Name: VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster kalp yapılarının floresan etiketleme protokolünü. Bu yöntem konfokal mikroskopi ile kardiyak morfoloji analizini geliştirir ve gelişim biyolojisi araştırmalarında değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar SI Bernstein (San Diego Eyalet Üniversitesi) Bu yazının hazırlanması ile ilgili eleştirel okuma ve yararlı önerileri için teşekkür ederim. Bu çalışma SI Bernstein, SDSU, R. Bodmer, BIMR NIH hibe programı tarafından desteklenen ve G. Batılı Devletler, Amerikan Kalp Derneği Ortaklık Vogler ve A. Cammarato bir post-doktora bursu.

Başlamadan önce <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> rahatlatıcı tamponu (10 mM EGTA içeren yapay Drosophila hemolimf (ADH) (&quot;Drosophilia&#39;daki kalpte görselleştirme&quot; bölümüne bakın)) </li><li> fiksatif (1x PBS içinde% 4 formaldehit) </li><li> PBSTx (% 0.1 Triton X-100 içeren PBS) </li><li> PBSTx uygun şekilde seyreltilmiş birincil ve türe spesifik floresan etiketli sekonder antikorlar </li></ol></li><li> Drosophila teşrih kalp tüpleri (erişkin sinek ve / veya larva) maruz <ol class="lalpha"><li> yarı sağlam Drosophila kalp hazırlanması &quot;Drosophila kalpte görselleştirme&quot; protokolü, veya </li><li> Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon aşağıdaki değişiklikler protokolü 1: Kullanım larva diseksiyonu sırasında ADH oksijenli ve ventral orta hat posterior iğne hafifçe yerinden. Larva ventral orta hat boyunca kesilir. Fiksasyon için önce herhangi bir doku çıkarmayın. </li></ol></li></ol> Floresan Boyama <ol><li> Tüm kalpleri ritmik oksijenli ADH yenerek olduğunu kontrol edin. Hızlı tampon rahatlatıcı ADH değiştirin. Kasılmaları inhibe edilir sağlamak için her kalp tüp inceleyin. </li><li> Fiksatif ile rahatlatıcı bir tampon yerine kalbini düzelt. Nazik sallayarak 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. (Larva hazırlık çalkalanması için herhangi bir adım gerekli değildir ve kardiyak doku bütünlüğü için zararlı olarak kabul edilebilir). </li><li> On dakika boyunca sürekli titriyor oda sıcaklığında PBSTx örnekleri üç kez yıkayın. </li><li> Yetişkinler için, kalan şey daha oval ve daha az yuvarlak olduğu gibi karın manikür ventral kenarlar dikkatle geri düzeltin. Ayrıca, karın ve göğüs arasındaki tek kesim, dikkatli ve temiz ayrı vücut bölümlerinin ve kalbin ön bölgeye en az zararla sağlar. Larva kalpleri için, dikkatle, ince forseps kullanarak yağ vücut çıkarın. Larva kalp, özellikle kırılgan ve diğer kasların veya bağ dokusu çok az destek beri yağ alınması, son derece dikkatli yürütülmelidir. Bu kalp zarar verebilir olarak trakeal dallar çıkarmayın. </li><li> 50-100 ul PBSTx içinde seyreltilmesi birincil antikor içeren kuyu ile 96 kuyu plakasına, merkezi bir konumda yer alan kalp tüpü ile temastan kaçınarak, kenarlarından kesilmiş sırt bölgesi karın manikür aktarın. Başına en fazla 12 numuneler yerleştirin. Sürekli ajitasyon ile 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Kuluçka de gecede 4 yapılabilir ° C. </li><li> Primer antikor çözümü çıkarın. 100 oda sıcaklığında sürekli sallayarak ul PBSTx on dakika boyunca kalpleri üç kez yıkayın. </li><li> Son yıkama tamponu kaldırılması ardından, Alexa594-Phalloidin (1:1000) ile desteklenmiş PBSTx 100 ul, ikincil antikor ekleyin. Oda sıcaklığında sürekli sallayarak bir saat süreyle inkübe edin. Örnekleri beyazlatma fluorofor önlemek için kapalı tutun. </li><li> Ikincil inkübasyon sonrasında oda sıcaklığında sürekli sallayarak PBSTx 100 ul ile on dakika boyunca kalpleri üç kez yıkayın. Örnekleri yıkama adımları boyunca kapalı tutun. </li><li> Triton X-100 kaldırılması için, 10 dakika süreyle PBS 100 ul içindeki kalpler kör olur son bir kez yıkayın. Örnekleri monte etmeden önce birkaç gün süreyle 4 ° C&#39;de karanlıkta saklanabilir. </li></ol> Yetişkin Kalpler Montaj <ol><li> 10 ul Vectashield montaj orta bir mikroskop lamı iki 18 x 18 mm kapak fişleri uyun. Lamelleri ~ 10-15 mm arayla olmalıdır. Iki lamelleri arasında orta montaj küçük bir üçüncü damla yerleştirin. </li><li> Üçüncü bir lamel merkezinde Vectashield 20 ul yerleştirin. </li><li> Manikür aşırı kenarlarından dikkatlice PBS yıkama solüsyonu her kalplerin kaldırmak ve yavaşça üçüncü lamel üzerine montaj orta damla kalp tarafı aşağı yerde. Lamel başına