cerrahi ile birlikte kullanılmak üzere geliştirilebilecek yeni anti-tümör tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir; bu tedaviler, cerrahi ile birlikte geliştirilerek kalıntı mikroskobik istilayı önlemek ve nihayetinde nüks riskini azaltmak için geliştirilebilir. Glioblastomanın karmaşıklığı, temel tümör mimari özelliklerini yeniden gösterebilen ileri ve karmaşık preklinik modellere olan ihtiyacı haklı çıkarır. Hastadan türetilen üç boyutlu modeller, hücrelerden hücrelere etkileşimleri koruma, besinler, oksijen ve tedavi edici ajanların gradyanlarını koruma ve doğal tümörlerin yapısal bütünlüğünü çoğaltmayetenekleri nedeniyle artan ilgi gördü 6,7. Ancak, bu 3B modelleri görselleştirmek, küresel konumlandırma, görüntüleme değişkenliği ve analiz tekrarlanabilirliği gibi teknik zorluklar ortaya çıkarmaktadır.

Burada, hipoksik koşullarda gerçekleştirilen hastaya özgü 3D glioblastoma göç modelini tanımlıyoruz; bu model, tedavi için naif ve tekrarlayan tümör örnekleri dahil olmak üzere çeşitli hasta tümör alt tiplerinden ve hastalık evrelerinden alınan örnekler arasında göç dinamiklerinin araştırılmasını mümkün kılmaktadır. Bu platform, terapötik ajanlara karşı farklı yanıtların değerlendirilmesini sağlar ve görüntü segmentasyonu yoluyla çoklu göç sonrası analizi destekler; böylece göç dinamiklerinin, küre büyümesinin ve protein ifadesinin nicel olarak değerlendirilmesini sağlar. Manyetik demir oksit nanopartiküllerinin dahil edilmesi, her kuyu içinde sferoidlerin tutarlı merkezileşmesini sağlar; hafif bir manyetikkuvvet uygulanır8. Standart çoklu kuyu plakalarında kültürlenen sferoidler, genellikle kuyu kenarlarına doğru kayma eğilimi gösterir; bu davranışın, özellikle plaka çevresindeki kuyular 9,10,11 kuyular içinde sıvı menisküslerin oluşumu ve çevresel buharlaşmadan etkilendiğine inanılır. Bu olaylar, özellikle iletim ışık mikroskopisinde, istila dinamiklerinin zaman geçişli görüntülemesini karmaşıklaştırabilecek görüntüleme artefaktları ve arka plan gürültüsü getirmektedir. Görüntüleme için uniform hücre yoğunluğuna sahip bölgelerin seçilebildiği 2D monolayer kültürlerinin aksine, tek sferoid istila testleri görüntüleme alanında tüm sferoid ve göç alanının hassas ve tutarlı konumlandırılmasını gerektirir. Bu da ek bir zorluk ekliyor; çünkü kuyu içindeki kayma veya düzensiz konumlandırma, veri kalitesini ve tekrarlanabilirliğini tehlikeye atabilir. Bu nedenle, çoklu kuyulu plakalar içinde kürelerin tutarlı şekilde merkezileştirilmesi bu zorlukları en aza indirir ve sadece görüntüleme kalitesini değil, deneysel tutarlılığı, görüntü işleme boru hatlarını ve göç sonrası analizleri de iyileştirir. Ayrıca, bu özel sferoid kültür plakalarında uniform hücre yoğunluklarında küre kültürlerinin başlatılması, tekrarlanabilir sferoid oluşumunu teşvik eder ve morfoloji, büyüme hızı ve yapısal bütünlükteki değişkenliğiazaltır 10,11. Pratik olarak, bu testlerde kullanılan tipik gliomaküreler çapı 150–300 μm arasında değişir ve standartlaştırılmış hücre yoğunlukları altında tekrarlanabilir şekilde oluşur. Kültürler hipoksik koşullarda (%1–%2 O2) korunur.

Burada açıklanan platform, 96 kuyu plakaları gibi orta ve yüksek verimli formatları destekler, hasta örneğinde birden fazla replikasyon sağlar ve ilaç taraması veya çoklu koşullu testler için ölçeklenebilir12 . Bu nedenle, glioma invaziv potansiyeli ve diğer dinamik hücresel süreçleri incelemek için kullanılan 3D preklinik modellerin sağlamlığını ve klinik önemini artırmak için küreoid konumlandırma ve kültür koşullarının optimize edilmesi önemlidir.

Protokol

Hasta kaynaklı glioblastoma hücreleri, Erasmus MC, Rotterdam, Hollanda ve Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) tarafından sağlandı. Bu hatlar için birincil birincil hasta örnekleri, hastalardan bilgilendirilmiş onayı kapsamında rutin rezeksiyonların bir parçası olarak alınmıştır (etik onay sayıları, MEC-2013-090, 0020010404).

