Radyoaktif olmayan In situ Hibridizasyon Norveç Ladin Uygulanacak Protokol ve Bitki Türlerinin Aralığı
17 Nisan 2009
Biz değiştirilmiş bir DIG tarif In situ Hızlı ve bitki türlerinin Norveç ladin de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygulanabilir hibridizasyon protokol. Değişmiş RNaz tedavi ve proteinaz K konsantrasyonu da dahil olmak üzere sadece birkaç ayarlama ile protokol farklı dokular ve tür çalışmalarda kullanılıyor olabilir.
Sarıçam ve bir dizi bitki türü için uygulanabilir radyosuz in situ hibridizasyon protokolü. Carre ve ark. Merhaba, benim adım AM GaN; OBS Üniversitesi ve İsveç Tarım Bilimleri Üniversitesi'nde, obs İsveç'te çalışıyoruz.
Birkaç farklı bitki türünde çalışan bir böcek ziyareti protokolü oluşturduk. Bugün size bazı zorlayıcı adımları göstereceğiz. Bu protokolde, gömme, kesit alma ve gerçek böcek ziyareti deneyindeki farklı aşamaları size sunacağız.
Laboratuvar Bir'e, protokoldeki fiksasyon ve gömme aşamalarının dokuzuncu ile on birinci adımlarına gidelim. Dokuzuncu adım, Petri kaplarını ve kalıpları 60 °C'ye ısıtın. Onuncu adım, bir cımbızı ısıtın ve dokuları bir kaba eşit şekilde dağıtın.
Dokuların üzeri kapanacak şekilde daha fazla histo wax ekleyin. Adım 11'de, balmumunun oda sıcaklığında sertleşmesini bekleyin. Protokoldeki 12'den 19'a kadar olan adımları takip edin.
Sıcak plakaları açın ve eritilmiş histolojik wax hazır bulundurun. Örnekleri soğuk odadan çıkarın. 13. adımda, bir skalpel kullanarak bir doku wax bloğunu dikkatlice kesin.
Dilimlemeyi kolaylaştırmak için parçayı şekillendirin. 14. adımda, bloğun soğuk kısmını ve topuk kısmını ısıtarak birbirine kaynatın. Hazırlığın 4 °C'de sertleşmesini bekleyin.
Adım 15, wax bloğu altı ila sekiz mikrometre kalınlığında kesitler halinde kesin. Bir mikrotom kullanarak kesitleri tek bir uzun şerit halinde birbirine bağlayın. Şeridi kesin ve kağıda aktarın.
Bu aşamada, ilgi çekici kesitleri seçmek için tek tek kesitlerin bir stereo mikroskop altında incelenmesi mümkündür. İnceleme, dokularla veya eozin ile boyanmış kesitlerle kolayca gerçekleştirilebilir. Adım 17'de, lamların üzerine RNA içermeyen Milli Q suyu ekleyin.
Şeritleri daha küçük parçalara bölün ve lamların üzerine yerleştirin. Lamları ısıtıcı plakaya taşıyın. Adım 17, şeritlerin 42 °C sıcaklıktaki plakada bir ila iki dakika boyunca düzleşmesini sağlayın.
Suyu Kimwipe kullanarak süzün. Adım 19, dokuların lamlara yapışması için lamları 42 °C'de gece boyunca inkübe edin; in situ hibridizasyon 4.1 in-situ kesit protokolündeki 36 ila 48 arası ön işlem adımlarını uygulayın.
Adım 36 histolojik katmandaki depa kesitleri. Slaytlar, farklı kaplar arasındaki geçişi kolaylaştırmak için bir rafa eşit aralıklarla yerleştirilir ve kesitleryedehidratasyona tabi tutulur. Etanol serisi içinde, şiddetli karıştırma eşliğinde asetik anhidrit ekleyin.
Adım 45, asetik anhidrit işlemi 4.2 in situ hibridizasyon için hazırlık. Bir protokoldeki 49 ila 52. adımlar. Adım 51, pro one plus lamların yaşlandırılması.
Çözelti vizkozdur. Kabarcık oluşumundan kaçınmaya çalışın. Lamları nemli bir bölmede inkübe edin.
4.3 başlangıç. Hibridizasyon sonrası, protokoldeki 53 ile 72 arasındaki adımlar. 62. adımda, lamları burer blokla birlikte plastik bir kapta inkübe edin.