en fazla beş damla kalpleri yerleştirin. </li><li> Bütün kalpleri aşağı bakacak şekilde sağlamak için bir mikroskop altında kontrol edin. </li><li> Kalpleri içeren lamel dikkatlice ters ve hızlı lamelleri çifti içeren, kalp tüpleri sigortalar ile lamel çifti arasında Vectashield damlacık damlacık. Slaytta yer &quot;Köprü&quot; lamelleri tarafından oluşturulmalıdır. Kalpleri bir lamel ve mikroskop lamı arasında askıya alınacaktır. </li><li> Kalpleri şimdi yukarı gelecek sağlamak için bir mikroskop altında kontrol edin. </li><li> Lamelleri oje ile kenarlarına sabitleyin. </li><li> Kalpleri şimdi floresan veya konfokal mikroskobu aracılığıyla görüntülü olarak hazırız. </li></ol><ol><li> Bir mikroskop lamı üzerine bir damla (~ 20 ul) Vectashield yerleştirin. </li><li> Tungsten iğneler kullanarak aşağı Vectashield ve yönlendirmek onları dorsal tarafına içine iki larva örneklerinin dikkatle kadar veri transferi. </li><li> Bireysel montaj orta örneklerin dışına sürükleyin ve paralel olarak her hizalamak. </li><li> Örneğinin karşı taraf bir lamel yerleştirin. Forseps kullanarak, arka lamel bir tarafta döşeme ve böylece bir köprü oluşturan ön lamel aşağı düşürerek ilk kez, üst üste üçüncü bir lamel yerleştirin. Kılcal güçleri larva kalbin düzgün hizalama yardımcı anterior posterior Vectashield akışı neden olacaktır. </li><li> Oje, kenarlarında yer Fix tüm lamelleri ve dikkatli bir şekilde 20-30 ul Vectashield lamelleri arasındaki boşluğu doldurmak. </li><li> Mühür oje ve mağaza ile 4 ° C veya -20 ° C&#39;de uzun süreli depolama için </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Doğru çalıştırıldığında, dorsal geminin tüm bileşenleri ve ilgili dokuların sağlam kalır ve kolayca görüntülenebilmekte. Eşiğe düzeyde olmalıdır. Çok iyi yetişkin, ventral longitudinal kas tabakası lekeleri için önemli bir sinyal üretir (Şekil 1 ve Şekil 2). Altta yatan dairesel kardiyomiyositlerde Bununla birlikte, ventral örten tabakanın olduğu gibi yoğun bir sinyal üretmek için değil eğilimindedir. Yetişkin kalp ön konik odasına &quot;miyositler kontraktil malzemenin önemli bir miktarda içerir ve dolayısıyla, bu bölgede kalp tüp kalan en sağlam göreceli olarak görünür. Larva kalp yetişkin kontraktil kardiyomiyositlerde (Şekil 3) benzer bir helezonik myofibrillar düzenleme gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="Şekil 1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="Şekil 1b" /> Şekil 1: Üst. Gösteren bir yetişkin bir Drosophila melanogaster ifade miyozin-GFP tüm kalp tüp floresan mikrografı. Görüntü Apotome bir kayma modülü ile donatılmış bir Zeiss Imager Z1, floresan mikroskop ile alınmıştır. Miyozin-GFP yeşil gösterilir, aktin AlexaFluor ® 594 Phalloidin (kırmızı) ve α-aktinin ile boyandı anti-α-aktinin antikor (mavi) ile etiketlenir. Hazırlık prosedürü iyi korunmuş yapıları ile kalp örneklerinin kurtarma izin unutmayın. CC = konik kamara; AM = alary kas, V = dahili valf; VLL = ventral uzunlamasına kas tabakası. Alt. 3. sadece kasılma kardiyomiyositlerde helezonik myofibril düzenleme gösteren ventral longitudinal tabakasının altındaki kalp karın segment üzerinden CC yetişkin kardiyak tüpün bir bölge. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">buraya tıklayın</a> Şekil 1a daha büyük bir versiyonu için, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">burada</a> daha büyük bir rakam 1b sürümü için <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: AlexaFluor ® 594 Phalloidin (kırmızı) ve bir anti-Pericardin (kollajen tip IV) (yeşil) antikor ile boyandı yetişkin kalp anterior kısmı Temsilcisi konfokal yığınları. Pericardin muhtemelen ventral kas tabakası uzunlamasına odaklı myofibrils kaynaklanan, ventral yüzeyi boyunca kalp ile ilişkilidir. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">buraya tıklayın</a> Şekil 2 daha büyük bir versiyonu için. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: Bir floresan segment bir sahne üç Drosophila larva uygun kalp A7 mikrografı. Görüntü Apotome bir kayma modülü ile donatılmış bir Zeiss Imager Z1, floresan mikroskop ile alınmıştır. Aktin AlexaFluor ® 594 Phalloidin (yeşil) ve α-aktinin ile etiketlenmiş anti-α-aktinin antikor (kırmızı) ile boyandı. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">buraya tıklayın</a> daha büyük bir şekil 3 sürümü için.