1. Manyetik hastadan türetilen gliomasferlerin hazırlanması (Şekil 1)

  1. Gliomasfer ayrışmasından en az 30 dakika önce, deney için yeterli hücre ayrılma enzimi ortamı ve gliomasfer ortamı (genellikle birleşen T75 şişesi başına 1 mL) aliquot alın ve her ikisini de oda sıcaklığına getirin.
  2. Steril koşullarda, kültür şişesinden gliomaküreleri 10 mL'lik serolojik pipet ve pipet yardımcısı kullanılarak nazik aspirasyonla toplan ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 300 x g ile 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücre pelletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın.
  3. Pelleti 1 mL oda sıcaklığında hücre ayrılma enzimi ortamında yeniden askıya alın ve 10–15 dakika kuluçka yapın; her 2-3 dakikada bir P1000 pipetiyle pipetle nazikçe karıştırarak tek hücre süspansiyonuna ayrışmayı kolaylaştırın.
  4. Enzimi deaktive etmek için eşit hacimde gliomasfer ortamı ekleyin. Tek hücre süspansiyonunu 300 x g ile 37 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjlenin, ardından hücre pelletinin boyutuna bağlı olarak 3–5 mL tam gliomakür ortamında nazikçe yeniden süspansiyona alın ve sonraki hücre sayımı için kullanılan tam hacmi not edinin.
    NOT: Enzim ortamı kuluçka süresi büyük ölçüde kültürdeki gliomakürlerin boyutuna bağlıdır; kullanımdan önce her zaman görsel olarak incelen ve buna göre benimsenmelidir.
  5. Tek hücreli süspansiyondan temsilci 10 μL aliquot alın ve 10 μL Trypan Blue ile 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde nazikçe karıştırın. Bu karışımdan 10 μL bir hemositometreye veya otomatik hücre sayacına yüklenerek canlı hücreleri belirleyin.
  6. Her kuyu başına 500 tek glioblastoma hücresini, ultra-düşük tutucu, 96 kuyruklu sferoid mikroplakaya tohumlayın. Optimal tohumlama yoğunluğu hasta örneklerine göre değişebilir.
  7. Her kuyu başına 1 μg/mL Propidium iyodid (PI) ve 0,05 μL demir oksit nanopartikülü ekleyin (örneğin, yaklaşık 10.000 tek hücreye karşılık gelen 20 sferoid için 1,5 μL manyetik nanopartikül kullanın). Demir oksit nanopartiküllerinin eklenmeden önce homojenleştirildiğinden emin olun; P100 ile 100 μL'ye ayarlanmış pipetle yukarı aşağı pipetlenin.
    NOT: Kullanılan demir oksit nanopartiküllerinin hacmi kullanılan hücre hattına bağlı olarak optimize edilebilir, ancak bu durumda 10.000 hücre başına 1,5 μL sferoidleri merkezi olarak lokalize etmek için yeterliydi. Bu kurulum, hasta örnekleri arasında tutarlı küre boyutunu sağlar ve invaziya testi sırasında doğrudan istila ve büyüme dinamiklerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırır.
  8. Gliomasfer oluşumuna izin vermek için 37 °C, %5 CO2 ve %21O 2 sıcaklıklarında nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatöründe 48 saat boyunca plakalar inkübe edin.

figure-protocol-1
Şekil 1: Demir oksit nanopartikülleriyle birlikte kültürlenmiş eşit boyutlu ve konumlanmış gliomakürler. (A) Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan hasta tümörlerinden türetilen gliomaküreler, çift fenotipler ve rastgele hücreden hücreye ilişkiler gösterir. (B) Tohumlanmadan 48 saat içinde uniform boyutlu küre oluşumunun şematik temsili. (C) Üst panelsiz ve (alt panel) demir oksit nanopartikülleriyle 48 saat boyunca yuvarlak tabanlı sferoid mikroplakada kültürlenmiş gliomakürelerin iletim ışık görüntüleri. Demir oksit nanopartikülleri içeren gliomasferlerin koyu ve benekli görünümüne dikkat edin. (D) Gliomasfer konumlandırması, nanopartikül olmadan kültürlenmiş gliomasferlerin rastgele lokalizasyonunu gösterir (üstte), nanopartiküllerle kültürlenenlerin tutarlı merkezi lokalizasyonuna kıyasla (altta) daha az arka plan gürültüsü ve görüntü kalitesinin artmasına yol açar. Ölçek çubuğu = 100 μm. Şematik, Biorender.com kullanılarak yapılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Ekstrahücre matriks (ECM) kaplı çok kuyu plakalarının hazırlanması (göç testinden 1 saat önce)

  1. Üreticinin talimatlarına göre ECM'i sakla. 1 mL ECM aliquotunu (1:10 seyreltme) gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde yavaşça eritin. Kaplamadan hemen önce, 1:100 (v/v) oranında buz gibi tam nörosfer ortamında 1:10 stokun 1:10 daha seyreltilmesini uygulayarak nihai çalışma çözeltisi hazırlanır. Erken polimerleşmeyi önlemek için seyreltilmiş ECM'yi her zaman buzda tutun. Bu seyreltmeyi her zaman buzda tutun çünkü ECM oda sıcaklığında hızla polimerize olur.
  2. 1:100 ECM çalışma çözeltisinden 50 μL 96 kuyulu, berrak, düz tabanlı veya μClear tabanlı bir plakanın her kuyusuna dağıtın. Plakayı en az 1 saat 37 °C'de kuluçka altına alın, böylece ECM her kuyiyada ince bir matris oluşturabilir.
  3. İnkubasyondan sonra, her kuyunun altını 20 μL polimerize ECM (nihai konsantrasyon 1:100 v/v) kaplamış şekilde dikkatlice çıkarın. ECM bu süre zarfında mümkün olduğunca soğuk tutulmalıdır, çünkü oda sıcaklığında hızla polimerleşir. Görüntüleme plakası ayrıca önceden soğutulabilir ve bu süreçte buz üzerinde depolanabilir.
     

