Interlock Pulsatile Enjeksiyon Tekniği ve Mikrocerrahi Damar Onarımı kullanarak Beyin Metastazları için Yüksek Hassasiyetli Preklinik Fare Modeli Mühendisliği

Özet

Bu çalışma, Interlock pulsatile enjeksiyon ve mikrocerrahi onarım kullanarak tümör hücrelerine geçici intrakarotid enjeksiyonu yoluyla yüksek isabetli fare fare metastazı modelleri kurmaktadır. Beyin kan akışını korur, ortak karotis arterin tıkanmasını önler ve tümör metastazı oranlarını iyileştiren ve ölüm oranını azaltan üstün preklinik modeller sağlar.

Özet

Beyin metastazı hâlâ yıkıcı bir klinik sorundur. Beyin metastazı araştırmalarında büyük bir zorluk, metastaz sürecini doğru şekilde özetleyen yüksek kaliteli modellerin eksikliğidir; böylece kanser hücrelerinin beyinde nasıl kolonileştiğine dair mekanik içgörüler sağlanır. Beyin metastazının geleneksel intrakarotis arter enjeksiyon modelleri genellikle ortak karotis arter (CCA) kalıcı bağlanmasını gerektirir; bu da beyin hemodinamiğini değiştirir ve kan-beyin bariyerinin (BBB) bütünlüğünü tehlikeye atar. Protokol, beyin metastazı için yüksek isabetli fare modeli oluşturmak için geliştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. Temel yenilik, tümör hücresi teslimatı için Interlock Pulsatile Injection (IPI) tekniğini ve ardından CCA'da fizyolojik kan akışını yeniden sağlamak için delin bölgesinde mikrocerrahi arterial rekonstrüksiyon uygulanmasını içeriyor. Geleneksel CCA ligasyon modeline kıvrıldığında, IPI–mikrocerrahi onarım yaklaşımı perioperatif ölümleri anlamlı şekilde azalttı (%2,86 vs. %25,71) ve beyin metastazı oluşum oranını artırdı (%94,12 vs. %65,38). IPI tekniği, intrakarotis enjeksiyonu sırasında hücre kusmasını en aza indirmek için tandem şırınga konfigürasyonu kullanır. Tümör hücre infüzyonundan sonra, CCA mikrocerrahi dikişler kullanılarak stereomikroskop altında titizlikle onarılır ve böylece kalıcı tıkanma önlenir. Bu, tümör hücresine giriş anında doğal beyin hemodinamiğini ve BBB'nin bütünlüğünü korurken, cerrahi başarı oranlarını önemli ölçüde artırır ve ölüm oranlarını azaltır. Metastatik intrakraniyal lezyonlar seri biyolüminesans görüntüleme ve histopatoloji ile doğrulanır. Bu yöntem, beyin metastazının patofizyolojisini incelemek ve preklinik terapötik değerlendirme için üstün bir platform sağlar ve böylece metastaz süreci özetlenir.

Giriş

Beyin metastazları, yetişkinlerde en yaygın kötü huylu beyin tümörü türüdür ve primer beyin tümörlerinden yaklaşık on kat daha sık^{görülür 1}. Sistemik kanseri olan hastaların %10–%20'sinin hastalıklarının ileri evrelerinde beyin metastazı geliştireceği tahmin edilmektedir; bu da ölüm^{nedenlerinden başlıca bir kaynaktır 1,2}. Birincil kanser tedavisinde önemli ilerlemelere rağmen, beyin metastazı olan hastaların prognozu hâlâ kötü. Beyin metastazı olan hastaların bir yıllık sağlıklama oranı %20'den ^azdır3. Bazı kanserlerin neden ve nasıl beyne metastaz yaptığı bilinmemektedir. Terapötik zorluk, BBB'nin varlığı, belirgin beyin bağışıklık mikroortamı ve karmaşık tümör hücresi etkileşimleri gibi beyin metastazlarının benzersiz biyolojisi ile daha da karmaşık bir şekilde ^{karmaşıklaşır.}

