Name: Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Öğrenin trichothecene mikotoksinlerini gıda örneklerinde elektrokimyasal immünoassay ile tespit etme yöntemini. Bu protokol yüksek duyarlılık ve özgüllük sağlayarak gıda güvenliğine katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, işbirliği ve lojistik destek için, Analitik Kimya, Roma Üniversitesi &quot;Tor Vergata&quot; laboratuvar Nancy Downer ve tüm üyelere teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, AB projesi &quot;BioCop&quot; tarafından desteklendi.

1) Engelleme kaplı Manyetik Boncuk: Kaplı Manyetik boncuk engellemek için takip devam edin: <ol><li> 2 ml Eppendorf tüpleri bir dizi hazırlamak; </li><li> (Vorteks sıkıyorlar ama) örnek dönen mikser ile kaplı manyetik bilye (kaplı manyetik boncuk hazırlanması için eke bakınız) homojenize </li><li> Homojenizasyon hemen sonra, her biri ayrı Eppendorf tüp içine kaplı manyetik bilye pipet 10 ul; </li><li> Kümesinin her Eppendorf tüp içine çözümü engelleme yağsız süt 1 ml ekleyin; </li><li> Dönen örnek karıştırıcı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe manyetik boncuk edelim; </li><li> Çözümü engelleme kaldır: 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyetik boncuk görmek) koymak manyetik manyetik partikül konsantratör tüp bunu dikkatle boncuk bozulmamış bırakarak, süpernatantı pipetle; </li><li> PBS + NaN 3 + BSA her tüp için depolama çözümü olarak 1 ml ekleyin; </li><li> 4 kaplı ve bloke manyetik boncuk Mağaza ° C (kaplı manyetik boncuk 4 ° C &#39;de en az 2 ay için kararlı olduğunu lütfen unutmayın); </li></ol> 2) kalibrasyon eğrisi inşaat ve numune analizi için manyetik boncuk İmmünolojik zinciri Ölçümü için hazır manyetik boncuklar var aşağıdaki gibi devam edin: <ol><li> Kaplı ve bloke çözüm, analiz için gidiyoruz her örnek ayıklamak için bir Eppendorf tüp (2 ml) ele alalım; </li><li> Her çalışma kalibrant çözeltisi için ekstra bir Eppendorf tüp; </li><li> Manyetik boncuk, kullanmadan önce dönen bir örnek karıştırıcı 2 dakika süreyle homojenize; </li><li> Manyetik parçacık konsantratör kullanarak depolama sıvı çıkarın; </li><li> PBS / BSA yıkama solüsyonu ile manyetik bilyeler üç kez yıkayın. Sıvı çamaşır çıkarın; </li><li> Rekabet adım: yıkanmış manyetik boncuk, örnek hazırlanmış ayıklamak 200μl içeren her tüp için ekleyin; her bir örnek için bir manyetik boncuk tüp kullanın. Her bir standart çözüm için aynı prosedürü tekrarlayın. Her manyetik boncuk tüp 200 ul monoklonal antikor çözüm ekleyin. Manyetik boncuk, oda sıcaklığında dönen örnek karıştırıcı yarım saat boyunca inkübe edelim; </li><li> Eppendorf tüpleri rekabet adım için kullanılan çözüm çıkarın; </li><li> Adım Etiketleme: Her bir manyetik boncuk Eppendorf tüp etiketli ikincil antikor 400μl ekle . Manyetik boncuk, oda sıcaklığında dönen örnek karıştırıcı yarım saat boyunca inkübe edelim; </li><li> Eppendorf tüpleri çözümü etiketleme çıkarın; </li><li> Manyetik boncuk, PBS / TWEEN ® 20 yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın. Sıvı çıkarın; </li><li> DEA tampon 100μl manyetik boncuklar her kısım süspanse edin. Şimdi manyetik boncuk elektrokimyasal ölçüm adım için hazır; </li></ol> 3) Meclis Çoklayıcı (Mux) seçenekleri ile PalmSens Lütfen dikkat: substrat hidrolizi enzimatik ürün elektrot yüzeyi fauller, bu nedenle yeni bir elektrot her bir ölçüm için gerekli. <ol><li> PalmSens seri kablo aracılığıyla bir PC dizüstü