Adım 63, lamları sadece kaplayacak kadar bloklama çözeltisi ekleyin. Antikorlar, yaşlandırma yöntemi kullanılarak lamlara eklenir. Yaşlandırma işlemi yalnızca prob bon plus lamlarla çalışır. Benzer tasarımdaki lamlar için, Adım 65, kılcal kuvvetlerin anti dig antikor çözeltisini yukarı çekmesine izin verin.
Bu adım tekrarlanır. Daha önce yapıldığı gibi, 70. adımda sandviç işlemi uygulanır ve Western Blue çözeltisi çekilir. Anti-dig antikor çözeltisi için yaptığımız gibi, Western Blue çözeltisinin iki kez çekildiğine dikkat edin.
65. adım ve 71. adımda, lamları bir ila beş gün boyunca karanlıkta inkübe edin. Oda sıcaklığında, hibridizasyon sinyallerinin izlenmesi bir stereo mikroskop ile yapılabilir. Lamlar hâlâ sandviç formundayken, mor ila kahverengimsi lekelerin gözlemlenebilmesi gerekir.
CW istasyonu deneyinden elde edilen sonuçlar bu şekildedir. Sinyali burada mor veya kahverengimsi boyanma şeklinde görebilirsiniz.
Genel Bakış
Bu makale, Avrupa ladini dahil olmak üzere çeşitli bitki türleri için verimli ve uyarlanabilir olan modifiye bir DIG in situ hibridizasyon protokolü sunmaktadır. Protokol, farklı dokular ve türler arasındaki uygulanabilirliğini artırmak için RNase işlemi ve proteinaz K konsantrasyonundaki değişiklikler gibi belirli düzenlemeleri içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki biyolojisi
- Moleküler biyoloji
- In situ hibridizasyon teknikleri
Arka Plan
- In situ hibridizasyon, dokulardaki gen ekspresyonunu incelemek için değerli bir tekniktir.
- Geleneksel yöntemler zaman alıcı olabilir ve türe özgüdür.
- Mevcut protokollerde yapılacak modifikasyonlar, verimliliği ve çok yönlülüğü artırabilir.
- Bu çalışma, bir dizi bitki türü için uygun olan bir protokole odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Daha hızlı ve daha uyarlanabilir bir in situ hibridizasyon protokolü geliştirmek.
- Protokolün Norway spruce ve diğer bitki türlerine uygulanabilirliğini göstermek.
- Araştırmacılar için ayrıntılı prosedürel adımlar sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bitki dokularının gömülmesi ve kesit alınması.
- In situ analiz için ön işlem ve hibridizasyon basamakları.
- Sonuçları optimize etmek için spesifik reaktiflerin ve koşulların kullanımı.
- Hibridizasyon sinyallerinin mikroskop altında izlenmesi.
Temel Sonuçlar
- Modifiye edilmiş protokol, birden fazla bitki türünde in situ hibridizasyonu başarıyla kolaylaştırır.
- RNaz işlemi ve proteinaz K konsantrasyonundaki ayarlamalar, doku uyumluluğunu artırır.
- Hibridizasyon sinyallerinin net görselleştirmesi sağlanmıştır.
- Protokol, çeşitli uygulamalar için verimli ve tekrarlanabilirdir.
Sonuçlar
- Modifiye edilmiş DIG in situ hibridizasyon protokolü, bitki araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Çeşitli bitki dokularındaki gen ekspresyonunun hızlı ve etkili bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır.
- Gelecekteki çalışmalar, bitki biyolojisindeki daha geniş uygulamalar için bu protokolü temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Bu protokol, dokuya özgü ekspresyon paternlerini doğrulayarak erken keşif aşamasında hedef validasyonunu destekler ve bitki sistemlerinde yüksek çözünürlüklü uzamsal gen ekspresyon analizine olanak tanır. Radyoizotoplara ve kapsamlı türe özgü optimizasyonlara olan bağımlılığı azaltarak, türler arası karşılaştırmalı çalışmalar için tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği artırır. Yöntem, bitki tabanlı biyofarma hatlarında fenotipik tarama ve translasyonel biyobelirteç keşfi için mekanistik risk azaltma değeri sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Terapötik hipotezleri sorgulamak ve üreme gelişim yolaklarındaki gen işlevini netleştirmek için dokuya özgü mRNA lokalizasyonunu doğrular.