3. Görüntüleme plakası kurulumu ve canlı hücre görüntülemesi

  1. Test günü (gliomasfer tohumlamasından 48 saat sonra), ECM kaplı mikroplakayı manyetik 96 kuyruklu plaka sürücüsüne yerleştirin; Şekil 2B,C'de gösterildiği gibi. Manyetik plakayı %70 etanol ile püskürterek ve kuru silerek sterilize edin, ıslatmayın.
  2. Kalite ve tekdüzelik için küreleri görsel olarak inceleyin. Bir pipet kullanarak, her kuyiden tek gliomaküre içeren 80 μL ortamı aktarın ve pipet nazikçe ECM yüzeyli plakaya yerleştirin.
    NOT: Özellikle büyük küreler için, transfer sırasında kesme stresini en aza indirmeye özen gösterin; Bu, P100 pipet ucunun ucundan makasla 1-2 mm keserek açıklığı genişletmek ve mekanik hasarı azaltmak için sağlanabilir. Makas kullanmadan önce UV altında sterilize edildiğinden emin olun. En önemlisi, hava kabarcıklarının en aza indirilmesi, çünkü bu görüntüleme üzerinde büyük bir etkiye sahiptir.
  3. Küreleri deneysel tasarıma göre tedavi edin. Tedavi çözeltilerini istenen konsantrasyonlarda 20 μL hacimde hazırlayın, ardından bu 20 μL sferoidleri içeren her kuyuya ekleyerek nihai hacmi 100 μL elde edin.
    NOT: Gliomakürelerin bu şekilde işlenmesi pipetlemeyi azaltır ve kürelerin kuyulardan alınması riskini en aza indirir.
  4. Plakayı, manyetik sürücüde kalırken canlı görüntüleme için görüntüleme sistemine aktarın. Plakayı manyetik tutucudan çıkarırken dikkatli olun ve kürelerin kuyunun ortasından hareketini en aza indirmek için mümkün olduğunca düz kalın.
  5. Plan-Apochromat 5x/0.35 NA objektif (0.5x tüp lensi), Axiocam 506 kamera (binning =2) ve Zen 3.1 (Mavi Baskı) yazılımı ile donatılmış programlanabilir ters canlı hücre mikroskobu kullanarak canlı görüntüleme gerçekleştirin. Pikselden mikrona kalibrasyon görüntüleme sistemine entegre edilmiştir ve yazılım tarafından otomatik olarak yönetilir, bu nedenle manuel kalibrasyona gerek yoktur. Bu durumda, görüntülemeyi 2,5x büyütme ile (0,5x tüp lensle 5x objektif olarak) gerçekleştirin, kamera 2 x 2 boyutunda binlenmiş ve 1 piksel = 3,645 μm kalibrasyon elde edilir.
  6. Çevresel kontrolleri %1 oksijen ve %5CO2 olacak şekilde ayarlayın ve gaz mikserinden gelen hava akışı çok yavaş olur. Bu, gelen hava nemlendirici şişeden geçirildiğinde istenmeyen buharlaşmanın önlenmesine yardımcı olur.
  7. İlk görüntüleme döneminde gliomasferin yer değiştirmesini önlemek için, mikroskopun aşama ivmelenmesini ve hızını %10'a indirerek küresel yapışma öncesi ECM yüzeyinde hareketi en aza indirin.
  8. Manyetik tahrik olmadan çok kuyruklu plakayı mikroskopa nazikçe yükleyin. Uygunsa, optiklerin uyum sağlaması için plaka malzemesinin yazılımda seçildiğinden emin olun.
  9. Tüm istilacı görüş alanını kapsayan uygun bir büyütme kullanın. Örneğin, Cell Discoverer 7'de 5x objektif ve 0.5x tüp lens seçilerek 2.5x büyütme sağlandı.
  10. Her gliomaküreyi bulun, odaklanın ve x-y-z koordinatlarını içeren bir konum atayın. Donanım otomatik odaklama varsa, deney boyunca aynı odak düzleminin tutarlı görüntülenmesini sağlamak için kullanılmalıdır.
  11. Hem faz gradyanı kontrastı (iletim ışık) hem de floresans kanallarını kontrol edin ve aşırı pozlama olmadığından emin olmak için pozlama süresi ile ışık yoğunluğunu ayarlayın. 590 nm LED kullanarak propidium iyodidi (ölü hücre boyası) uyarın. Dört bant geçişli filtre kullanılarak emisyon toplayın ve 618–756 nm dalga boyu bandını yakalayın. Bu, diğer mikroskoplarda, mevcut filtreler ve ışık kaynağına bağlı olarak değişebilir.
  12. İstenen gün sayısı boyunca her saat bir fotoğraf çekecek şekilde ayarlandı.

figure-protocol-2
Şekil 2: Görüntüleme plakasının kurulumunun tanımı. (A) Tanımlanan protokolü temsil eden şematik diyagram. (B) Manyetik plaka sürücüsüne bitişik çoklu kuyu plakasının görüntüsü ve manyetik sürücünün üzerine basit bir montaj edilmesi; her bir mıknatıs her kuyunun merkezinde lokalileştirilerek gliomasfer lokalizasyonunu kolaylaştırır. Şematik, Biorender.com kullanılarak yapılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Çoklanmış protein analizi için istila testi sonrası sferoidlerin fiksasyonu (Şekil 3)

  1. İstila testi tamamlandıktan sonra, her kuyuyu 100 μL PBS ile yıkayın. Bu, hacmi 200 μL/well'e çıkarır. Bu adımı tekrarlayın; ardından 100 μL PBS çıkarıp yerine ek 100 μL PBS ekleyin.
  2. 200 μL ortamı dikkatlice çıkarın, ardından her kuyuya 100 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve oda sıcaklığında bir duman davlumbazı altında 10 dakika kuluçka yapın.
    DIKKAT: Paraformaldehit toksik bir kimyasaldır ve risk veya maruziyeti en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır.
  3. Fiksasyondan sonra, her kuyudan PFA'yı çıkarın ve her seferinde 100 mL PBS ekleyerek 3 kez PBS ile yıkayın.
  4. Üreticinin talimatlarına göre bağışıklık boyama ekleyin. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için PBS'ye sodyum azidi (%0,02) ekleyerek sterilliği koruyabilir ve plakayı şeffaf bir film ile kapatabilirsiniz. Gerekirse 4 °C'de saklanın.