Beyin metastazları üzerine hem farmakodinamik hem de patogenezi araştırmaları, insan hastalık sürecini doğru şekilde özetleyen hassas preklinik hayvan modellerine büyük ölçüde dayanır. Mevcut beyin metastazı modelleri yaygın olarak kullanılsa da, ağırlıklı olarak intrakraniyal ortotopik implantasyon, damar veya kuyruk ven enjeksiyonu, intrakardiyak enjeksiyon veya intrakarotis arter^enjeksiyonu 6,7,8,9,10 üzerine dayanmaktadır. Ancak bu modeller, insan hastalık ilerlemesini kusurlu şekilde yansıtır ve genellikle fizyolojik akış koşullarında sağlam bir BBB üzerinden tümör hücresi ekstravazasyonu gibi temel adımları yakalamakta başarısız^{olur 11}. Damar içi ve intrakardiyak enjeksiyonlar, düşük beyin spesifik tümör oluşum etkinliğine yol açar ve genellikle yaygın ekstrakraniyal metastazlara yol açar; bu da önemli beyin metastazlarının gelişmeden önce erken hayvan ölümüne yol^açar. Geleneksel intrakarotis arter enjeksiyon yöntemi, intrakranial tümör oluşum oranını artırır ancak CCA'nın kalıcı ligasyonunu gerektirir. Beyin hemodinamiğini değiştirerek, bu ligasyon ipsilateral beyin bölgelerinde iskemiye neden olabilir ve tümör hücre teslimatı için gerekli fizyolojik kan akışı desenlerini bozabilir; böylece beyin içindeki mekânsal dağılımlarını ve kolonizasyon nişini^{etkileyebilir 13,14}.

Beyin metastazının patofizyolojisini daha sadık şekilde taklit edebilen yüksek kaliteli hayvan modelleri çok önemlidir¹⁵. İdeal bir beyin metastaz modeli, tüm metastatik zinciri özetlemelidir; tümör hücresinin beyin damarlarına yönlendirilmesi, kan-beyin bariyeri (BBB) üzerinden ekstravazasyon ve beyin mikroçevresiyle dinamik etkileşimler^dahildir. Yüksek model salıtı hem mekanik çalışmalar hem de terapötik değerlendirme için^{kritiktir 6}. Ancak, mevcut intrakarotid enjeksiyon modelleri, özellikle normal beyin kan akışının korunması ve dolaşımdaki tümör hücrelerinin doğal dağılımının korunması gibi temel fizyolojik koşulları tam olarak yeniden üretemez.

Mevcut beyin metastazı önklinik modellerinin sınırlamalarını aşmak için, metastatik zinciri daha doğru şekilde özetleyen yüksek isabetli hayvan modeli geliştirildi ve IPI tekniği ve mikrocerrahi arter onarımına dayandı. Bu yöntem, tümör hücresi enjeksiyonundan sonra geçici arterial tıkanmayı ve ardından ipsilateral CCA'ya fizyolojik kan akışını geri getirmek için arterial ponksiyon bölgesinin titizlikle onarımını içerir. Bu yaklaşım, sadece model tutarlılığını ve başarı oranlarını artırmakla kalmaz, aynı zamanda en önemlisi, doğal beyin hemodinamiğini koruyarak BBB'yi korur. Beyin kan akışının bozulmasını en az şekilde en az tutarak, modifiye edilen intrakarotis enjeksiyon modeli, beyin metastatik kolonizasyonunun doğal sürecini daha doğru şekilde özetleyen yüksek isabetli bir platform sağlar ve böylece beyin metastaz mekanizmalarını araştırmak ve potansiyel tedavileri değerlendirmek için geliştirilmiş bir araç sunmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Çin Bilimler Akademisi Biyofizik Enstitüsü'nün Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı (onay numarası: SYXK2021124). Önceden belirlenmiş son noktalara ulaşan hayvanlar, Çin Bilimler Akademisi'nin Biyofizik Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) Hayvanların Ötenazi Yönergeleri ve AVMA Hayvanların Ötenazi Yönergeleri (2020)¹⁷ uyarınca ötenazilendi.

1. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

1. Kültür B16F10 ve 4T1 hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin-streptomisin ile takviye edilmiş tam RPMI-1640 ortamında.
2. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemli bir kuluçka makinesinde 37 °C'de tutun.
3. Cerrahi işlemlerden bir gün önce lusiferaz ekspresyonunu doğrulayın ve mikoplazma kontaminasyonunun yokluğunu doğrulayın.
4. Cerrahi operasyon gününde, hücreler %80 birleşime ulaştığında, önce fosfatla tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanarak ve ardından 37 °C'de 3 dakikadan kısa süreyle (%0,25) tripsizasyon yapılarak alınır.
5. %0,25 tripsin söndürülmek için hücrelere %10 içeren RPMI-1640 ortamı ekleyin.
6. Hücreleri 300 × g ile 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri PBS'de iki kez yıkayarak kalıntı serumu alın, ardından hemositometre ile sayın.
7. Enjeksiyon sırasında hücre canlılığının %90–%95 arasında kaldığını doğrulamak için Trypan mavi dışlama testi kullanın.
8. PBS'de hücreleri 2 ×^{10 6} hücre/mL olarak yeniden süspansiyona alın. Hücreleri enjeksiyona kadar buzda tutun.
   NOT: Luciferase etiketli B16F10 ve 4T1 hücreleri kullanılabilir. B16F10 temsilci örnek olarak sunulmaktadır.

2. Fare hazırlığı ve perioperatif hazırlık

1. 7–8 haftalık erkek C57BL/6 fareleri kullanın.
2. Hipotermiyi önlemek için cerrahi plakanın altına bir ısıtma pedi yerleştirin. Ameliyattan 30 dakika önce ısıtma pedini açın.
3. Tüm cerrahi aletleri, cerrahi plakayı ve gövde kafesini otoklavla sterilize edin. Stereomikroskopu ve cerrahi masayı %75 etanol ile dezenfekte edin.
4. Otoklavlama ile sterilize edilemeyen diğer ürünler UV ışını ve %75 etanol ile dezenfekte edilmelidir (Şekil 1A).
5. Anesteziden önce fareyi tartın ve ameliyat öncesi ağırlığı başlangıç olarak kaydedin.
6. Santrifüj tüpüne 10 g tribromoetanol ekleyin, ardından 10 mL üçüncü amil alkol ekleyin. Tüpü tribromoetanol tamamen çözülene kadar salla.
   NOT: Tribromoetanol ölüm dahil olmak üzere yan etkilere yol açabilir; Anestezi derinliğini dikkatlice izleyin.
7. Çözeltiyi 0,22 μm filtreyle filtreleyerek %100 stok çözelti hazırlanın.
8. %100 stok çözeltiyi %0,9 NaCl salin veya seyrelti ile %2,5 çalışma çözeltisiyle (1:40 seyreltme) çözeltisine dönüştürün. Her yeni hazırlanmış çalışan çözeltinin etkinliği farelerde anestezi açısından test edilmelidir.
9. Fareleri, %2,5 tribromoetanol enjeksiyonu ile 0,2 mL/10 g vücut ağırlığında anestezi edin. Gerekirse, anestezi orijinal anestezi hacminin üçte biri kadar bir doz uygulanarak anestezi uzatın (Şekil 1B).
   NOT: Anestezik dozunu vücut ağırlığına göre ayarlayın ve solunumu sürekli izleyin.
10. Farenin tamamen anestezi altında olduğundan emin olmak için hafif bir uyarı (örneğin parmak sıkıştırması) uygulanır ve motor tepki gözlemlemeden olur.
11. Boyun bölgesindeki tüyleri tıraş edin ve anesteziden sonra parmak kesme izi yapın.
12. Gözleri kuruluktan korumak için göz merhemi uygulayın.
13. Faresi cerrahi plakaya yerleştirin ve 4 uzuv ile üst kesici dişlerini yapışkan bantla sabitleyin (Şekil 1C).
14. Anestezi derinliğini solunum hızı ve sıkma refleksi değerlendirerek farelerin işlem sırasında ağrısız ve hareketsiz kalmasını sağlayarak izleyin.
15. Hayvanlar deneysel gruplara rastgele atanıyor ve görüntüleme analizi, grup dağılımı konusunda kör olan araştırmacılar tarafından gerçekleştirilmiştir.

