Basit ve spesifik bir yöntem, bir fraksiyonasyonu adım olmadan floresan etiketleme ve hücre yüzey proteinleri gelişmiş algılama gösterilmiştir. Hücre yüzey proteinleri Diferansiyel bereket, iki-boyutlu (2-D) elektroforez ve Ettan ™ Dige teknolojisi kullanılarak analiz edildi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme
Bu makalede
Özet
Özet
Yüzey proteinleri hücre yeteneğini çevresine tepki ve komşu hücrelerle etkileşim merkezi. Onlar hemen hemen tüm hücre içi sinyal indükleyicileri olduğu bilinmektedir. Ayrıca, çevreye uyum ve ilaç tedavisi önemli bir rol oynar ve genellikle hastalık patogenezi ve patolojisi (1) katılan. Protein-protein etkileşimleri sinyal yolları içsel, ve bu karmaşık biyolojik süreçleri hakkında daha fazla bilgi elde etmek için, duyarlı ve güvenilir yöntemler, hücre yüzey proteinleri çalışmak için ihtiyaç vardır. İki boyutlu (2-D) elektroforez diferansiyel değişiklikleri incelemek için, karmaşık protein örneklerinin biyobelirteçleri ve diğer hedeflere tespiti için yaygın olarak kullanılır. Düşük bolluk (hücresel proteinlerin 1% 2) kısmen Hücre yüzey proteinleri, fraksiyonasyon ya da diğer tip zenginleştirme olmadan 2-D jel tespit etmek zordur. Onlar da sık sık kötü hidrofobik doğa ve yüksek molekül ağırlıklı (2) nedeniyle 2-B jeller temsil edilmektedir. Bu çalışmada, özel etiketleme ve proteinlerin bu önemli grup tespiti için CyDye Dige Fluor minimal boyalar kullanarak sağlam hücreler için yeni bir protokol mevcut. Hücre yüzey proteinleri hücre içi proteinler en az etiketleme ile çok sayıda özel etiketleme gösterdi. Bu protokol, hızlı, basit, kullanımı ve her üç CyDye Dige Fluor minimal boyalar (2, Cy Cy 3 ve Cy 5), hücre yüzey proteinleri etiket için kullanılabilir. Bu özellikler DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz Yazılımı kullanarak protein ekspresyonu değişiklikleri Ettan Dige teknolojisi ve analizi ile 2-B Floresan Fark Jel Elektroforez (2-D Dige) kullanarak çoklama için izin verir. Hücre yüzey proteinleri zaman çeşitli uzunluklarda CHO hücreler (bkz. Tablo 1) serum açlık sırasında izledi. Yüksek doğruluk ile bolluk içinde küçük değişiklikler tespit edildi ve sonuçları tanımlanan istatistiksel yöntemler ile desteklenmektedir.
Protokol
Hücre kültürü
- Grow GlutaMAX I% 10 fetal buzağı serumu, 50 U / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin sülfat (Invitrogen) içeren standart hücre kültürü yöntemleri kullanılarak, F-12 Ham orta Çin hemstırı yumurtalık hücreleri (CHO-K1).
- Serum ücretsiz medya Exchange kültür ortamı. Etiket hücre yüzey proteinleri CyDye Dige Fluor Cy3 veya Cy5 minimal boyalar (bkz. aşağıdaki bölüm Hücre Yüzey Etiketleme,) ile farklı zaman noktalarında.
- Her zaman noktası ve CyDye Dige Fluor Cy2 etiket hücreleri Havuzu eşit sayıda. Için bir iç standart olarak her 2-D jel kullanın.
- Deneylerin çoğunluğu CHO-K1 hücreleri ile yapılabilir, ancak fare embriyo fibroblastlar (3T3 L1) ve fare asit lenfoma lymphoblasts (EL4) (veriler gösterilmemiştir) kullanılabilir.
- DMEM orta son iki hücre tipleri GlutaMAX II ile büyür, ancak, aksi takdirde, CHO-K1 hücreler için kullanılan aynı koşullar kullanabilirsiniz.