figure-protocol-3
Şekil 3: Kuyunun ortasında ve kenarında bulunan gliomakürelerin göç testinden sonra temsili protein analizi. Migrasyon sonrası Glioblastoma kök hücre belirteci CD44'ü hedefleyen antikorla immünbone edilmiş tekrarlayan gliomakürlerin lazer taramalı konfokal mikroskopisi. CD44-FITC (yeşil) ve Hoechst (çekirdekler, mavi). Ölçek çubuğu = 100 μm. Ok uçları kuyunun kenarını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Hasta kaynaklı göç dinamiklerinin görüntü işleme boru hattı

NOT: Veri setimizdeki deneyimimize göre, işleme bilgisayarının yüksek temel çekirdek frekansına ve önemli miktarda belleğe sahip çok çekirdekli bir işlemciye sahip olmasını öneriyoruz; çünkü WEKA işleme yüksek çekirdek sayısına çok uygundur ve veri seti boyutuna bağlı olarak mevcut belleği kullanır.  Aşağıda listelenen kullanılan ve önerilen özellikler.  GPU işleme bu iş akışında kullanılmamaktadır.
CPU: >= 6 çekirdek | >= 2 GHz (önerilir); 32 çekirdek | 2.1 GHz (kullanılmıştır)
Bellek: > 32 GB (önerilir); 192 GB (kullanılmış)

  1. Open Fiji13 [şu anda analiz için dahil edilen ImageJ-win64.exe çalıştırılabilir dosya kullanılmaktadır]. Görsel açın – Dosya > Seç çok kanallı, çoklu sahne zaman geçişli görüntü dosyası (.czi) Fiji Arayüzü'nde açılır (eğer script kullanılıyorsa, bu Ek Dosya 1'dir).
  2. GUI'de gerekli görselleri seçin. Deneydeki en istilacı gliomakürelerin sınıflandırıcıyı (yani kontrol kuyusu – DMSO) ilk olarak eğitmesi en iyi şekilde çalışır; çünkü bu görüntü, görüntünün her segmenti hakkında detaylar sunar; örneğin istila/göç eden hücrelerin görünümü ile sferoid ve arka plan arasındaki fark.
  3. Sonra Görüntü > Renk > Bölünmüş Kanallar bölümüne gidin - bu görüntüyü iki kanala ayırır – biri Propidium İodit boyama ile, diğeri ileten ışık iletir.
  4. Segmentasyon için kanalı seçin – bu durumda, göç dinamiklerini temsil eden iletilen ışık kanalı. Eklentiler > Segmentasyon > Trainable WEKA segmentasyon14'e gidin.
  5. İki varsayılan sınıfın isimlerini şu şekilde değiştirin: Sınıf 1: Gliomasphere; Sınıf 2: İstila/Göç. Arka plan adlı üçüncü bir sınıfı ekle (isteğe bağlı ama tavsiye edilir) Ayarlar > Yeni sınıf > Arka Plan sayfalarına geçin.
  6. Freeline aracı kullanılarak, her resim yığını ve sınıf içindeki eğitim bölgelerini temsil eden bölgelere çizim yaparak not edin; yani kürede bir girdap çizip Sferoid'e ekle tuşuna tıklayın, bunu istila alanı ve arka plan için tekrarlayın, ta ki tüm bölgeler her sınıfta temsil edilene kadar. Sınıflandırıcıyı Train Classifier (Sınıflandırıcı'ya tıklayarak eğitin). Gerekirse sınıflandırıcıyı doğruluğu artırmak için ek görseller not edilebilir.
  7. Yetindiğinde, eğitilmiş sınıflandırıcı modelini CellLine_Treatment_Classifier.model gibi bir dosya adıyla kaydedin. Tamamlandığında segmentasyon penceresini kapatın.
  8. Bu kaydedilmiş sınıflandırıcı kullanılarak yeni görseller için Eklentiler > Segmentasyon > Trainable WEKA segmentasyon >Load Classifier> Open Saved Classifier CellLine_Treatment_Classifier sayfalarına gidin (bu .model - dosyasını kaydeder. Ek Dosya 2'nin betik çalıştırılmadan önce bunu hazırlaması bir gerekliliktir. Script başlatıldığında, uygun örnek dosya seçilmelidir).
  9. Eğitilebilir WEKA segmentasyon arayüzünde olasılık almak için gidin - Bu, seçilen her sınıf için olasılık haritaları üretir; örneğin Gliomasphere, İstila/Göç, Arka plan, görüntüye atanan her piksel değerinin görüntünün belirli sınıfına veya bölgesine ait olma olasılığını gösterir. Bu, her görüntü için 32 bit dinamik aralık olan 3 ayrı olasılık haritası görüntüsünden (Gliomasphere, Invasion, Background) oluşan bir dosya oluşturur.
  10. İstila/Göç ile ilgili olasılık haritasını seçin. Boyutluluğu azaltmak > Görüntü Hiper Yığın>larına Gidin. Kaynağı Sakla'yı seçin.
  11. Kanalları işareti kaldırın ama Frame'leri korun - bu, haritayı zamanla tek bir kanala indirir – bu durumda İstila olasılık haritası. Gliomasphere'e karşılık gelen olasılık haritasını seçin.
  12. 5.10-5.11 adımlarını tekrarlayın. Artık göçün bir sahnesi ve küre alanı için orijinal iletilen ışık zaman geçişi görüntüsüne karşılık gelen iki olasılık haritası olacak. Her ikisini de aşağıdaki dosya adı konvansiyonuyla kaydedin: ImageName_Scene_Gliomasphere_ProbabilityMap ve ImageName_Scene_Invasion_Probability Map, seçilen deneye karşılık gelen bir klasörde, yani CellLine_Treatment.
  13. İkili maske oluşturmak için eşik ayarlayın: Image > Adjust > Threshold'a gidin. Bir eşik yöntemi seçin (örneğin, Yen, Otsu). Seçilmiş yöntemi tüm işlenen görüntülerde aynı tutun.
  14. Ölçümleri analiz > Set'e gidin. İstediğiniz ölçüleri seçin; Tick Alanı, Entegre Yoğunluk ve Ortalama tuşlarına basın, sonra OK'ye basın. Parçacıkları Analiz > Analiz Etme bölümlerine gidin. İstila/Göç için ayarlayın: 0 – sonsuz; Döngüsellik: 0.00 – 1.00. Gliomasferler için set boyutu: genellikle 1500 – Sonsuz (hücre hattı/tedavideki küre boyutuna göre gerekirse ayarlanabilir - kontrol küreleri doğal olarak büyür); Döngüsellik: 0.05 – 1.00. Hepsi için piksel birimleri seçin.
  15. Analiz >Pikselleri Analiz Et> Göster: Maskeleri Seç. Maskeler oluşturulduktan sonra, doğru takip için tüm timelapse yığını boyunca segmentli ilgi alanını doğrulayın. Process > Binary > üzerinden ikili işlemler uygulanır ...(örneğin, küre maskesi geliştirilirken Fill Holes seçmek), ardından Parçacıkları Analiz > Analiz > Göster > Hiçbir Şey Seçme ve Özetle' seçeneklerine geçin. Bu, seçilmiş ölçümlerin özet penceresini sağlayacaktır.
  16. Sonuçları Dosya > Sonuçlar Olarak Kaydet'> tıklayarak kaydet. .csv dosyası olarak kaydet. Tablo veya başka bir analiz yazılımında açın.
  17. Tüm segmentli sınıflar (örneğin, gliomaküreler, istila) için eşik ve parçacık analizini tekrarlayarak ilgili ölçümleri zaman içinde elde edin.  Çıkış .csv zaman içinde alan (kalibrasyona bağlı olarak piksel veya mikron cinsinden) sağlar.
  18. PI boyamanı temsil eden floresans kanalını seçin (örneğin, kanal 2).  Ölü hücreleri belirlemek için yukarıdaki gibi eşik ve parçacık analizini uygulayın. Calculator Plus eklentisini kullanarak PI-pozitif hücrelerin maskelerini gliomasfer maskesi ile çarpın ve istila maskeleriyle ayrı ayrı çalın, böylece belirli bölgeler için ölü hücreleri nicelikle ölçün.
  19. Maskeleri, olasılık haritalarını ve özet tabloları TIFF ve CSV dosyaları olarak, dokümantasyon ve sonraki analiz için açık, tanımlayıcı dosya adlarıyla dışa aktarın. Ekte verilen betik kullanıldığında aşağıdaki adlandırma düzeni bulunabilir: örneğin FileName_Scene#_(PI-)Invasion_Summary.csv (zaman içindeki nesneler için veri), FileName_Scene#_(PI-)Invasion.zip (analiz parçacıklarıyla tanımlanan bölgeler).
    NOT: Ek Dosya 1 , her sahne için timelapse görüntülerle tek tif dosyaları üretir. Ek Dosya 2 , WEKA piksel sınıflandırmasını, her zaman geçişindeki tüm sahnelerde ve tüm görüntülerde önceden tanımlanmış bir sınıflandırma model dosyasına dayalı olarak çalıştıracak ve Gliomasphere ile istilacı hücreler için olasılık haritaları sağlayacaktır. Ek Dosya 3 , tüm görüntüleri Gliomakürelere ve istilacı hücrelere ayıracak ve örtülen alanları ile ölü (PI-pozitif) hücrelerin kapladığı alanların bölünmesini nicelikle ölçülecektir. Ek Dosya 4'ün çalıştırılması belirli bir eşik yöntemi ve analiz edilecek belirli bir bölgeyi varsayarken, Ek Dosya 3 kullanıcının her sahne için eşik belirleyip bölgeyi ayarlamasına olanak tanır. Eşik her sahne için farklı yöntemlere değiştirilmemeli, ancak her nesne için farklı yöntemlere ayarlanabilir.