3. IPI tekniğinin standart cerrahi prosedürleri ve mikrocerrahi onarım

1. Boyun bölgesini povidon-iyot çözeltisiyle dezenfekte edin ve cildin tamamen kurumasına izin verin, sonra devam edin (Şekil 1D).
2. Fareyi steril cerrahi bir perde ile aseptik şekilde örtün, sadece boyun bölgesi ortaya çıkarak (Şekil 1E).
3. Steril cerrahi makas ile yaklaşık 0,8–1 cm uzunluğunda orta çizgi servikal kesi yapın ve doku geri çekilmesi için ince forseps kullanılıyor (Şekil 2A).
4. Yüzeysel fasya ve alttaki kasların indirik açılı forsepslerle kesik diseksiyonu yaparak sağ karotis kılıfı ortaya çıkarın (Şekil 2B1, Şekil 2C1).
5. Sağ dış karotis arteri (ECA) karotis kılıfından izole edilip, sağ ECA'yı ipi ile bağlayarak hücre sızıntısını ekstrakranial dallara geçirin (Şekil 2B2, Şekil 2C2).
6. Sağ CCA'yı şah şahı kılıfı içinde dikkatlice izole edin, vagus sinirini yan tarafta ve damarın altında koruyarak (Şekil 2C1).
7. Damarı kaldırmak ve stabilize etmek için sağ CCA'nın altına küçük bir kauçuk eldiven parçası ve tuzlu nemli pamuk topu yerleştirin.
   NOT: CCA'yı yükseltmek damarı stabilize eder ve doğru delme ile enjeksiyonu kolaylaştırır. (Şekil 2B4, Şekil 2C4).
8. CCA distal ve pamuk topuna proksimal olarak açık halkalı iki çözülmemiş düğüm yerleştirin ve ardından proksimal düğümü bağlayın (Şekil 2B3, Şekil 2C3).
9. CCA kan akışını geçici olarak engellemek için distal sıkılmamış düğüm yakınındaki CCA'ya mikrovasküler bir klips uygulayın (Şekil 2B4, Şekil 2C4).
10. Kanser hücresi implantasyonu
    1. Kilit deliği
       1. Sağ CCA'nın yükseltilmiş segmentini, eğimi yukarı bakacak şekilde 32G iğne ile delin.
       2. İlk şırıngayı çekerek delme noktasını koruyun.
       3. Kanser hücresi süspansiyonunu vortex ile karıştırın ve mikrolitre şırıngaya 100 μL çekerek hava kabarcıklarının çekilmemesini sağlayabilirsiniz.
       4. Mikrolitre şırınganın iğne ucunu Adım 3.10.1.1'de oluşturulan delme yerine sokun ve enjeksiyon başlatmadan sabit tutarak hücre doğumundan önce stabil konum sağlanır (Şekil 2B5, Şekil 2C5, Ek Şekil 1).
          NOT: Stabil pozisyon ve kontrollü teslimat için 32G şırınga, enjeksiyon için mikrolitre şırınga kullanın. Ek Şekil 1 , iki şırınganın parametrelerini göstermektedir. 32G şırınganın dış çapı 0,22 mm, mikrolitre şırınga iğnesinin ise 0,26 mm olup, güvenli yerleştirme ve kontrollü enjeksiyon sağlar.
    2. Pulsatile enjeksiyon (Şekil 2C5)
       1. Step. 3.9'da uygulanan mikrovasküler klipsi çıkarın.
       2. Mikrolitre şırınga aracılığıyla tümör hücresi süspansiyonunun ICA'ya enjekte edilmesine başlayın.
       3. Süspansiyonu, sürekli basınç yerine küçük darbelerle nazikçe ilerleten pulsatil enjeksiyon hareketiyle verin.
       4. Süspansiyon, aşağıdaki kriterlerden herhangi birine göre uygulanır: kalp döngüsü kriterine göre, her 8 kalp döngüsünde ~1 μL hücre süspansiyonu enjekte edilir; bu enjekte distal iç karotis arterinde pulsatile retrograd kan akışı yönlendirilir; veya enjeksiyon hızı kriterine göre, hızın 60 μL/dakikayı aşmamasını sağlarken ~1 μL/s enjekte edilir.
       5. Enjeksiyon sırasında damarı izleyin. Başarılı teslimat, kırmızı damarın lümenden geçerken geçici olarak şeffaf hale gelmesiyle gösterilir ve delme noktasının etrafında görünür ekstravazasyon olmaz.
       6. Enjeksiyonu tamamladıktan sonra mikrolitre şırıngayı dikkatlice çekin.
       7. Damarı kapatmak ve geri kusmayı en aza indirmek için distal düğümü kontrollü bir şekilde hemen sıkın (Şekil 2B6, Şekil 2C6).
          NOT: Pulsatile enjeksiyon aşırı perfüzyonu azaltır ve intrakranial basınç yükselme riskini en aza indirir.
11. Mikrocerrahi onarım (Şekil 2B6, Şekil 2C6)
    1. Delik bölgesini su geçirmez şekilde kapatmak için 10-0 naylon mikrocerrahi dikiş kullanın; iğne giriş ve çıkış noktalarını kusur kenarına hemen bitişik konumlandırarak damar sızıntısını en aza indirin ve ışık açıklığını korursunuz.
    2. Mikrocerrahi dikiş iğnesini damar duvarındaki delik deliğinden yüksek büyütme altında geçirin ve dikişi geçici olarak açık bırakın.
    3. Cerrahi alanı hepparinli salinle yıkayın.
    4. Dikişi iki ila üç kare düğümle sabitleyin.
    5. Dikişin serbest uçlarını gevşemeyi önlemek ve yabancı cisim yükünü en aza indirmek için yaklaşık 1–2 mm olarak kesin.
       NOT: IPI tekniğinin standart cerrahi prosedürleri ve mikrocerrahi onarım Ek Video 1'de açıklanmıştır.