<ol><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li>
<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
<li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%2C+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change.</a> J. Morphol. 2, 351-399 (1936).</li>
<li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster%22">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster</a>. , Wiley. New York. (1950).</li>
<li>Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , Academic Press. New York. (1978).</li>
<li>Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+transducer+mutations+differentially+affect+motor+function%2C+myofibril+structure%2C+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).</li>
<li>Taghli-Lamallem, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+deficiency+in+Drosophila+reduces+lifespan+and+causes+a+dilated+cardiomyopathy+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype.</a> Aging Cell. 2, 237-249 (2008).</li>
<li>Kelso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 7150, 151-156 (2007).</li>
<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

Burada Drosophila melanogaster dorsal damar ve görüntüleme için floresan veya konfokal mikroskopi ile ilgili dokuların hazırlanması ve boyanması için yararlı bir protokol mevcut. Rafine edilmiş ve yaygın olarak larva ve yetişkin Drosophila kalp tüpleri in situ görüntüleme iyi bir çözüme izin verir etkin boyama laboratuarımızda istihdam adımların kısa ve öz bir açıklama sağlamalıdır . Diğerleri kısaltılmış biçim, 2, 3, 4 benzer yöntemler var. Önemli ek ay...

<table><tbody><tr><td>Etilen glikol-bis (2-amino-etileter) -N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetra-asetik asit (EGTA)</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit, %10, metanol içermeyen, Ultra Pure</td><td>Reaktif</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 falloidin</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>DAPI içeren Floresan için Vectashield&amp;#174; Montaj Ortamı</td><td>Reaktif</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten iğneler</td><td>Reaktif</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>İğne tutucu</td><td>Reaktif</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

ve floresan etiketleme drosophila kalp yapıları

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Dorsal damar, kalp, kasılma kardiyomiyositlerde, yetişkinlerde kalp duvarı, destekleyici alary kasları ve, ventral uzunlamasına kas hücrelerinin bir katman her tarafında hizalamak perikardiyal hücreleri tek bir tabaka oluşan tübüler bir yapıdır. Kasılma lifleri ev myofibrils ve homolog ekstraselüler matriks bileşenleri ile etkileşim sitoskeletal / submembranous protein kompleksleri, yoğun paketlenmiş demetleri de dahil olmak üzere kas hücre mimarisini bileşenlerinin korunmuş. Burada disseke larva ve yarı sağlam yetişkin kalbini fiksasyon ve özellikle miyokard elemanlarının floresan etiketleme için bir protokol tarif<em&gt; Drosophila</em&gt;. Özellikle larva kalplerinde sarkomerik F-aktin ve α-aktinin etiketleme göstermektedir. Ayrıca, vahşi tip yetişkin kalplerinde, yetişkin sinekler ifade ve α-aktinin ve pericardin, tip IV ekstraselüler matriks kollajen F-aktin ve α-aktinin miyozin-GFP etiketlenmesi. Özellikle dikkat taşıma en aza indirir ve kalp tüpleri ve ilgili dokuların bütünlüğünü korumak için fırsat optimize yarı sağlam yetişkin kalpleri için bir montaj stratejisi verilir. Bu hazırlıklar, floresan ve konfokal mikroskobu ile görüntüleme için uygundur. Genel olarak, bu yordamı dikkatli ve ayrıntılı bir analiz için güçlü bir genetik çözülebilir bir model sistem kalbin yapısal özellikleri sağlar.

Burada larva ve yetişkin kalp tüplerin farklı unsurları floresan etiketlenmesi için temel bir protokol tanımlamak<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;. Bu örnekler, floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntüleme için çok uygundur. Bu teknik, güçlü bir model organizma kalplerin özellikleri ayrıntılı yapısal analiz izin verir.

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

Drosophila melanogaster dorsal damarı veya kalbi, tek bir kontraktil kardiyomiyosit tabakası, perikardiyal hücreler ... ile oluşmuş tübüler bir yapıdır.