figure-protocol-4
Şekil 4: Zayıf gliomasfer segmentasyonu nedeniyle tekrarlanabilir görüntü işleme zorluğu. Fiji'de eğitilebilir WEKA segmentasyon eklentisi kullanılarak görüntü işleme boru hattı (A) merkezi olarak lokalize gliomasfer ve arka plana karşı daha fazla göç alanı segmentasyonu ile (B) kenara lokalize edilmiş gliomasfer ile kötü görüntü segmentasyonu ve kullanılamaz bir çoğaltma ile sonuçlanır. Gliomakür lokalizasyonunda tutarlılık sağlanarak, biyolojik kopyalar arasında görüntü işleme (A)'da gösterildiği gibi ortaya çıkar ve analiz tekrarlanabilirliğini ve otomasyonunu büyük ölçüde iyileştirir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Hipoksik koşullarda tanımlanan 3D göç testi kullanılarak, tekrarlayan hasta tümörlerinden alınan gliomakürler araç veya İlaç X ile tedavi edildi ve invaziya dinamikleri 72 saat boyunca her saat izlendi. Şekil 5 , invaziya dinamiklerinin WEKA segmentasyon analizini tanımlar; bu da İlaç X'in klinik olarak ilgili hipoksik koşullarda araç kontrollerine kıyasla tekrarlayan gliomasferlerin invaziv potansiyelini önemli ölçüde azalttığını ortaya koymaktadır.