4. CCA'nın kan akışının yeniden sağlanması

1. Proksimal düğümü yavaşça gevşet.
2. Lümen'i yuyub olası mikroskobik pıhtı çıkarın. Aşırı kanamayı izlemek için cerrahi alana kuru bir pamuk topu yerleştirin.
3. Delikleme bölgesinden aktif efüzyon olmadığı doğrulanmadığında, karotis kan akışını yeniden sağlamak için distal düğümü dikkatlice gevşetin (Şekil 2B7, Şekil 2C7).

5. Başarılı onarımı onaylayın

1. Nabızların restorasyonu
   1. CCA'yı sağlam darbeler için gözlemleyin, bu da başarılı reperfüzyonu gösterir.
2. Açıklığı ve gemi bütünlüğünü doğrulayın
   1. Tamir alanını inceleyin; stenozdan arınmış olduğundan ve lümenin proksimal damar segmentiyle sürekli ve sürekli kaldığından emin olun.

6. Yaralı sulama ve kapatma

1. Cerrahi alanı heparinize olmayan normal salinle iyice sulayarak kalıntıları ve kan pıhtılarını temizleyin.
2. Deri kesisini sürekli dikiş kullanarak kapatın.
   NOT: Nemli bir cerrahi alan koruyun ve doku hasarını en aza indirmek için tüm manipülasyonları nazikçe yapın.

7. Ameliyat sonrası bakım

1. Sıvı desteği: Ameliyattan hemen sonra perioperatif sıvı kaybını telafi etmek için deri altına 0,5–1 mL sıcak steril salin verilmelidir.
2. Enfeksiyon profilaksisi: Ameliyat süresi 40 dakikayı aşarsa, 3 gün ardışık olarak enrofloksasin (5 mg/kg, günde bir kez) uygulanır. İşlem 40 dakikadan kısa sürerse antibiyotik gerekmez.
3. Beslenme ve su verme: Ameliyattan sonra en az 1 hafta boyunca hidrojel veya yumuşatılmış gıdalar sağlayarak yeterli su ve beslenme sağlanmasını sağlayın.
4. Günlük izleme: Günlük sağlık değerlendirmeleri yapın, çevre hareketleri, nörolojik bozukluklar, yara enfeksiyonu ve kilo kaybı için gözlemleyin.
5. Beklenen ameliyat sonrası süreç: İlk 48 saat içinde farelerde azalmış aktivite, hafif piloereksiyon ve ameliyat öncesi başlangıç seviyesinin %15'ine kadar kilo kaybı gösterebilir, ardından kademeli iyileşme görülebilir.
6. Analjezi: Ağrıyı hafifletmek ve iyileşmeyi hızlandırmak için günde bir kez 2–3 gün boyunca meloksikam (5 mg/kg, deri altına uygulanır).