Hücre yüzey etiketleme
- Dikkatle sayma ve 5-10 x106 hücreleri hacimde bölünerek, enzimatik olmayan yapışık hücrelere ayırmak. Süspansiyon büyüyen hücreleri için, koparma adım atın.
- Hücre süspansiyonları yaklaşık 5 dakika boyunca 800 xg'de santrifüjleyin. Orta içeren süpernatantlar çıkarın.
- 1 ml buz Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) pH 8.5 resuspendion pelet yıkayın. 4 800 xg ° C 'de 2 dakika süreyle santrifüj.
- Süpernatantı ve 200 ul buz etiketleme tampon hücre pelet (HBSS pH 8.5, 1 M üre) tekrar süspansiyon haline getirin.
- 600 pmol CyDye Dige Fluor karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde minimal boyalar ile sağlam hücreler etiketleyin.
- Lisin 20 ul 10 mM ekleyerek reaksiyon Quench. 10 dakika inkübe edin.
- 500 4 800 xg'de santrifüj ° C 'de 2 dakika süreyle takip ul HBSS pH 7.4, tabanda tarafından yüzey etiketli hücreler iki kez yıkayın.
Hücre parçalama ve ayrıştırma
- 150 ul soğuk lizis tamponu (7 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 ahbap, 30 mM Tris, 5 mM magnezyum asetat pH 8.5) yüzey etiketli hücreleri Lyse. Buz üzerinde zaman zaman vorteks ile en az 1 saat bekletin.
- 4 10 000 xg'de lizatları Santrifüj ° C 5 dakika. Yeni bir tüp süpernatantı aktarın. Bu örnek, tüm hücresel proteinleri içeren fraksiyone olmayan bir örnek.
- Buna paralel olarak, membran ve sitozolik fraksiyonları önce 2-B jel elektroforezi (membran fraksiyonasyon kiti kullanılarak, Pierce), yukarıdaki gibi, daha sonra parçalara ayırmak Hücre pelletleri yıkayın. Membran fraksiyonu iç ve hücre yüzey membran proteinleri içerir.
- Karşılaştırma için, standart Ettan Dige prosedürü 3 izleyin ve lyse, etiket, ve hücreler sonunda, damıtmak. D Quant Kiti (GE Healthcare) - 2 kullanarak örneklerinde protein konsantrasyonu belirleyin.
2-D elektroforez
- Rehidrate Immobiline DryStrip jeller, pH 3-11NL Immobiline DryStrip Reswelling tepsisi, bir gecede 450 ul DeStreak rehidratasyon sıvısı (% 0.5 IPG Tampon) 24 cm (24 cm).
- Manifoldu anodik fincan yükleme DryStrip jeller Immobiline ve talimatlara göre II. Ettan IPGphor IEF Sistemi kullanılarak izoelektrik odaklama (IEF) gerçekleştirmek için CyDye etiketli örnekleri (50 mg total protein karşılık gelen) uygulayın.
- IEF sonra, büyük (26 x 20 cm)% 12.5 poliakrilamid jeller (SDS-PAGE) üst üste iki adım yer ve şeritler dengelenmesi. % 0.5 'lik agaroz ile Yerleşimi (Bromophenol Mavi içeren tampon çalışan). 5 W / jel 30 dk Ettan DALTtwelve Büyük Dikey Sistemi kullanarak 2-D elektroforez çalıştırın ve sonra boya ön kadar 15 W / jel, jel alt ulaşır.
Görüntüleme ve veri analizi
- 2-D elektroforez tamamladıktan sonra, bir Typhoon 9410 Değişken Modu Imager kullanarak Cy2, Cy3 veya Cy5 jeller taramak.
- DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz Yazılımı 4 kullanılarak membran kesirler, sitozolik kesirler ve fraksiyone olmayan örnekleri spot haritalar karşılaştırın.
Post-boyama
- Görüntüleme sonra, gümüş, standart prosedür 5 göre jeller leke .