Migrasyon sonrası kök hücre özellikleri üzerindeki İlaç X'in etkisini daha iyi değerlendirmek için, glioblastoma kök hücre belirteci CD44'ün ekspresyonu ve lokalizasyonu için gliomakürler sabitlendi ve immünbonize edildi; bu durum Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu çoklu analiz, göç dinamiklerinin ve kök hücre belirteç ifadesinin görselleştirilmesini kolaylaştırır ve Drug X'in klinik olarak ilgili hipoksik koşullarda tekrarlayan glioblastom modellerinin hem invaziv potansiyel hem de kök benzeri özelliklerini nasıl modüle ettiğine dair içgörüler sağlar.

figure-results-1
Şekil 5: Optimize edilmiş göç testi, yeni İlaç X'in tekrarlayan gliomasfer göçünü önlemedeki etkinliğini vurgular. Hastadan türetilen tekrarlayan gliomakürler, araç veya ilaç X ile hipoksik koşullarda 72 saat boyunca tedavi edilmiştir. İstila dinamikleri her saat 72 saat boyunca her saat görüntülendi. (A) Üst panelde 0 saat ve 72 saat içinde istila dinamiklerinin iletim ışık görüntüleri - Araçta tedavi edilen, alt panel - İlaç X tedavi edildi. (B) Segmentasyon analizinde kullanılan istila alanının temsil olasılık haritaları. (C) İlaç X ile işlenmiş tekrarlayan gliomakürler, araçla tedavi edilen gliomakürlere kıyasla önemli ölçüde daha az invaziv potansiyel göstermiştir. 72 saatte invaziv alanın nicelendirilmesi, Drug X ile tedavi edilen gliomakürelerde invazonun anlamlı şekilde azaldığını ve fiksasyon sırasında kaplanan toplam alan olarak temsil edildiğini gösterdi. Veri, n=3 bağımsız çoğaltmalardan zaman içindeki istila alanını temsil eder. İstatistiksel anlamlılık, eşleşmemiş bir t-testi kullanılarak değerlendirildi; p < 0.005 ** ile belirtilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 6: Tedavi sonrası göç ve kök hücre belirteç ekspresyonu. Şekil 5'te tanımlanan gliomaküreler, migrasyon sonrası sabitlendi ve glioblastoma kök hücre belirteci CD44'ü hedef alan bir antikor kullanılarak immün boyandı; bu yöntem araç veya İlaç X ile tedavi edildi. Bu şekil, standart immünboyama teknikleriyle yapılabilecek çoklanmış migrasyon sonrası analiz türünü göstermektedir. Görüntüler CD44-FITC (yeşil) ve Hoechst (çekirdekler, mavi) gösteriyor. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Mikroskoptan çok sahneli CZI dosyalarını tek bir sahne olarak TIF dosyaları olarak yeniden kaydetmek.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Weka modeli kullanılarak olasılık haritaları oluşturuluyor.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Eşik Olmadan Segmentasyon Analizi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Eşik ile segmentasyon analizi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Glioblastoma gibi son derece agresif tümörlerin invaziv dinamiklerini modellemek, hastalık süreçlerini daha iyi anlamamız ve daha etkili tedavi stratejileri belirlemek için kritiktir. Glioblastoma hücre göçünün karmaşık, adaptif ve plastik doğası, bireysel glioma hücrelerinin merkezi tümör kütlesinden göç ederken dinamik davranışlarını doğru şekilde yakalayabilecek preklinik modeller gerektirir. Önemli olarak, hastalıkın farklı evrelerinden alınan hasta örnekleri arasında bu süreçleri modellemek, araştırmacıların tümör heterojenliği sorununu daha iyi ele almasını ve invaziya dinamiklerindeki aşamaya özgü değişiklikleri belirlemelerini sağlar.

Bu karmaşıklık göz önüne alındığında, preklinik modellerin eşdeğer bir sofistike seviyesine sahip olması gerektiği varsayılabilir. Burada, demir oksit nanopartikülleriyle birlikte kültürlenmiş, eşit boyutta hasta kaynaklı gliomasferler üretmek için geliştirilmiş bir yöntemi tanımlıyoruz. Bu yaklaşım, gliomakürelerin her kuyunun merkezinde kontrollü lokalize edilmesini sağlar ve istila dinamiklerinin otomatik canlı hücre görüntülemesini sağlar. Birçok çalışma, geleneksel 3B kültür yöntemleri kullanıldığında sferoid boyut, şekil ve büyüme kinetik konularında önemli değişkenliği ortaya koymuştur. Sayde ve meslektaşları, kürelerin sıralanmamış ve sıralanmış kanser kök hücre popülasyonlarından türetilenler arasında geniş çaplı dağılımlar gösterebileceğini, bu da sferoid oluşumundaki doğal değişkenliğiyansıtmaktadır 15,16. Bu heterojenlik, sferoid tabanlı ilaç tarama testlerinde tekrarlanabilirlik sorunlarının önemli bir kaynağı olarak da tanımlanmış ve homojen sferoid popülasyonların oluşturulmasının önemini daha davurgulamaktadır 12. Bu bulgular, fonksiyonel analizler yapılmadan önce küre oluşum koşullarının standartlaştırılmasının gerekliliğini vurgulamaktadır; bu zorlukları bu yöntem doğrudan ele almaktadır. Hem sferoid boyutu hem de konumu standartlaştırarak, bu yöntem tekrarlanabilirliği önemli ölçüde artırır ve genellikle 3B hücre kültür sistemlerinde bulunan değişkenliği en aza indirir; çünkü sferoid oluşumu aşağı akış analizini etkileyebilir.

Bu testin ilk geliştirilmesinde, replikalar arasında sferoid lokalizasyonda önemli değişkenlik gözlemledik; bu da her deney başına çok sayıda kuyu kullanılmasını ve istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için birçok biyolojik kopyanın kullanılmasını gerektirdi. Bu sadece iş yükünü önemli ölçüde artırmakla kalmadı, aynı zamanda kullanılamaz miktarda veri üretti, analiz verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini azalttı. Bu nedenle, ortaya çıkan değişkenlik, istila davranışındaki farklılıklar yerine ölçülebilir veri kaybını yansıtıyordu. Her kuyu içinde gliomaküreleri merkezileştirerek, manyetik lokalizasyon, örnekler arasında istila dinamiklerindeki biyolojik farklılıklar gözlemlendiğinde bile, tüm kopyalardan alınan görüntülerin tutarlı şekilde segmentlere ayrılıp analiz edilebilmesini sağlar.