bağlayın; </li><li> PalmSens CH8 Multiplexer 9-DIN fişini. </li><li> CH8 Multiplexer ile sekiz kanal Mux elektrik kontağı seri kablo bağlayın; </li><li> Sekiz mıknatıs blok yerleştirin elektrot şerit. Mıknatıs her çalışma elektrotları altında her yere dikkat edin (not, her elektrot için tek bir mıknatısın manyetik parçacık aksi çalışma elektrot alana konsantre olmaz şarttır); </li><li> Sekiz kanal Mux elektrik temas elektrotlar şerit takın; </li></ol> DPV ölçümü için uygun kutulara aşağıdaki parametreleri kullanın: E başlar: 0 (V); E sonu: 0.6 (V); D adım: 0.016 (V); E darbe: 0,0339 (V); E Klima: 0 (V); E birikimi: 0 (V); Tarama hızı : 0.1 (V / s); T darbe: 0.06 (lar); T Klima: 0 (lar); birikimi T: 0 (s), T dengeleme: 8 (ler). 4) Enzimatik reaksiyon ve Elektrokimyasal Ölçüm <ol><li> Eppendorf tüp manyetik boncuk iyi dağılmış bir süspansiyon elde etmek için elektrokimyasal ölçüm adım için hazır manyetik boncuk içeren her hafifçe sallayarak homojenize; </li><li> Homojenizasyon sonra hemen her Eppendorf Pipet, ilgili çalışma elektrot yüzeyine manyetik boncuk dağılım 20 ul bir kısım. 20 farklı Eppendorf tüpleri (örneğin sekiz elektrot kullanımı sekiz farklı Eppendorf) alınan manyetik boncuk ul bir şerit kullanımı her elektrot için; </li><li> Ilk elektrot üzerinde 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. 2 dakika geri sayım başlayın. 14 saniye sonra ikinci bir elektrot 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. Daha fazla 14 saniye sonra, üçüncü elektrot 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. Aynı zamanda int devamerval son elektrot (: 14 sn aralıklarla substrat her bir kısım düşmesi anlamına gelir) kadar (14 saniye). 14 saniye zaman aralığı potansiyostat ölçüm gerçekleştirmek için gerekli olan süre olarak hesaplanır; nota, her bir sensör 80 ul çözüm, çalışma ve referans elektrot kapsamalıdır. Ayrıca, her bir sensör için çözümler komşu elektrot çözümleri ile temas edilmemelidir. </li><li> 2 dk enzimatik substrat çözeltisi ilk ek geri sayım sonra, elektrokimyasal ölçümü başlatmak; </li><li> Her çözüm için geçerli zirveleri (uA) elde etmek için PalmSens Lite yazılımı kullanın. </li></ol> 5) Hesaplama Bir lojistik 4 parametreleri denklemi kullanarak bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması ve bilinmeyen numuneyi içeren her Eppendorf tüp mililitrede nanogram HT-2/T-2 toksin miktarı toplam konsantrasyonu hesaplamak. Calibrants konsantrasyonu (ng / ml) karşı tepe yüksekliği (uA), deneysel veriler, doğrusal olmayan dört parametreli lojistik Sigma Arsa 8.0 veya kullanarak denklem arsa (1) ((4-PL) kullanarak takılacak Kaleidagraph). Doğrusal olmayan 4-PL modeli genellikle ligand bağlayıcı deneyleri (LBAs) 6 tanımlamak için benimsenmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> (1) Sigma Arsa eğrisi uyum programı tarafından verilen a, b, y0 lojistik parametreleri x0 vardır. Seyreltilmiş numune ekstresi çözümü HT-2/T-2 toksin toplam miktarın içeriğini hesaplamak için açiklanabilir formülü kullanın <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> (2) x milliltre ortalama nanogram lojistik 4 parametreleri Denklem (ng / ml) hesaplanan Seyreltilmiş ekstrakt çözüm HT-2/T-2 toksinlerin toplam miktarın kütle konsantrasyonu y uA geçerli değeri bilinmeyen numune için elde edilen Ek 6) Kaplı Manyetik Boncuklar Kaplamalı Manyetik boncuklar var aşağıdaki gibi devam edin: Prosedürü Yıkama <ol><li> Tosylactivated Dynabeads