Merhaba, ben Burnham Tıbbi Araştırmalar Enstitüsü'ndeki Gelişim ve Yaşlanma programında yer alan Ralph Boer Laboratuvarı'ndan Nikita Ari. Ben de aynı laboratuvardan Gil. Bugün size larval ve yetişkin Presolar kalp yapılarının floresan işaretleme prosedürlerini göstereceğiz.Yetişkin drosophila'da kalp yapılarını floresan ile işaretlemek amacıyla, konfokal veya floresan mikroskopi aracılığıyla morfolojik ve yapısal analizler yapmak için kalp tüplerini hazırlamak üzere laboratuvarda bu prosedürü uygularız. İlk olarak, vücut segmentlerini ayırmak için yarı sağlam bir yetişkinin toraks ve abdomeni arasında tek bir kesi yapın. Ardından, yetişkin kütikülünün sarkan ventral kenarlarını kırpın.Ardından, ergin veya diseke edilmiş larva örneklerini birincil ve ikincil antikorlarla transfer edin ve işaretleyin. İşaretlemenin ardından, yıkanmış ergin örnekleri kütikül kenarlarından tutarak ve bir lameli üzerindeki bir damla vector shield üzerine kalp tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirerek monte edin; lameli, bir lam üzerinde iki lamla desteklenmiş bir damla ortamın üzerine ters çevirerek bir köprü oluşturun. Bu işlemle kalp dik konumda askıda kalacaktır; larva kalplerinin montajı için de aynı yöntem uygulanır.Numuneleri ventral tarafları aşağı bakacak şekilde bir lam üzerine aktarın ve lamın her iki yanına iki adet kapatma camı yerleştirin. Son olarak, üçüncü bir kapatma camını önce larvaların posterior uçlarına yakın olan kapatma camının üzerine yerleştirerek bir köprü oluşturun. Kalpler artık görüntüleme için hazırdır.Bu prosedüre başlamadan önce, bu serideki başka bir video protokolünde açıklandığı üzere A DH içeren A DH gevşetme tamponunu; 1 X-P-B-S-P-B-S, TX içinde %4 formaldehitten oluşan 10 milimolar EGTA fiksatif ile birlikte, uygun şekilde seyreltilmiş primer antikorlar ve floresan işaretli sekonder antikorlarla birlikte hazırlayın. PBS TX içerisinde, videodaki drosophila'da atan kalbin görüntülenmesi ve drosophila larva NMJ diseksiyon protokolü videolarında gösterilen yarı-intakt drosophila kalp preparasyonunu takip ederek, kardiyak tüpleri açığa çıkarmak için yetişkin ve larva drosophila diseksiyonu yapın. Ancak bazı modifikasyonlarla, larva diseksiyonu sırasında oksijenle zenginleştirilmiş a DH kullanın ve posterior pinleri larva ventral orta hattından hafifçe kaydırın.Ventral orta hat boyunca kesin. Sonraki adımlardaki fiksasyondan önce herhangi bir dokuyu çıkarmayın. Tüm kalplerin oksijenlendirilmiş A DH içinde ritmik olarak kasılıp gevşediğini mikroskop altında kontrol ederek etiketleme prosedürüne başlayın. Ardından, A DH'yi hızla gevşetme tamponu ile değiştirin ve kasılmaların inhibe edildiğinden emin olmak için her bir kardiyak tüpü yeniden inceleyin.Gevşetme tamponunu fiksatif ile değiştirerek kalplerin tespit işlemine geçin. Hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Larval hazırlıklar için herhangi bir adımda çalkalamanın gerekli olmadığını, hatta kalp dokusu bütünlüğüne zarar verebileceğini unutmayın.20 dakika sonunda fiksatifi