- Operasyonel Değer: Gymnosperm ve angiosperm modellerindeki erkek üreme organlarında gen ekspresyonunun doğrudan görselleştirilmesi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Arabidopsis, Brassica ve Norveç ladininin çiçek yapılarındaki homolog genlerin (örneğin, AP3 homologları) korunmuş ekspresyon modellerini göstererek öngörüsel güveni destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: DIG etiketli problar kullanarak tutarlı sinyal tespiti ile alt hibridizasyon analizleri için standartlaştırılmış doku kesitleri hazırlar.
- Tekrarlanabilirlik: Sinyal gücünü artırmak ve türler arasındaki değişkenliği azaltmak için RNaz işlemini ortadan kaldırır ve proteinaz K konsantrasyonunu ayarlar.
- Ölçeklenebilirlik: Minimal protokol düzenlemeleriyle farklı bitki türlerinde yüksek kapasiteli uygulamaları kolaylaştırarak platformun karşılaştırmalı genomikte yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Model angiospermlerden gymnospermlere uygulanabilirliği göstererek, bulguların biyokütle ve biyopolimer üretimi için ilgili odunsu çok yıllık sistemlere ekstrapolasyonunu destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Sekans homolojisini korunmuş gelişimsel yapılardaki uzaysal ekspresyona bağlayarak, gen fonksiyonu atamasındaki belirsizliği azaltır.
- Biyobelirteç Uyumu: Gen ekspresyonunun üreme dokularındaki fenotipik özelliklerle uzaysal korelasyonuna olanak tanıyarak, bitkisel moleküler tarımda biyobelirteç keşfini destekler.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, bitki tabanlı ekspresyon sistemlerinde ön aday bileşik taraması öncesinde hipotez odaklı hedef belirlemeye olanak tanıyarak, keşif biyolojisi aşamasına uygunluk gösterir.
- Keşif Biyolojisi: Aday genlerin belirli dokulardaki ve gelişim aşamalarındaki uzaysal ekspresyonunu doğrulayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Transgenik veya işlem görmüş dokularda bileşik etkilerinin izlenmesine yönelik analiz tasarımına bilgi sağlayan kantitatif uzaysal okumalar üretir.
- Analitikler: Görüntülemeye ve deneysel koşullar arası karşılaştırmalı analize uygun, saptanabilir kromojenik sinyaller (mordan kahverengiye) oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Üreme organlarındaki gen ekspresyon paternlerini gelişimsel fenotiplerle ilişkilendirerek, özellik doğrulama süreçlerindeki ilerleme kararlarını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Türler arası gen ekspresyon analizi için standartlaştırılmış ve uyarlanabilir bir iş akışı oluşturarak gereksiz optimizasyon çalışmalarını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Radyoaktif tehlikeler olmaksızın, doğrudan ve uzaysal olarak çözümlenmiş mRNA tespiti yoluyla hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: RNaz işlemini ortadan kaldırarak ve proteinaz K kullanımını standartlaştırarak tekrarlanabilirliği artırır, protokol hata oranlarını düşürür.
- Stratejik Değer: Keşif sürecinin erken aşamalarında net ekspresyon verileri sağlayarak hedef seçimindeki devam/dur kararlarını hızlandırır.
- Portföy Etkisi: Türler arası korunan ekspresyon modellerine dayanarak hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar ve alt uygulamalardaki başarı oranlarını artırır.
Uygulama Hususları
- Bitki materyalleri için histoloji, doku gömme ve kesit alma konularında uzmanlık gerektirir.
- Mikrotomlara, hibridizasyon fırınlarına ve kromojenik tespit sistemlerine erişime bağlıdır.
- Proteinaz K konsantrasyonunun doku yoğunluğu ve fenolik içeriğe göre standardize edilmesini gerektirir.
- Farklı türler ve prob uzunlukları için inkübasyon sürelerinin ve sıcaklıklarının uyarlanmasını içerir.
- Yüksek derecede lignifiye olmuş veya sekonder metabolit açısından zengin örneklerde, doku otofloresansı ve bileşik penetrasyonu ile sınırlıdır.