homojenize ® M-280 (stok solüsyonu 2 x 109 boncuk / ml) 1 dakika (köpük kaçının) (lütfen manyetik boncuk konsantrasyon sağlamak için tekrarlanabilirliği her zaman aynı olması gereken sallayarak ve vorteks (maksimum hız) ölçümü); </li><li> Hemen 2 ml Eppendorf tüpe 1 mL pipetle yukarıdaki homojenize boncuk; </li><li> 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyetik boncuk görmek) koymak manyetik manyetik partikül konsantratör tüp Yeri; </li><li> Dikkatlice boncuk bozulmamış bırakarak, süpernatantı pipetle; </li><li> Eppendorf tüp manyetik parçacık konsantratör çıkarın ve 1 ml 0,1 M borat tamponu pH 9.5 boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. 2 dakika süreyle, 2 dakika süreyle dönen örnek mikserde yavaşça karıştırın; </li><li> Süpernatantı kapalı Pipet; </li><li> Pipet borat tampon çözelti Eppendorf tüp içine 1 ml. Manyetik boncuk kaplama adım için hazır; </li></ol> Kaplama prosedürü <ol start="8"><li> Inkübe manyetik boncuk ve HT-2-KLH çözümü için; KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok manyetik boncuk, 1 ml çözelti) (375 mg / ml son HT-2-KLH konsantrasyon) ile HT-2 konjuge 600 ml 20h 37 ° C * Örnek mikser dönen yavaş eğim rotasyon; </li><li> Inkübasyon yer süpernatantı kapalı manyetik parçacık konsantratör ve pipet tüp sonra; 1 ml PBS / BSA tampon çözelti ile kaplı boncuklar iki kez yıkayın. Her yıkama arasında PBS / BSA çözüm çıkarın. Tüm yıkama adım 5 dakika boyunca devirli manyetik boncuk ve PBS / BSA yapıldı; </li><li> 1 ml TRIS / BSA tampon çözeltisi kullanılarak manyetik boncuk bir kez yıkayın. TRIS / BSA çözüm çıkarın. 37 az 4 saat süreyle mikser dönen manyetik boncuk ve TRIS / BSA tampon ayarlayarak bu adımı yürütmek ° C; </li><li> Yenilenir 1 ml (4 ° C) PBS / BSA tampon çözelti buzdolabında saklanır kullanarak manyetik boncuk bir kez yıkayın PBS / BSA çözüm çıkarın. Oda sıcaklığında 5min için mikser dönen manyetik boncuk ve PBS / BSA tampon bu adımı yürütmek; </li><li> Adım, tüm yıkama sıvı eklemek kaldırmak ve yıkadıktan sonra 1 ml PBS + NaN 3 + BSA depolama sıvı olarak; </li><li> Kaplı manyetik bilye Mağaza, 4 ° C (kaplı manyetik boncuk 4 en az 2 ay için kararlı olduğunu lütfen unutmayın ° C); </li></ol> * Bu amaç için güç kaynağı için kablo ekleme sağlayan bir delik ile donatılmış fırında karıştırıcı yerleştirilir. Alternatif olarak, mikser ° C 37 ° mostatlı bir odada yer olabilir 7) Numune hazırlama ve ekstraksiyon 25 g (bebek maması ya da kahvaltılık tahıllar) ince öğütülmüş örnekblender kavanoza ighed ve yüksek-hızlı blender 3 dakika asetonitril / su solüsyonu (86/14) 100 ml ile ekstrakte. 5 dakika için 4000 rpm (3000 gr), 8 ml süpernatant Mycosep sütun ile çekilen ve saflaştırılmış santrifüj sonra, temizlenmiş özü 4 ml azot akışı altında kurutuldu. Kurutulmuş numuneler -30 ° C&#39;de birkaç ay saklanabilir. 8) Örnek sulandırıldıktan Kahvaltılık tahıl ürünleri Sulandırın 40 ml PBS pH 7.4 ile kuru kahvaltı gevreği ekstresi (tahıl bazlı gıda yetişkin tüketimi için mukadder). Bu şekilde sözde yasal sınırın (200 ng / g) eşit toksin konsantrasyonu ile örnek bir çalışma aralığı ortasına düşen bir sinyal ölçüm adımda verecektir. Bebek maması 4 ml PBS ile sulandırın kurutulmuş bebek maması ekstresi (tahıl bazlı gıda bebek tüketimi için mukadder). Bu şekilde sözde yasal sınırın (20-25 ng / g) eşit toksinlerin bir konsantrasyon ile örnek bir çalışma aralığı ortasına düşen bir sinyal ölçüm adımda verecektir.