uzaklaştırın ve örnekleri P-B-S-T-X ile her seferinde 10 dakika olmak üzere üç kez yıkayın. Erişkinler için oda sıcaklığında, sürekli çalkalama altında, abdomen ile thorax arasından dikkatli ve temiz bir şekilde tek bir kesi yapın. Kalbin ön bölgesine minimum düzeyde zarar verildiğinden emin olmak için her iki vücut segmentini birbirinden ayırın.Kalbin konik odacığının bulunduğu ön abdominal bölgeyi kesmemeye dikkat edin. Temiz bir kesim yapıldığından emin olmak için örneği mikroskop altında inceleyin. Ardından, abdominal kutikülün sarkan ventral kenarlarını, kalan kısım daha eliptik ve daha az yuvarlak olacak şekilde dikkatlice düzeltin.Larva kalpleri için ince uçlu pensler kullanarak yağcisimini dikkatlice uzaklaştırın. Bu işlemi son derece dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Larva kalbi özellikle hassastır ve diğer kaslar veya bağ dokusundan çok az destek aldığı için, kalbe zarar verebileceğinden trake dallarını çıkarmayın.Ardından, PVS TX içerisinde seyreltilen ve 96 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuk başına 50 µL olacak şekilde dağıtılan primer antikor ile inkübasyon yapın. Erişkin sinekler için, merkezde yer alan kardiyak tüpe dokunmadan, kırpılmış dorsal kütikülü kenarlarından tutun ve plaka üzerine aktarın. Kuyucuk başına en fazla 12 örnek yerleştirin ve sürekli ajitasyon altında oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.Larva örneklerini pensle kenarlarından tutun ve PBS-T-X dolu kuyucuğa aktarın. İnkübasyon sonunda larva örneklerini sallamayın. Birincil antikor solüsyonunu uzaklaştırın.Kalpleri oda sıcaklığında, her seferi 10 dakika sürecek şekilde üç kez 100 µL PBSTX ile yıkayın; son yıkamanın ardından, Alexa 594 ile desteklenmiş PBS tx içindeki 100 µL sekonder antikoru ekleyin. Florofor solmasını önlemek için örnekleri bundan sonra kapalı tutun ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Sekonder antikor solüsyonunu uzaklaştırın ve kalpleri oda sıcaklığında, her seferi 10 dakika sürecek şekilde üç kez 100 µL PBSTX ile yıkayın.Son olarak, kalpleri 10 dakika boyunca 100 µL PBS ile durulayarak TRITTON X 100'ü uzaklaştırın. Numuneler, lama monte edilmeden önce birkaç gün boyunca dört °C'de karanlıkta saklanabilir. İlk olarak, montaj için lamı hazırlayın.Bir mikroskop lamına, eşit aralıklarla üç adet 10 µL vector shield montaj medyumu damlatın. Kapak lamlarını yaklaşık 10 ila 15 mm ara ile tutarak, dıştaki damlaların üzerine iki adet 18 x 18 mm boyutunda kapak lamı yerleştirin.Ek olarak, üçüncü bir lamelin merkezine 20 µL vector shield yerleştirin. Ardından, diseke edilmiş yetişkin sineği kütikülün uç kenarlarından tutun. Sineği PVS yıkama solüsyonundan dikkatlice çıkarmak için, kalp tarafı aşağı gelecek şekilde üçüncü lameldeki montaj ortamı damlasının üzerine nazikçe yerleştirin; lameldeki damla başına beş kalpten fazlasını koymayın.Kalpleri, lamel üzerindeki damlacığın üzerine yerleştirdikten sonra, tüm kalplerin aşağı baktığından emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. Şimdi, kalplerin