Demir oksit nanopartiküllerinin dahil edilmesi, gliomaküreleri tüm kuyular arasında tutarlı şekilde merkezileştiren hafif bir manyetik kuvvet oluşturur; bu da görüntü işleme boru hattı, veri işleme ve göç sonrası analizlerin performansını büyük ölçüde artırır; gliomasfer biyolojisi veya yaşamlılığıetkilemez 8. Bu sistemin önemli avantajlarından biri, göç sonrası çoklu analizle uyumluluğudur; örneğin , Şekil 6 , glioblastoma kök hücre belirteci CD44'ün görselleştirmesinin analizini göstermektedir; bu da migrasyon ve hasta örnekleri arasında tedavi sonrası kök hücre benzeri ifadenin değerlendirilmesini sağlar. Bu yetenek, invaziv fenotipleri moleküler özelliklerle ilişkilendiren entegre çalışmalar için platformların potansiyelini ortaya koymaktadır; glioblastoma kök benzeri hücrelerin mikroçevresel ipuçlarına yanıt olarak fenotipik plastisitesi ve tedaviden kaçma yetenekleri nedeniyle kaçınılmaz tümör nüklemesini teşvik etme yeteneği göz önüne alındığında önemli bir önem haline getirilmiştir.

Bu test, tek bir küresel istila dinamiklerinin görselleştirilmesinde tekrarlanabilirliği büyük ölçüde artırsa da, gelecekteki analiz optimizasyonu için dikkate alınması gereken bazı kritik sınırlamalar hâlâ mevcuttur. Matrigel, bazaz zarının yaygın olarak kullanılan bir modelidir, ancak insan beyni mikroçevresini tam olarak yansıtmayan fare sarkomalarından türetilen karmaşık, tanımlanmamış bir ekstrasellüler matriks (ECM) ikamesidir17. Testin gelecekteki optimizasyonu, beyin tümörü mikro ortamını daha iyi taklit etmek için beyin spesifik ECM modellerini içerebilir; bu, in vitro beyin istilası modellerinin vazgeçilmez bir optimizasyonadımı olduğuna inanıyoruz 18,19. Matrigel, yaygın olarak benimsenen bir ECM modeli olmaya devam etse de, fare sarkomundan türetilen beyin spesifik olmayan ekstrasellüler bir matriksi temsil eder. Bu nedenle, insan beyni mikroçevresinin biyokimyasal ve mekanik özelliklerini tam olarak yansıtmaz. Önemli olarak, burada tanımlanan manyetik lokalizasyon stratejisi matriksden bağımsızdır ve gelecekteki çalışmalarda beyne özgü ECM sistemlerine kolayca uyarlanabilir ve fizyolojik önemi daha da artırabilir.

Testin diğer hususları arasında, örnek heterojenliği ve istila morfolojisindeki değişkenlik nedeniyle her hücre hattı için yeni bir WEKA segmentasyon modeli eğitme gereklilikleri de bulunmaktadır. Ayrıca, yüksek verimli göç testleri yapmadan önce, her hücre hattı ve sferoid tipi için hem tohumlama yoğunluğu hem de nanopartikül konsantrasyonu optimize edilmelidir. Bu sınırlamalara rağmen, bu platform hastaya özgü glioblastoma invazisi ve tedavi yanıtını incelemek için ölçeklenebilir ve uyarlanabilir bir çerçeve sunar. Canlı hücre görüntüleme, otomatik segmentasyon hatları ve çoklu analiz sonrası analizlerle uyumluluğu, hasta tümörlerinin yüksek heterojen örneklerinden yeni tedavilerin, kombinasyon tedavilerinin ve mekanik invazion çalışmalarının yüksek içerikli taraması için fırsatlar sunmaktadır. Ayrıca, bu testi astrositler, nöronlar ve mikroglia gibi yerleşik beyin hücreleri veya kan beyin bariyeri etkileşimleri modelleri gibi ortak kültür sistemlerine genişletmek, glioblastoma ilerlemesini ve nüklemesini tetikleyen tümör stroma etkileşimleri hakkında ek bilgiler sağlar.

Analiz geliştirme sırasında tekrarlanabilirlik ve genel test performansının kritik belirleyicileri olarak birkaç teknik adım belirlenmiştir. Testten önce hücre hatlarının tohumlama yoğunluğunun standartlaştırılması, başlangıç gliomasfer boyutunun tutarlı olmasını sağlar; bu da küre büyüme dinamiklerinin hücre hatları, tedaviler ve koşullar arasında karşılaştırılabilir olmasını sağlar. Bu standartlaştırma adımı olmadan, başlangıçtaki sferoid boyutları önemli bir değişkenlik seviyesi ekler ve bu da gliomakürelerin deneysel koşullara değişken yanıtlarını yansıtabilir. Her kuyu içindeki gliomakürelerin hassas merkezi lokalizasyonu, doğru otomatik görüntü alımı ve aşağı akış segmentasyonu için temel bir gerekliliktir. Merkez dışı küreler, önemli görüntüleme gürültüsüne yol açar ve WEKA segmentasyonunun görüntüleri net tanımlanmış bölgelere ayırmak için kullanılmasını engeller. Tüm gliomakürelerin merkezde lokalize edilmesi sayılırsa, aynı WEKA sınıflandırıcısı birden fazla kez kullanılabilir; çünkü gürültü önemli ölçüde azalır ve görüntü kalitesi önemli ölçüde artar. Bunun bir temsili Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu nedenle, manyetik demir oksit nanopartiküllerinin dahil edilmesi, gliomakürlerin merkezi konumlandırılmasını sağlamak, konumsal değişkenliği en aza indirme ve kopyalar arasında görüntü işleme ile karşılaştırılabilirliği önemli ölçüde iyileştirmek için bir yöntemdir. Son olarak, WEKA boru hattı içinde segmentasyon modeli eğitimi, ek bir kritik standartlaştırma adımını temsil eder. Hastalararası heterojenlik ve invaziya morfolojisindeki farklılıklar nedeniyle, tek bir segmentasyon modeli tüm örneklerde genelleştirilmez. Her hücre hattı için sınıflandırma parametrelerinin yeniden eğitilmesi veya iyileştirilmesi, istilacı alanların doğru olasılık haritalarını sağlar ve nicelendirme hatalarını önler.