8. Başarılı hayvan modeli kurulumu için değerlendirme kriterleri

1. Vücut ağırlığı takibi
   1. Fareleri günlük tartın ve vücut ağırlığını kaydedin.
2. Klinik değerlendirme
   1. Klinik belirtileri günlük olarak değerlendirin; duruş ve dairesel davranış dahil.
3. Biyolüminesans görüntüleme
   1. Görüntüleme cihazının ve bilgisayarın güç anahtarlarını açın.
   2. Biyolüminesans görüntüleme analiz yazılımını (Sürüm 4.7.2) başlatın ve biyolüminesans görüntüleme sistemini başlatmak için "Başlat" seçeneğine tıklayın.
   3. Başlatma sırasında, görüntüleme sistemi kontrol panelindeki sıcaklık durumu ışığı kırmızı olarak görünür. Görüntüleme yalnızca sıcaklık durumu ışığı yeşile döndükten sonra yapılabilir.
   4. Anestezi sırasında aspirasyonu önlemek için görüntülemeden önce 6 saat farelerden yiyecek ve su ayırmayın.
   5. İşlem boyunca ışıqdan korunan 10 mg/mL konsantrasyonda görüntüleme altını hazırlayın. Enjeksiyon hacmini 10 μL/g vücut ağırlığında hesaplayın.
   6. Görüntüleme için fareyi tutun. Sol alt karın bölgesinde enjeksiyon bölgesini %75 tıbbi alkolle temizleyin.
   7. İğnenin bağırsağa girme riskini en aza indirmek için enjeksiyon yerindeki karın duvarını nazikçe uyarmak için pamuk çubuğu kullanın.
   8. Karın duvarı delindikten sonra, kan yokluğunu doğrulamak için nazikçe aspirasyon yapın, ardından in vivo görüntüleme alt tabakasını yavaşça enjekte edin.
   9. Substrat enjeksiyonundan 4 dakika 30 saniye sonra, fareyi anestezi indüksiyon odasına aktarın.
   10. %3 izofluran kullanarak anestezi başlatın. Düzeltme ve sıkıştırma refleksleri kaybedildikten sonra, bakım için izofluran konsantrasyonunu %2'ye indirin.
   11. Anestezi altındaki fareyi görüntüleme odasına yerleştirin, burun konisinin ağız ve burnu tamamen kapladığından emin olun. Görüntüleme odası kapısını sıkıca kapatın.
   12. Görüntüleme sistemi kontrol panelinde, görüntüleme modu olarak "Luminescent" seçeneğini seçin. Pozlama süresini manuel olarak 60 saniyeye ayarlayın. "Fotoğrafçılık", "Üstörtü" ve "Hizalama Grid"i seçin.
   13. Üç farenin görüntülenmesi için görüş alanını D'ye ayarlayın. Görüntüleme yüksekliğini 1,5 cm'ye ayarlayın. Uyarılma filtresi için "Block", emisyon filtresi için "Open" seçeneğini seçin.
   14. Substrat enjeksiyonundan 10 dakika sonra, görüntüyü yakalamak için "Acquire" tuşuna tıklayın.
   15. Görüntü alındıktan sonra Araç Paletine gidin ve "ROI Araçlar"ı seçin. İlgi alanını (ROI) belirlemek için "Circle" aracını kullanın, ardından nicel veriler elde etmek için "Ölçüt ROI'ları"na tıklayın.
4. Histolojik analiz
   1. Deneysel son noktada beyin dokularını toplap histolojik analizlere tabi tutun.
   2. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ile metastatik lezyonları tespit edin ve doğrulayın.