bulunduğu lameli dikkatlice ters çevirin ve kalpleri içeren ters çevrilmiş lameldeki damlacığın, lameller arasındaki boşlukta yer alan vektör kalkanı damlacığıyla birleşmesini sağlayacak şekilde lameli hızlıca slayt üzerine yerleştirin. Bu şekilde eşleştirildiğinde, üç lamel bir köprü oluşturur.Kalpler, orta lamel ile mikroskop arasında askıya alınacaktır. Yetişkin sinek kalplerinin oje kullanılarak yukarıya baktığından emin olmak için lamı köprünün altına yerleştirip mikroskop altında kontrol edin. Lamellerin kenarlarını sabitleyin.Kalpler artık floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntülenmeye hazırdır. Larva kalplerini monte etmek için, ince bir penset kullanarak mikroskop lamı üzerine yaklaşık 20 µL BTA shield damlatın. Larvaları kütikül kenarlarından kavrayın ve dikkatlice damlanın içine aktarın.Tungsten iğneler kullanarak larvaları sırt üstü gelecek şekilde konumlandırın. Bir lam üzerine en fazla iki larva yerleştirin. Ardından, her bir örneği montaj ortamından dışarı doğru sürükleyin ve larvaları birbirine paralel hale getirin.Penset kullanarak, hizalanmış kalplerin her iki yanına birer lamelli kapatıcı yerleştirin. Üçüncü bir kapatıcı lameli önce bir ucunu ön kapatıcının üzerine koyup ardından arka kapatıcıya doğru indirerek üst kısma yerleştirin. Böylece bir köprü oluşturun.Kılcal kuvvetler, Vector Shield'ın arkadan öne doğru akmasını sağlayarak larval kalbin uygun şekilde hizalanmasına yardımcı olacaktır. Son olarak, tüm kapatma lamlarının kenarlarını oje ile sabitleyin ve kapatma lamları arasındaki boşluğu 20 ila 30 µL Vector Shield ile dikkatlice doldurup oje ile mühürleyin; kısa süreli saklama için 4 °C'de veya daha uzun süreli saklama için -20 °C'de muhafaza edin. Doğru şekilde uygulandığında, dorsal damarın tüm bileşenleri ve ilişkili dokuları sağlam kalmalı ve kolayca görselleştirilebilmelidir.Yetişkinlerde arka plan floresansı minimum düzeyde olmalıdır. Ventral longitudinal kas tabakası çok iyi boyanır ve belirgin bir sinyal üretir. Ancak, altta yer alan sirküler kardiyomiyositler, üstteki ventral tabakadan gelen kadar yoğun bir sinyal üretme eğiliminde değildir.Yetişkin kalbin anterior konik odacığındaki miyositler önemli miktarda kontraktil materyal içerir ve sonuç olarak bu bölge, kardiyak tüpün geri kalanına kıyasla en sağlam bölge olarak görünür. Larva kalbinin görüntüsü, sarmal bir miyofibriler düzenleme göstermektedir. Yetişkin kontraktil kardiyomiyositlere benzer şekilde, oval kalplerin floresan ve konfokal mikroskopi için hazırlanması ve boyanmasına yönelik protokolünüzü az önce gösterdik.Bu prosedürü gerçekleştirirken, gereksiz işlemlerden kaçınmak önemlidir. Bu, kardiyak yapının daha iyi şekilde bozulmadan korunmasını sağlayacaktır. Bu protokol yalnızca bir başlangıç noktası görevi görmektedir.Diğer tüm immünohistokimyasal işlemlerde olduğu gibi, farklı antikorlar farklı koşullar gerektirir ve bireysel olarak optimize edilmeleri gerekir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve boyama işlemlerinizde başarılar dileriz.

