Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

Merhaba, benim adım Francesco Lichi. Roma Tova Gata Üniversitesi'nde Profesör Palki'nin Biyoanalitik Laboratuvarı'nda doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün, meslektaşlarımla birlikte, gıda örneklerinde TCO mikotoksininin tespiti için elektrokimyasal bir CY hazırlanışını size göstereceğim.

İmmün hücre testlerinde kullanılan farklı yöntemler arasında, enzim immün hücre yöntemi en popüler olanlardan biridir. Bu yöntemde antikor veya antijen bir enzime bağlanır. Son zamanlarda, enzim kanalının tespiti için elektrokimyasal yöntemlerin kullanımının, belirli uygulamalar için özel avantajlar sağladığı gösterilmiştir.

Elektrokimya aslında girişimlere daha az eğilimlidir, minyatürleştirme ve düşük maliyetle kütle tayini için uygundur. Bu perspektiften, düşük maliyeti ve prosedürün kolaylığını sağlamak için ekran baskılı elektrotların kullanımı büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, yöntemin en iyi hassasiyetini elde etmek amacıyla, ekran baskılı elektrotlar ile manyetik yatakların kullanımı birleştirilebilir.

Bugün, gıda örneklerinde T-2 ve HT-2 mikotoksinlerinin tespiti için ekran baskılı elektrotlar ve manyetik parçacıkların kullanımıyla temellenen elektrokimyasal bir sensörün nasıl hazırlanacağını göstereceğiz. Trichothecene mikotoksinleri tahıllarda yaygın olarak bulunur ve bu nedenle tahıl bazlı gıda ve yem maddelerinin güvenliği için ciddi bir tehdit oluşturur. A grubu içindeki en önemli trichothecene'ler T-2 ve HT-2 toksinleridir.

Görüleceği üzere, bu yöntem eğitim almamış personel tarafından kolaylıkla uygulanabilir ve düşük maliyetli, taşınabilir cihazlar gerektirir. Bu, çalışmanın yürütüldüğü Avrupa topluluğu tarafından finanse edilen entegre biyoloji projesinin temel hedeflerinden biridir. Şimdi yöntemin prensibine ve kullanacağımız malzemelere göz atalım.

Öyleyse başlayalım. Materyaller: İmmünolojik zincirleme reaksiyon için destek olarak manyetik boncuklar kullanılacaktır. Algılama elementi olarak sekizli ekran baskılı elektrot şeridi kullanılacaktır.

Her bir sensör; bir grafit çalışma elektrodu, bir karşı elektrot ve bir gümüş referans elektrottan oluşmaktadır. Bu sensörler, PalmSense tarafından üretilen taşınabilir bir elektrokimyasal cihaz ile çok kısa sürede sırayla ve bireysel olarak çalıştırılabilir. Yöntemin prensibi basit olup kompetitif bir immünolojik reaksiyona dayanmaktadır.

Konjuge toksin, manyetik boncuklar üzerine immobilize edilir ve ardından spesifik olmayan absorbsiyonu önlemek için boncuklar bloke edilir. Ölçüm işleminin kendisi yarışma adımıyla başlar. Bu aşamada, kaplanmış boncuklar sabit miktardaki monoklonal antikorla reaksiyona bırakılır; örnekte bulunan örnek toksini ile manyetik boncuklar üzerine immobilize edilmiş olan toksin, antikor bağlanma bölgeleri için yarışacaktır.

Kodlu boncuklara bağlanan antikor miktarı, örnekteki toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır. Yarışma aşamasını ardından etiketleme aşaması takip eder. Bu durumda, manyetik boncuklar, etiketleme enzimle konjuge edilmiş ikincil bir antikor ile reaksiyona girmesi için bırakılır.

Sekonder antikor, monoklonal antikora bağlanacak ve etkili etiketlemeyi sağlayacaktır. Etiketleme aşamasını nihayetinde ölçüm aşaması takip eder. Bu durumda, manyetik boncuklar manyetik platform yardımıyla elektrot yüzeyinde yoğunlaştırılır ve ardından sadece enzim substratı olan napt phosphate eklenerek one naptha üretimi ölçülür.

Oluşturulan bağlanma eğrisi, düşük toksin konsantrasyonlarında yüksek akım değerleri ve yüksek toksin içeriğinde düşük sinyaller gösterecektir. Toksin konsantrasyonu, standart tamponlu çözeltilerde oluşturulan bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak elde edilecektir. Asıl analizi kurmak için, kalibrasyon eğrisinin her bir standart çözeltisi ve numuneler için ayrı olmak üzere, temiz iki mil fendor tüplerinden oluşan bir raf hazırlarız.