<ol><li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Letters%22%5BJournal%5D)">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li>
<li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals%5BTitle%5D)+AND+%22Fresenius+J.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li>
<li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li>
<li>FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, , Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).</li>
<li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li>
</ol>

Biyomoleküler tanıma prob olarak antikorların kullanımı yaygın bir algılama teknolojileri kullanımı gördü; ELISA&#39;larla ve MEIAs immünokimyasal algılama yöntemleri, en çok kullanılan ve uygulanan birçok laboratuvarda 7 platformlar arasında, günümüzde,. Bu yaklaşımların son yıllarda olağanüstü bir duyarlılık ve özgüllük, birçok araştırma grubu birincil hedefi elde ederken, kendi performansları ve iyileştirme ve optimizasyon olmuştur. Bu protokolde mi...

Reaktifler <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Potasyum klorür </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum dihidrojen fosfat </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Disodyum hidrojen fosfat </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 susuz </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (% 99.5) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroksimetil] aminomethane </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (sığır serum albumin) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> TWEEN 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftil fosfat disodyum tuzu </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Yağsız süt engelleme çözümü olmayan yağlı süt kuru maddesi </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge: </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> HT-2-KLH konjugatı HT-2 toksin pozisyon 3 ve 4 serbest OH grupları N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) ve aktif HT-2 toksin tarafından aktive edilmiştir CDI yöntemi ile elde edildi protein (KLH) aminogroups ile istikrarlı bir carbammate bağ oluşturmak için tepki sağlar. </td></tr><tr><td> İkincil etiketli antikor atı anti-fare IgG (H + L) ile konjuge Alkalen Fosfataz, konsantrasyonu 1 mg / ml. </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 toksin </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Manyetik boncuk: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Konsantrasyon 2 x 10 9 boncuk / ml. </td></tr></table> Çözümler <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Hazırlık </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 </td><td> 900 ml su, 0.20 g, potasyum klorür, potasyum dihidrojen fosfat 0.20 g, 1.16 g disodyum hidrojen fosfat ve 8.00 g sodyum klorür çözülür </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolamine tampon, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 </td><td> MgCl 2 susuz ve su ~ 300 ml KCl 7.3.59 g 0.0476g çözülür. Dağılmasından sonra 51 ml (% 99.5), DEA ekleyin. HCl (6 M) ile pH 9,8 &#39;e ayarlayın. 500 ml su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> Borat tamponu, 0.1 M, pH 9.5 </td><td> 3.09 g H 3 BO 3 ~ 300 ml distile su içinde çözülür, NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile 9.5 pH ayarlamak. 500 ml saf su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS tampon, 0.2 M, pH 8.5 </td><td> 3.85 g Tris [hidroksimetil] 100 ml su-aminomethane çözülür. NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile pH 8.5 &#39;e ayarlayın. 200 ml su ile seyreltilir. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS tamponu + BSA solüsyonu (% 0.1), pH 8.4 </td><td> TRIS tampon pH 8,4 50 ml BSA 0.050 g eritin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> PBS + TWEEN ® 0.05% </td><td> Önceden hazırlanmış PBS, pH 7.4 500 ml 0.250 g TWEEN 20 çözülür </td><td></td></tr><tr><td> PBS + BSA çözüm% 0.1 </td><td> PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA 0.050 g eritin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> PBS + BSA% 0.1 + NaN 3 0.02% </td><td> PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA g 0.050 ve 0.010 NaN 3, eritin . </td><td> Depolama solution </td></tr><tr><td> Enzimatik substrat </td><td> DEA tampon pH 9.8 100 ml, 0.010 g 1-naftil fosfat sodyum tuzu eritin. Sıkı şişeyi alüminyum folyo ile sarın. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> Yağsız süt bloke çözüm </td><td> Sınıf Engelleyicisi Non-Fat Kuru Süt (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Blot PBS pH 7.3 200 ml 0,20 g ekleyin. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr><tr><td> HT-2 stok solüsyonu </td><td> 10 ml vermek asetonitril, trikotesen HT-2 toksin flakon 10 mg çözülür 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile bir çözüm. </td><td> 30 ml tek kullanımlık alikotları bu çözüm Split ve -30 ° C&#39;den daha az saklayın </td></tr><tr><td> HT-2 standart çözüm Çalışma </td><td> Pipet 20 ml HT-2 toksin stok solüsyonu 2 ml ölçülü balona kalibre ve 10 mg / trikotesenler toksin ml içeren bir HT-2 çözüm elde etmek için asetonitril ile seyreltilmiş. </td><td> Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmalıdır. </td></tr><tr><td> HT-2 Çalışma kalibrant çözümler </td><td> Kalibrant çözeltisi 100 ng / ml hazırlamak için HT-2 standart solüsyonu (10 mg / ml) sulandırınız. Sulandırınız HT-2 kalibrant çözeltisi çalışan 100 ng / ml aşağıdaki konsantrasyonları 0 (boş), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml kalibratörü çözümler çalışmaya hazırlamak için. </td><td> Bu çözümler, kullanım gün taze olarak hazırlanması gerekir. </td></tr><tr><td> HT-2 KLH ile konjuge </td><td> 350 ul tek kullanımlık alikotları KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge Böl. </td><td> -30 ° C&#39;de saklayın alikot </td></tr><tr><td> Spesifik Monoklonal Antikor </td><td> Rekabet adımda kullanmak için PBS monoklonal antikor stok konsantrasyonu (1,383 mg / ml): 1:350 (v v) sulandırınız </td><td> Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. Son bir hacim 3,5 ml PBS 10 ml antikor stok solüsyonu, 17 standartları ve / veya numune analiz etmek yeterli değildir. </td></tr><tr><td> İkincil Etiketli Antikor </td><td> PBS içinde rekabet adımda kullanmak için: Alkalen Fosfataz ile konjuge anti-fare IgG (H + L) 1:100 (v v) seyreltilir. </td><td> Son hacim 10 ml PBS 100 ul antikor stok solüsyonu, 25 standartlara ve / veya numune analiz için yeterli. Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. </td></tr></table> Cihaz <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens enstrüman </td><td> PalmSens </td><td> Seri kablo bağlantı PC dizüstü bilgisayar ve Mux seçenekleri yazılım PalmSens Lite, ile birlikte verilen </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Sekiz kanal Mux elektrik kontağı </td><td> el yapımı </td><td></td></tr><tr><td> Sekiz serigrafi elektrotlar (SPES) ile sıyırın </td><td> el yapımı </td><td></td></tr><tr><td> Elektrotlar şerit için özel olarak tasarlanmış destek </td><td> el yapımı </td><td> SPE her çalışma elektrot yüzeyinin altında yerleştirilmiş, her biri 8 neodim mıknatıslar </td></tr><tr><td> Kalibreli mikrolitrelik pipetler </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Manyetik karıştırıcı ve heyecan bar. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cam bardak (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volumetrik şişeler (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ve 2 ml Eppendorf tüpleri. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> 5ml, 15ml Falcon ™ tüpleri. </td><td> Şahin </td><td></td></tr><tr><td> Laboratuvar Vorteks Karıştırıcı </td><td></td><td> Proteic parçalarının denatüre önlemek için HT2-KLH ile kaplanmış veya bağlantılı manyetik boncuk immünolojik zinciri ile tekrar süspansiyon vorteks mikser kullanmayın </td></tr><tr><td> Laboratuvar fırın veya mostatlı oda </td><td></td><td> 37 ± 3 ° C lik bir sıcaklık tutmak için bir fırın seçin </td></tr></table>