Protein tanımlama
- , Hasat büyümeye, fraksiyone olmayan bir örnek için yukarıda açıklandığı gibi hazırlayıcı miktarda (yaklaşık 1 mg toplam 10 x106 CHO hücreler protein) hücreler, yıkama ve lyse. Cy5, bir başak gibi bir hücre yüzeyinde etiketli örnek (bkz. yukarıda) kullanın ve etiketsiz preparatif miktarda protein birlikte uygulanır.
- Yukarıda açıklandığı gibi 2-D elektroforez yürütmek, ancak bu kez, 600 mikrogram Astrum firması etiketsiz hücre anodik bardak uygulaması başak etiketli 50 mikrogram hücre yüzeyi ile birlikte lizat. Doğru noktaya toplama izin vermek için referans işaretleyicileri kullanın ve yereöneriler 3 göre jel döküm önce cam plakalar arasında.
- Derin mor total protein leke 3 total protein boyama takip Cy5, hücre yüzeyinde nokta harita elde etmek için kanal Cy5 jel tarayın.
- DeCyder kullanarak iki nokta haritaları 2-Ge yazılım araya Maç ve Cy 5 etiketli hücre yüzey proteinleri ile ilgili tüm noktalar için bir seçim listesi oluşturmak. Ettan spot taşıma istasyonu kullanılarak hücre yüzey proteinleri Pick jel fişler ayıklamak ve Ettan digester kullanarak trypsinate. MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanarak belirleyin.
Tablo 1: Bir Ettan Dige deney Şekil 1'de hücre yüzey proteini etiketleme protokolü göre etiketli serum tükenmiş hücreleri örnekler kullanılarak yapıldı.
| Örnek | Time serum tükenmesi | CyDye ile Etiketli | Jel sayısı |
| 1 | - | Cy 3, Cy 2 | 1 |
| 2 | 30 dakika | Cy 5, Cy 2 | 1 |
| 3 | 2 saat | Cy 3, Cy 2 | 2 |
| 4 | 4 saat | Cy 5, Cy 2 | 2 |
| 5 | 16 saat | Cy 5, Cy 2 | 3 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protein konsantrasyonu
Iki etiketleme iş akışlarının bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücre yüzey proteini etiketleme protokole göre etiketli hücreleri hala bozulmamış olduğundan, sadece hücre yüzey proteinleri boya maruz kalmaktadır. , Etiketleme ve proteinlerin hücre içinde yanı sıra dış (Şekil 1) etiketli önce standart Ettan Dige protokolde, hücreler parçalanmış. Hücre yüzey proteinleri özellikle quantitated olamaz bu yana boya hücre yüzey proteini etiketleme protokol protein görece...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Biz onların işbirliği için, Viyana, Avusturya Üniversitesi Klinik Patoloji Enstitüsü Profesör Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer ve Sigurd Krieger teşekkür ederim.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kiti, 2 nmol | Reaktif | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kiti | Reaktif | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Tamponu pH 3-11NL | Reaktif | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reaktif | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Araç | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kiti | Araç | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak rehidrasyon solüsyonu | Reaktif | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Örtü Sıvısı | Reaktif | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Ünitesi | Enstrüman | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Enstrüman bileşeni | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Jel Döküm Sistemi | Araç | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Ayırma Ünitesi ve Güç Kaynağı/Kontrol Ünitesi | Enstrüman | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V ünitesi: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Değişken Mod Görüntüleyici | Enstrüman | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Enstrüman | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Enstrüman | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Enstrüman | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Enstrüman | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz Yazılımı | Diğer | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analiz Yazılımı | Diğer | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Üre | Reaktif | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reaktif | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Ditiyotreitol (DTT) | Reaktif | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromofenol Mavisi | Reaktif | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reaktif | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) | Reaktif | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Gliserol %87 | Reaktif | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF %40 T, %3 C | Reaktif | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reaktif | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Amonyum Persülfat | Reaktif | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glisin | Reaktif | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| Membran proteinleri için 2-D Örnek Hazırlama Seti | Reaktif | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomisin sülfat | Reaktif | Invitrogen | 15140-122 |
Kaynaklar
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