Ardından, her tüpe 10 µL boncuk süspansiyonu pipetlenir. Bu solüsyon, daha önceden konjuge toksin ile kaplanmış manyetik boncuklar içerir. Ancak, analiz çalıştırılmadan önce saklama sıvısı uzaklaştırılmalıdır; çünkü koruyucu olarak kullanılan sodyum azide, işaretleyiciyle ilişkili enzimatik aktiviteyi etkileyecektir.

Bunu yapmak için P-B-S-B-S-A tamponu eklenir. Tüpler çalkalanır, ardından mıknatıs tekrar yerleştirilir ve yıkama tamponu pipetle çekilerek uzaklaştırılır. Analizin ilk gerçek aşamasına bloklama adımı denir.

Bu aşama sırasında, tüplerin her birine bir mil bloklama çözeltisi eklenir. Ardından tüpler, döner numune karıştırıcısına yerleştirilerek oda sıcaklığında yarım saat boyunca inkübasyona bırakılır. Daha sonra, bir sonraki kritik aşama olan rekabet aşaması için bloklama çözeltisi uzaklaştırılır ve her tüpe monoklonal spesifik antikor ile toksin çözeltileri eklenir.

Bunu yapmak için, optimize edilmiş konsantrasyonda 200 µL monoklonal antikor enjekte edilir. Ardından her tüpe 200 µL standart çözelti veya örnek eklenir. Bu reaktiflerin 30 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verilir.

Bu işlemi başlatmak için, manyetik partikül yüzeyine immobilize edilmiş reaktifler ile çözeltideki moleküller arasındaki teması optimize etmek amacıyla, tüpler etiketleme adımına geçmek üzere döner numune karıştırıcıya geri yerleştirilir. Önceki adımdan kalan çözeltinin uzaklaştırılması gerekir. Ardından, her tüpe 400 µL etiketli sekonder antikor eklenir ve tüpler döner numune karıştırıcıya geri konularak 30 dakika boyunca inkübe edilir.

Ardından, etiketleme sıvısı uzaklaştırıldıktan sonra, bağlanmamış enzimatik reaktiflerin herhangi bir girişimi önlemek amacıyla çeşitli tamponlar kullanılarak yıkama işlemleri gerçekleştirildi. Son olarak, gerçek ölçümlere hazırlık amacıyla, manyetik boncuklar, etiketin enzimatik aktivitesini optimize etmek için uygun olan 100 µL DEA tamponu içinde yeniden süspanse edildi. Ölçüm, altta bağlı olduğu görülen sekiz elektrotlu şeride sahip bu avuç içi potansiyostat ile gerçekleştirilir.

Sekiz güçlü mıknatısın her bir çalışma elektrodunun yüzeyinin tam altına sabitlendiği özel bir destek bulunmaktadır. Mıknatıs, boncukların çalışma elektrodu yüzeyinde yoğunlaşmasını sağlar. Her bir EOR'dan 20 µL'lik reaktif manyetik boncuk dispersiyonu alikotu pipetleyip ilgili çalışma elektrodu yüzeyine yüklüyoruz.

Gerçek ölçümü gerçekleştirmek için enzimatik substrat eklenmelidir, ancak işlem adımlarının sırasının da dikkatle kontrol edilmesi gerekir. İlk elektrot yüzeyine ad mikrolitre enzimatik substrat çözeltisi ekliyoruz. Ardından iki dakikalık geri sayımı başlatıyoruz.

14 saniye sonra, ikinci elektroda substrat çözeltisi ekliyoruz. Bir 14 saniye daha geçtikten sonra, üçüncü elektroda substrat çözeltisi ekliyoruz. Son elektroda kadar aynı zaman aralığını kullanarak devam ediyoruz.

Aslında, 14 saniyelik aralık, potansiyostatın ölçümü gerçekleştirmesi için gereken süre olarak hesaplanmıştır. Tamam, enzimatik substrat çözeltisinin ilk eklemesinden sonraki iki dakikalık geri sayımın ardından, elektrokimyasal ölçüm protokolü başlatılır. Oluşan ürünün gerçek ölçümü, diferansiyel pals telemetrisi kullanılarak yapılır.

Rekabetçi bir analiz olduğu için, birbirini izleyen elektrotların eğrileri ekranda görünmeye başlar. Elde edilen sinyalin akım şiddeti, yarışma adımında tüpte bulunan toksin konsantrasyonu ile ters orantılı olacaktır. Standart çözeltilerin akım sinyalleri sigmoid bir eğri şeklinde çizilecek ve toksin içeriği bilinmeyen numunelerin konsantrasyon değerleri, kaydedilen sinyalden ekstrapolasyon yapılarak elde edilecektir.

Umarım bu gösterim, elektrokimyasal immünosensörlerin avantajlarını anlamanız için açık ve faydalı olmuştur. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dilerim.