mikotoksin algılama elime (enzim İmmüno manyetik elektrokimyasal bağlantılı) yöntem

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassay daha pahalı ve zaman alıcı kantitatif HPLC veya GC 1 2 yöntem, gıda malları tehlikeli mikotoksinler tarama algılama için geçerli bir alternatif. Bu protokolde algılama platformu olarak immünokimyasal zinciri 3 ve serigrafi elektrotlar için sağlam bir destek olarak manyetik boncuk kullanımı dayalı bağlantılı immunomagnetic tahlil imal ve rekabetçi bir elektrokimyasal Enzim sorguya nasıl göstermektedir. Bizim yöntemi HT-2 ve T-2 toksinleri trichothecenes aile ve insan sağlığı 4 için büyük bir endişe ait toplam tutarı, mikotoksinler belirlenmesi amaçlanmıştır. % 100 HT-2 ve T-2 doğru bir çapraz reaksiyon ile bir antikor klon benzer hassasiyet 5 ile aynı anda iki toksinler tespit etmek için sağlar . Testinin ilk adım, biz yüzey üzerinde manyetik boncuk HT2-KLH konjuge toksin hareketsiz kaplama adımdır. Immobilize HT-2 ve HT-2 ya da T-2 örnek ücretsiz mevcut veya standart bir çözüm çözünmüş arasındaki rekabet, non-spesifik emme önlemek için gerekli engelleyici bir adım sonra, monoklonal antikor Ayrıca sağlar. Rekabet adım sonunda, monoklonal antikor miktarı ile bağlantılı HT-2 örnek çözüm toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır immobilize. Alkalen fosfataz (AP) ile etiketlenmiş ikincil bir antikor spesifik antikor ve hareketsiz HT-2 arasındaki bağlayıcı ortaya çıkarmak için kullanılır. Son ölçüm adım ekran baskılı bir çalışma elektrot yüzeyinde belirli bir örnek / standart bir çözüm karşılık, manyetik boncuk süspansiyonu bir kısım bırakarak yapılır; altında tam olarak yerleştirilen bir mıknatıs sayesinde manyetik boncuk immobilize ve konsantre ekran basılmış elektrot. Manyetik boncuk ve AP için bir substrat arasında kuluçka iki dakika sonra, enzimatik ürün birkaç saniye bir süre içinde otomatik olarak sekiz ölçümler başlatmak için ayrıca taşınabilir bir enstrüman (PalmSens) kullanarak Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tarafından algılanır.

Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.

Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

İmmünolojik analizler, tehlikeli maddelerin tarama amaçlı tespitinde, daha pahalı ve zaman alıcı olan kantitatif HPLC veya GC1, 2 yöntemlerine karşı geçerli bir alternatiftir...