fluorescent-labeling-of-drosophila-heart-structures

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Larva ve yetişkin kalpte görüntülenmesi için gerekli...

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

Biz fiksasyon, gömme, kesit, bir süreç tarif etmek, ve geç dönem...

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS)...

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Mevcut protokol, OCT görüntüleme ve optogenetik kalp pacing için kalpte eNpHR2.0 veya ReaChR opsinlerini eksprese eden Drosophila melanogaster'in oluşumunu tanımlamaktadır. Farklı gelişim aşamalarında canlı hayvanlarda restore edilebilir kalp durması, bradikardi ve taşikardi simülasyonu da dahil olmak üzere Drosophila OCT görüntüleme ve kalp atışı modülasyonu için ayrıntılı talimatlar bildirilmiştir.

Kardiyak Fonksiyonun Görüntülenmesi ve Optogenetik Kontrolü için Drosophila melanogaster Modellerinin Geliştirilmesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Drosophila kalp kesiti ve floresan görüntüleme protokolü, kalp yapısını ve patolojilerini incelemeyi basitleştirir. Bu yaklaşım, geleneksel diseksiyon için gereken teknik uzmanlığı atlayarak basit kesit alma, boyama ve görüntülemeyi içerir. Erişilebilirliği artırarak Drosophila'yı daha geniş bilimsel topluluk içinde kardiyak ile ilgili araştırmalar için daha yaygın olarak kullanılabilir bir model haline getirir.

Kriyoseksiyon ile Drosophila Kalp Floresan Boyama için Yeni ve Etkili Yöntem

Öğrenin Drosophila melanogaster kalp yapılarının floresan etiketleme protokolünü. Bu yöntem konfokal mikroskopi ile kardiyak morfoloji analizini geliştirir ve gelişim biyolojisi araştırmalarında değerli bir araç sunar.

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

Daha fazla video keşfet