Genel olarak, bu test, hasta kaynaklı glioma örneklerinin dinamik invaziv davranışlarını gerçek zamanlı incelemek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir platform sağlar. Çoklu görüntüleme ve sonraki moleküler analizlerle uyumluluğu, hem temel hem de translasyonel glioma araştırmaları için güçlü ve çok yönlü bir araç haline getirerek pre-klinik glioblastoma modellerinin translasyonel önemini büyük ölçüde artıracaktır.

Açıklamalar

Açıklanacak bir şey yok

Teşekkürler

Bu çalışma, Research Ireland (Science Foundation Ireland) tarafından 20391A01 hibe kodu altında ve Sağlık Araştırma Kurulu tarafından ERA-TRANSCAN-2022-002 hibe kodu altında desteklenmiştir. Hücreler, Dirks Lab, SickKids, Toronto ve Rotterdam'daki Erasmus Tıp Merkezi (EMC) işbirlikçilerimiz tarafından nazikçe sağlandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 WELL BIYOPRINT KITI, TEMIZGreiner655840
AccutaseInvitrogen00-4555-56N/a
B-27 Takviyesi (50X), serum  A vitamini olmadan ücretsizdiGibco1258701010%
Temel Fibroblast Büyüme Faktörü, İnsan ve Insan; (bFGF)PeproTech100-18B20  ng/ml
Celldiscoverer  7Zeiss-
Korning Sferoid MikroplakalarıCorningCLS4515
Corning Matrigel MatrisiCorning3542341:100 final seyreltme
Kontes Otomatik Hücre SacıInvitrogen-
DMEM-F12  (500ml)Thermofischer11320-074N/a
Epidermal Büyüme Faktörü İnsan (EGF)PeproTechAF-100-1520  ng/ml
FITC Fare İnsan Karşıtı CD44BD Pharmingen5554781:100
Greiner CELLSTAR 96 Kuyu Polistiren Hücre Kültürü Mikroplakaları, F-Bottom/Baca Kuyusu, µ Şeffaf, siyah, TC, steril, kapaklıGreiner655090
HeparinThermofischerA161985µ g/ml
Hoechst 33258  Sigma Aldrich (Merck)8614051µ g/ml
NanoShuttle-PLGreiner6578411.5  µ l/10.000 hücre
Penisilin - StreptomisinMerckP43331%

Kaynaklar

  1. Singh, S., et al. Glioblastoma at the crossroads: Current understanding and future therapeutic horizons. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 213(2025).
  2. Spitzer, A., et al. Deciphering the longitudinal trajectories of glioblastoma ecosystems by integrative single-cell genomics. Nat Genet. 57 (5), 1168-1178 (2025).
  3. Dirkse, A., et al. Stem cell-associated heterogeneity in glioblastoma results from intrinsic tumor plasticity shaped by the microenvironment. Nat Commun. 10 (1), 1787(2019).
  4. Dejaegher, J., De Vleeschouwer, S. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , Brisbane (AU). (2017).
  5. Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C., Weiss, S., Luchman, H. A. Live-cell imaging assays to study glioblastoma brain tumor stem cell migration and invasion. J Vis Exp. (138), e58152(2018).
  6. Xie, Y., et al. The human glioblastoma cell culture resource: Validated cell models representing all molecular subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
  7. Paolillo, M., Comincini, S., Schinelli, S. In vitro glioblastoma models: A journey into the third dimension. Cancers (Basel). 13 (10), 2449(2021).
  8. Aye, K. T. N., Ferreira, J. N., Chaweewannakorn, C., Souza, G. R. Advances in the application of iron oxide nanoparticles (ions and spions) in three-dimensional cell culture systems. SLAS Technol. 29 (3), 100132(2024).
  9. Das, V., Furst, T., Gurska, S., Dzubak, P., Hajduch, M. Reproducibility of uniform spheroid formation in 384-well plates: The effect of medium evaporation. J Biomol Screen. 21 (9), 923-930 (2016).
  10. Das, V., Furst, T., Gurska, S., Dzubak, P., Hajduch, M. Evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates. J Vis Exp. (121), e55403(2017).
  11. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  12. Zanoni, M., et al. 3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103(2016).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable weka segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  15. Sayde, T., et al. Reproducible 3d culture of multicellular tumor spheroids in supramolecular hydrogel from cancer stem cells sorted by sedimentation field-flow fractionation. J Chromatogr A. 1736, 465393(2024).
  16. Lee, S., Lim, J., Kwak, B. Factors of bias in spheroid-based drug screening: Fabrication method, spheroid size, and cell viability. Biomed Pharmacother. 192, 118597(2025).
  17. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  18. Barbugian, F., et al. Bioresponsive hyaluronic acid-based hydrogel inhibits matrix metalloproteinase-2 in glioblastoma microenvironment. ChemMedChem. 20 (15), e202401040(2025).
  19. Carvalho, E. M., et al. Viscoelastic high-molecular-weight hyaluronic acid hydrogels support rapid glioblastoma cell invasion with leader-follower dynamics. Adv Mater. 36 (50), e2404885(2024).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

3B Göç DeneyiManyetik NanoparçacıklarGliyomasfer LokalizasyonuHücre Dışı MatriksCanlı Hücre Görüntülemeİnvaziv PotansiyelDemir Oksit NanoparçacıklarSferoid Deneyi
Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.