Merhaba, benim adım Francesco Lichi. Roma Tova Gata Üniversitesi'nde Profesör Palki'nin Biyoanalitik Laboratuvarı'nda doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün, meslektaşlarımla birlikte, gıda örneklerinde TCO mikotoksininin tespiti için elektrokimyasal bir CY hazırlanışını size göstereceğim.İmmün hücre testlerinde kullanılan farklı yöntemler arasında, enzim immün hücre yöntemi en popüler olanlardan biridir. Bu yöntemde antikor veya antijen bir enzime bağlanır. Son zamanlarda, enzim kanalının tespiti için elektrokimyasal yöntemlerin kullanımının, belirli uygulamalar için özel avantajlar sağladığı gösterilmiştir.Elektrokimya aslında girişimlere daha az eğilimlidir, minyatürleştirme ve düşük maliyetle kütle tayini için uygundur. Bu perspektiften, düşük maliyeti ve prosedürün kolaylığını sağlamak için ekran baskılı elektrotların kullanımı büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, yöntemin en iyi hassasiyetini elde etmek amacıyla, ekran baskılı elektrotlar ile manyetik yatakların kullanımı birleştirilebilir.Bugün, gıda örneklerinde T-2 ve HT-2 mikotoksinlerinin tespiti için ekran baskılı elektrotlar ve manyetik parçacıkların kullanımıyla temellenen elektrokimyasal bir sensörün nasıl hazırlanacağını göstereceğiz. Trichothecene mikotoksinleri tahıllarda yaygın olarak bulunur ve bu nedenle tahıl bazlı gıda ve yem maddelerinin güvenliği için ciddi bir tehdit oluşturur. A grubu içindeki en önemli trichothecene'ler T-2 ve HT-2 toksinleridir.Görüleceği üzere, bu yöntem eğitim almamış personel tarafından kolaylıkla uygulanabilir ve düşük maliyetli, taşınabilir cihazlar gerektirir. Bu, çalışmanın yürütüldüğü Avrupa topluluğu tarafından finanse edilen entegre biyoloji projesinin temel hedeflerinden biridir. Şimdi yöntemin prensibine ve kullanacağımız malzemelere göz atalım.Öyleyse başlayalım. Materyaller: İmmünolojik zincirleme reaksiyon için destek olarak manyetik boncuklar kullanılacaktır. Algılama elementi olarak sekizli ekran baskılı elektrot şeridi kullanılacaktır.Her bir sensör; bir grafit çalışma elektrodu, bir karşı elektrot ve bir gümüş referans elektrottan oluşmaktadır. Bu sensörler, PalmSense tarafından üretilen taşınabilir bir elektrokimyasal cihaz ile çok kısa sürede sırayla ve bireysel olarak çalıştırılabilir. Yöntemin prensibi basit olup kompetitif bir immünolojik reaksiyona dayanmaktadır.Konjuge toksin, manyetik boncuklar üzerine immobilize edilir ve ardından spesifik olmayan absorbsiyonu önlemek için boncuklar bloke edilir. Ölçüm işleminin kendisi yarışma adımıyla başlar. Bu aşamada, kaplanmış boncuklar sabit miktardaki monoklonal antikorla reaksiyona bırakılır; örnekte bulunan örnek toksini ile manyetik boncuklar üzerine immobilize edilmiş olan toksin, antikor bağlanma bölgeleri için yarışacaktır.Kodlu boncuklara bağlanan antikor miktarı, örnekteki toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır. Yarışma aşamasını ardından etiketleme aşaması takip eder. Bu durumda, manyetik boncuklar, etiketleme enzimle konjuge edilmiş ikincil bir antikor ile reaksiyona girmesi için bırakılır.Sekonder antikor, monoklonal antikora bağlanacak ve etkili etiketlemeyi sağlayacaktır. Etiketleme aşamasını nihayetinde ölçüm aşaması takip eder. Bu durumda, manyetik boncuklar manyetik platform yardımıyla elektrot yüzeyinde yoğunlaştırılır ve ardından sadece enzim substratı olan napt phosphate eklenerek one naptha üretimi ölçülür.Oluşturulan bağlanma eğrisi, düşük toksin konsantrasyonlarında yüksek akım değerleri ve yüksek toksin içeriğinde düşük sinyaller gösterecektir. Toksin konsantrasyonu, standart tamponlu çözeltilerde oluşturulan bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak elde edilecektir. Asıl analizi kurmak için, kalibrasyon eğrisinin her bir standart çözeltisi ve numuneler için ayrı olmak üzere, temiz iki mil