9. İnsancıl uç noktalar

1. Hayvan refahı ve etik standartlara uyumu sağlamak için, acil ötenazi için önceden tanımlanmış insancıl uç noktalar belirlenmiştir.
2. Fareler karbondioksit (CO₂) solumasıyla ötenazi edilir ve ardından ölümü doğrulamak için ikincil fiziksel yöntem olarak servikal çıkıntı yapılır.
3. Aşağıdaki durumlardan herhangi biri ortaya çıkarsa hemen ötenazi yapılmalıdır.
   1. Nörolojik eksiklikler
      1. Motor disfonksiyon: ataxia (dengesiz yürüyüş, sallanma), daire dolaşma, felç, hemiparez veya titreme.
      2. Davranışsal veya bilinç değişiklikleri: halsizlik, sersemlik veya koma.
      3. Artan kafa basıcı belirtileri: anormal duruş (örneğin, kambur sırt sıkıntısı göstererek) veya baş eğimi.
      4. Nöbetler: genel veya fokal kasılmalar.
   2. Vücut ağırlığı ve fizyolojik fonksiyondaki değişiklikler
      1. Vücut kilosunun %20'nin üzerinde kaybolması veya tümör yükü veya şiddetli zayıflık nedeniyle bağımsız yemek yememek veya içememek.
      2. Nefes nefese (nefes nefese kalma) veya idrar/dışkı kaçırma.
   3. Tümör durumu
      1. Tümörle ilişkili ülser, enfeksiyon veya nekroz tespit edilirse deneyi derhal sonlandırın.
   4. Maksimum tolere edilen tümör yükü
      1. Fareler haftada iki kez biyolüminesans görüntüleme yapılır.
      2. Kraniyal tümör sinyali üstel büyüme aşamasına girdiğinde (örneğin, ardışık iki görüntüleme seansı arasında iki katına çıkma), nörolojik izleme günde iki katına çıkarılır.
      3. Ötenazi, biyolüminesans sinyal değerinden bağımsız olarak, ataxi veya nöbetlerin başladığı anda hemen gerçekleştirilir.

Sonuçlar

Biyolüminesans görüntüleme ve nicel analiz
Standartlaştırılmış cerrahi protokole uygun olarak, optimize edilmiş fare beyin metastazı modeli, ameliyat sonrası seri in vivo görüntülemede stabil intrakraniyal biyolüminesans sinyaller göstermiştir. İntrakarotis aşılamadan 4 hafta sonra yapılan sürekli in vivo biyolüminesans görüntüleme (Şekil 3A) ve nicel analiz (Şekil 3B) yapılan sonuçlar, meta...