fendor tüplerinden oluşan bir raf hazırlarız.Ardından, her tüpe 10 µL boncuk süspansiyonu pipetlenir. Bu solüsyon, daha önceden konjuge toksin ile kaplanmış manyetik boncuklar içerir. Ancak, analiz çalıştırılmadan önce saklama sıvısı uzaklaştırılmalıdır; çünkü koruyucu olarak kullanılan sodyum azide, işaretleyiciyle ilişkili enzimatik aktiviteyi etkileyecektir.Bunu yapmak için P-B-S-B-S-A tamponu eklenir. Tüpler çalkalanır, ardından mıknatıs tekrar yerleştirilir ve yıkama tamponu pipetle çekilerek uzaklaştırılır. Analizin ilk gerçek aşamasına bloklama adımı denir.Bu aşama sırasında, tüplerin her birine bir mil bloklama çözeltisi eklenir. Ardından tüpler, döner numune karıştırıcısına yerleştirilerek oda sıcaklığında yarım saat boyunca inkübasyona bırakılır. Daha sonra, bir sonraki kritik aşama olan rekabet aşaması için bloklama çözeltisi uzaklaştırılır ve her tüpe monoklonal spesifik antikor ile toksin çözeltileri eklenir.Bunu yapmak için, optimize edilmiş konsantrasyonda 200 µL monoklonal antikor enjekte edilir. Ardından her tüpe 200 µL standart çözelti veya örnek eklenir. Bu reaktiflerin 30 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verilir.Bu işlemi başlatmak için, manyetik partikül yüzeyine immobilize edilmiş reaktifler ile çözeltideki moleküller arasındaki teması optimize etmek amacıyla, tüpler etiketleme adımına geçmek üzere döner numune karıştırıcıya geri yerleştirilir. Önceki adımdan kalan çözeltinin uzaklaştırılması gerekir. Ardından, her tüpe 400 µL etiketli sekonder antikor eklenir ve tüpler döner numune karıştırıcıya geri konularak 30 dakika boyunca inkübe edilir.Ardından, etiketleme sıvısı uzaklaştırıldıktan sonra, bağlanmamış enzimatik reaktiflerin herhangi bir girişimi önlemek amacıyla çeşitli tamponlar kullanılarak yıkama işlemleri gerçekleştirildi. Son olarak, gerçek ölçümlere hazırlık amacıyla, manyetik boncuklar, etiketin enzimatik aktivitesini optimize etmek için uygun olan 100 µL DEA tamponu içinde yeniden süspanse edildi. Ölçüm, altta bağlı olduğu görülen sekiz elektrotlu şeride sahip bu avuç içi potansiyostat ile gerçekleştirilir.Sekiz güçlü mıknatısın her bir çalışma elektrodunun yüzeyinin tam altına sabitlendiği özel bir destek bulunmaktadır. Mıknatıs, boncukların çalışma elektrodu yüzeyinde yoğunlaşmasını sağlar. Her bir EOR'dan 20 µL'lik reaktif manyetik boncuk dispersiyonu alikotu pipetleyip ilgili çalışma elektrodu yüzeyine yüklüyoruz.Gerçek ölçümü gerçekleştirmek için enzimatik substrat eklenmelidir, ancak işlem adımlarının sırasının da dikkatle kontrol edilmesi gerekir. İlk elektrot yüzeyine ad mikrolitre enzimatik substrat çözeltisi ekliyoruz. Ardından iki dakikalık geri sayımı başlatıyoruz.14 saniye sonra, ikinci elektroda substrat çözeltisi ekliyoruz. Bir 14 saniye daha geçtikten sonra, üçüncü elektroda substrat çözeltisi ekliyoruz. Son elektroda kadar aynı zaman aralığını kullanarak devam ediyoruz.Aslında, 14 saniyelik aralık, potansiyostatın ölçümü gerçekleştirmesi için gereken süre olarak hesaplanmıştır. Tamam, enzimatik substrat çözeltisinin ilk eklemesinden sonraki iki dakikalık geri sayımın ardından, elektrokimyasal ölçüm protokolü başlatılır. Oluşan ürünün gerçek ölçümü, diferansiyel pals telemetrisi kullanılarak yapılır.Rekabetçi bir analiz olduğu için, birbirini izleyen elektrotların eğrileri ekranda görünmeye başlar. Elde edilen sinyalin akım şiddeti, yarışma adımında tüpte bulunan toksin konsantrasyonu ile ters orantılı olacaktır. Standart çözeltilerin akım sinyalleri sigmoid bir eğri şeklinde çizilecek ve toksin içeriği bilinmeyen numunelerin konsantrasyon değerleri, kaydedilen sinyalden ekstrapolasyon yapılarak elde edilecektir.Umarım bu gösterim, elektrokimyasal immünosensörlerin avantajlarını anlamanız için açık ve faydalı olmuştur. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dilerim.