Tartışma

Beyin metastazını doğru şekilde özetleyen sağlam preklinik modeller, patofizyolojik mekanizmaları aydınlatmak ve terapötik etkinliği değerlendirmek için gereklidir. Geleneksel intrakarotis enjeksiyon modeli, beyin kan akışını fizyolojik olmayan bir şekilde değiştiren ortak karotis arterinin (CCA) bağlanmasını gerektirir; bu da ipsilateral iskemik hasara ve kan-beyin bariyerini (BBB) bozabilir^.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10-0 mikrocerrahi sütür iğnesi	Lingqiao	2650798	Ortak karotis arter punksiyon bölgesinin onarımı için mikrocerrahi sütür
100 µL mikrolitre şırınga	Bolige Tools	100UL	Kilitleme darbesel enjeksiyon sırasında tümör hücresi teslimi için mikrolitre şırınga
100 µL pipet	Eppendorf	3123-000250	Cerrahi alanın salin irrigasyonu için pipet
32G 1 mL insülin şırıngası	Kindly	YY0497	İlk arteriyel punksiyon bölgesinin oluşturulmasında kullanılan insülin şırıngası
4-0 ipek sütür	Ethicon	W501	Cilt kesi kapanması için sütür malzemesi
4T1 meme kanseri hücre hattı	Çin Bilimler Akademisi Biyofizik Enstitüsü Shengdian Wang Laboratuvarından elde edildi	CRL-2539	İntrakarotid beyin metastaz modellemesi için kullanılan tümör hücre hattı
75% Etanol	Annjet	Q/371402AAJ008	Enjeksiyon bölgesini temizlemek için dezenfektan
7–8 haftalık erkek C57BL/6J fareleri	Charles River Laboratories	1.10011E+17	B16F10 beyin metastaz modeli için kullanılan deney hayvanları
8 haftalık dişi BALB/c fareleri	Charles River Laboratories	1.10011E+17	4T1 beyin metastaz modeli için kullanılan deney hayvanları
Açılı uçlu forseps	Kewo Tools	—	Dokunun diseksiyonu ve damar manipülasyonu için mikrocerrahi forseps
B16F10 melanom hücre hattı	Çin Bilimler Akademisi Biyofizik Enstitüsü Shengdian Wang Laboratuvarından elde edildi	CRL-6475	İntrakarotid beyin metastaz modellemesi için kullanılan melanom hücre hattı
Biyoluminesans görüntüleme analiz yazılımı	Living Image (versiyon 4.7.2)	—	Biyoluminesans görüntüleme verilerinin analizi için yazılım
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	Tümör hücresinin bakımı için hücre kültürü ortamı
Enroflloksasin (antibiyotik)	MCE	HY-B0502	Postoperatif enfeksiyon profilaksisi için kullanılan antibiyotik
Eozin Y çözeltisi	Beyotime	E301879	Eozin boyaması için histolojik boyama maddesi
Göz merhemi	Baiyunshan	H44023089	Anestezi sırasında gözlerin korunması için oftalmik merhem
Fetal boğa serumu (FBS)	Pan Sera Tech	ST30-3302	Hücre kültürü ortamı için serum takviyesi
GraphPad Prism	Versiyon 4.7.2	—	Hayatta kalma eğrileri ve nicel veri analizi için istatistiksel analiz yazılımı
Hematoksilin çözeltisi	Beyotime	C0105S	Hematoksilin boyaması için histolojik boyama maddesi
İzofluran	H.F.Q. Biotechnology	101357015	Görüntüleme prosedürleri sırasında kullanılan inhalasyon anestezisi
IVIS Spectrum in vivo görüntüleme sistemi	Lumina Series III	—	In vivo biyoluminesans görüntüleme için görüntüleme sistemi
Meloksikam (analgesik)	Qilu Hayvan Sağlığı	150252467	Postoperatif analjezi için kullanılan non-steroid anti-inflamatuar ilaç
Mikrocerrahi makas	Kewo Tools	—	Dokunun diseksiyonu için mikrocerrahi makas
Mini damar klibi	Zheyong Tools	200521	Ortak karotis arterin geçici oklüzyonu için mikrovasküler klip
İğne tutucu	Jiangxin Tools	1420 20Cr13	Mikrocerrahi sütürlerin işlenmesi için cerrahi alet
Paraformaldehit (%4)	Zhongsheng Wanda Tech	20240411	Histolojik analiz öncesi beyin dokusunun korunması için fiksatör
Penisilin	Gibco	1758-9324	Hücre kültürü için antibiyotik
Povidon-iyot çözeltisi	Sihuanpai	Q/PGSHW0009	Cerrahi cilt dezenfeksiyonu için antiseptik çözeltisi
RPMI-1640 ortamı	Xigong Bio Tech	12-115F	Tümör hücre büyümesi için hücre kültürü ortamı
Scilogex karıştırıcılar	Scilogex	MX-S	Tümör hücre süspansiyonlarını homojenize etmek için vorteks karıştırıcı
Buhar gösterge bandı	3M-Comply	1322-24MM	Otoklavlanmış cerrahi aletlerin sterilizasyon göstergesi
Stereomikroskop	Olympus	SZ61	Mikrocerrahi prosedürler sırasında görselleştirme için kullanılan mikroskobu
Zeiss Stemi 508 stereomikroskop	Zeiss	Stemi 508	Yüksek büyütmeli cerrahi görselleştirme için kullanılan stereomikroskop
Steril salin (%0,9)	Kelun	25M14D07	Cerrahi alanın nemli kalmasını sağlamak için kullanılan steril irrigasyon solüsyonu
Streptomisin	Gibco	1758-9319	Hücre kültürü için antibiyotik
Cerrahi örtü	Dafang	001-2016	Cerrahi alanı izole etmek için kullanılan steril örtü
Cerrahi eldivenler	Ansell Medi-grip	210-64005	Cerrahi prosedürler sırasında kullanılan steril eldivenler
Tribromoetanol	Sigma-Aldrich	MKBH0634V