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Manyetik modülasyon biyoalgı sistemi hızla DNA molekülleri ve proteinler gibi biyolojik testleri, hassas ve kolayca tespit etmek için kullanılmaktadır.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

Adaptif bağışıklık idiyopatik hastalıklar mikrobik hedeflerin belirlenmesi, enzim bağlı immünospot testinin kullanımı yapılabilir.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Bu video, sandviç enzime bağlı immünosorbent testi veya ELISA tekniği ile kimyasal olarak konjuge antikor-antijen komplekslerinin tespitini göstermektedir. Yakalanan antikor, antikor-antijen konjugatının antijeninin spesifik epitopuna bağlanır ve daha sonra enzime bağlı bir ikincil antikor kullanılarak görselleştirilebilir.

Kimyasal Olarak Bağlanmış Antikor-Antijen Konjugatlarını Doğrulamak için Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Büyük hacimli tarımsal sularda gıda kaynaklı patojenlerin entegre konsantrasyon, zenginleştirme ve son nokta kolorimetrik tespitini içeren bir protokol burada sunulmaktadır.  Su, seçici veya seçici olmayan ortamlarla zenginleştirilmiş Modifiye Moore Swablarından (MMS) süzülür ve algılama, bakteriyel-gösterge kolorimetrik substratlarla gömülü kağıt bazlı analitik cihazlar (μPAD) kullanılarak gerçekleştirilir.

Kolorimetrik Algılama Paper-based<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Ve<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Tarım Su geniş hacimli

Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobine güçlü bir şekilde reaktif olan iki IgG sınıfı monoklonal antikorun (mAb) gelişimini açıklar. Bu mAb'ler, deniz memelilerinin Mb'sini fok ve diğer hayvanlardan ayırt etmek için sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulanır.

Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

İnsan tüketimine yönelik tatlı su rezervuarlarında siyanobakteriyel toksinlerin varlığı, su yönetimi yetkilileri için büyük bir endişe kaynağıdır. Su kontaminasyonu riskini değerlendirmek için bu makale, bir antikor mikrodizi çipi kullanılarak sıvı ve katı numunelerdeki siyanobakteri suşlarının sahada tespiti için bir protokol açıklamaktadır.

Saptamak için deneysel protokol Siyanobakteri Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Elektrowetting tabanlı dijital mikroakışkan, manipülasyonunu kolaylaştırmak için mikrolitre hacimli damlacıkların görünür temas açısında voltaj güdümlü bir değişiklik kullanan bir tekniktir. Bunu fonksiyonel manyetik boncuklarla birleştirmek, enzime bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) kullanılarak numune hazırlama ve patojenlerin tanımlanması için birden fazla laboratuvar ünitesi operasyonunun entegrasyonunu sağlar.

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Elektrokemilüminesans immünoassay (ECLIA), geniş bir çalışma aralığında düşük intra ve inter-assay hatası ile yüksek nicel, doğru ve tekrarlanabilir ölçümler üreten endojen ve eksojen olarak uygulanan MeCP2 protein varyantlarının kantitatif tespiti için yeni bir yaklaşımdır. Burada, 96-iyi formatta MeCP2-ECLIA için protokol açıklanmıştır.

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

Mycoplasma pneumoniae enfeksiyonunda, seroloji testleri immünolojik çapraz reaksiyon nedeniyle düşük özgüllükle iyi sonuçlar verebilir. Bu yazıda açıklanan kurum içi antijen yakalama ELISA, yüksek tür özgüllüğünü garanti eder ve M. pneumoniae'nin doğru teşhisi için güvenilir bir tarama testi olduğu gösterilmiştir.

Mycoplasma pneumoniae'nin Spesifik Tespiti için Antijen Yakalama Enzimine Bağlı İmmünosorbent Testi

Bu protokol, yakın zamanda yayınlanan Komisyon Yönetmeliği (AB) 2023/915'e uygun olarak gıdalarda ergot alkaloidlerinin varlığını belirlemek için doğrulanmış bir sıvı kromatografisi-iyon hareketliliği-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi yöntemi sunar.

Sıvı Kromatografisi Tuzaklı İyon Hareketlilik Spektrometresi-Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi ile Gıda Matrislerinde Düzenlenmiş Ergot Alkaloidlerinin Tespiti

Öğrenin trichothecene mikotoksinlerini gıda örneklerinde elektrokimyasal immünoassay ile tespit etme yöntemini. Bu protokol yüksek duyarlılık ve özgüllük sağlayarak gıda güvenliğine katkıda bulunur.

Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

Daha fazla video keşfet