Name: Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde N-bağlı glikanların dinamik değişimlerini pulse-kovalamaca ve HPLC analizi ile izleme yöntemini. Bu teknik glikoprotein biyosentezini ve hücresel süreçleri anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Zehavit Frenkel ve Sandra Tolchinsky teknik yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma ile ilgili araştırmalar, İsrail Bilim Vakfı (1229-1207) ve Alman-İsrail Projesi İşbirliği (DIP-DFG) hibe tarafından destekleniyor.

Aşağıdaki protokol toplam glikoproteinler veya belirli bir glikoprotein ilgi şeker zincirleri analizleri için tasarlanmıştır. Prosedürü temelde birkaç değişikliklerle protokol boyunca belirtildiği gibi her iki durumda aynıdır. <ol><li> N-bağlı glukanlardır metabolik etiketleme için, bir gecede her bir örnek için 90 mm tabak içinde yetiştirilen memeli hücrelerinin bir akışkan kültürünü kullanmak için bir ihtiyacı farklı zaman noktalarında ya da tedavi temsil edebilir (numune). Bu protokol NIH 3T3 hücreleri için optimize edilmiştir. </li><li> 5 ml taze hazırlanmış% 10 diyaliz FCS ve 5-15 dakika için 4 mM sodyum piruvat ile birlikte önceden ısıtılmış (37 ° C) glukoz-orta, inkübasyon glikoz hücreleri açlıktan. </li><li> Açlık orta değiştirin önceden ısıtılmış 1 ml (37 ° C) glukoz-400 μCi içeren orta [2 - 3 H] (alt 65 konsantrasyonu μCi / ml Toplam glikoproteinler etiketlenmesi için kullanılan) mannoz-etiketli 1 saat için normal doku kültürü koşullarında hücrelerin kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Her örnekten etiketleme orta çıkarın ve dikkatle 4 2 ml PBS eklemek ° kovalamak için ilgili örnekleri gerekir sırasında nabız ve buz (bu örnekler bakliyat olarak anılacaktır) onları yere karşılık gelen numune C, 2 ml ile 3 kez durulanır önceden ısıtılmış (37 ° C), normal tam bir kültür ortamı ve daha sonra 37 CO 2 inkübatör yerleştirilir ° C, istenilen kovalamaca süreler için, önceden ısıtılmış düzenli orta 5 ml. </li><li> 2 ml buz gibi soğuk PBS ile darbe örnekleri (daha önce buz üzerinde yer) 3 kez durulayın. Bu hücreler daha sonra 2 ml PBS bir hücre kazıyıcı kullanarak çanak kazınmış ve 2 ml Eppendorf tüp yerleştirilir. </li><li> 16000Xg (6-10 sn) hücreleri Kısa-spin süpernatantı atmak ve -80 hücre pelletini ° C dondurmak </li><li> 5 ve kovalama, kovalamaca zaman sonunda numuneler için ayrıca 6 adımları gerçekleştirin. </li><li> Hücreleri dondurucuya kaldırın ve tampon 300 ul Ayrıca onlara lyse kısaca vorteks ve inkübasyon, tampon B ile buz üzerinde 20 dakika buz üzerinde 20 dk inkübe ya da toplam glikoproteinler analiz durumda, sonication tarafından takip (4 kez, 10 sn, maksimum genlik), sonra 5 dk örnekleri kaynatın. </li><li> 4 ° C'de 20 dakika süreyle 16000Xg lizatları Santrifüj Süpernatantı yeni Eppendorf tüpüne aktarın ve pelet iptal. </li><li> Eğer toplam glikoproteinler analiz, moleküler filtrasyon ve deglycosylation (adım 17) geçin. H2A glikoprotein immunoprecipitation burada göstermiştir için, (Bizim örneğimizde H2A anti-antikor (Repligen), protein, A-agaroz boncuk 1:1 askı ve istenilen glikoprotein tavşan poliklonal anti H2A antikor 3 ul / numune 20l/sample eklemek ), adım 9 süpernatantı. </li><li> Yavaş dönüşü ile sürekli karıştırma, numuneler 4 ° C'de 4-16 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 30 saniye boyunca 16000Xg boncuk Spin, supernatant kullanarak vakum ve dikkatli bir şekilde çıkarın. </li><li> 500 ul tampon D ekleyerek ve vorteks, boncuk durulayın. Spin ve adım 12 gibi süpernatantı kaldırmak. Yıkama 3 kez tekrarlayın. </li><li> Boncuk pelet 10μl denatüre tamponu (NEB endo-H kiti ile birlikte) ekleyin ve 5 dakika (toplam proteinlerin analiz edildiğinde, deglycosylation Microcon filtresi, adım 17) örnekleri kaynatın. </li><li> (30 saniye için 16000Xg) boncuk aşağı çevirin ve yeni bir Eppendorf tüp içine süpernatantı transfer. Sonra, endo H enzim 0.5μl 10 ul reaksiyon tamponu (NEB endo H kiti ile birlikte) ile birlikte her örnek, örnekleri 37 ° C'de 3 saat inkübe edilir. </li><li> Proteinlerden serbest glukanlardır ayırmak için, örnek sonra 3 dakika süreyle santrifüj 14000Xg, cut-off 30kDa 5 kez deiyonize su ile seyreltilir ve bir moleküler filtre (Microcon Ultracel YM30) üstüne konur. Deiyonize su numuneleri tekrar santrifüj 50μl uygulayın. Bu yıkanmaya flow-through tutarak, 2 kez daha tekrarlanır. </li><li> Toplam glikoproteinler analiz yapıyorsanız, Microcon filtre lizatları süpernatant (adım 9) geçerlidir. 14000Xg az 3 dakika santrifüj tekrarlanan 3 kez tampon E, 100 ul özü yıkayın. 10X endo H reaksiyon tamponu 3 ul ve Microcon retentate endo H enzim 1.5 ul ekleyin ve 37 az 3 saat boyunca inkübe ° C 3 tekrarlanan santrüfüj piyasaya glukanlardır adım 16 olarak deiyonize su ile yıkandı. </li><li> İsterseniz, H-endo dayanıklı glikoproteinler içeren 16 ve 17 adımları retentates, sonra 37, tampon C 15 ul N-glycosidase F 200mu inkübe ° C 16 saat Deiyonize su ile Elüsyon adım 16 olarak yapılır. </li><li> SpeedVac konsantratör endo H reaksiyon flow-through (adım 16 ve 17) içeren tüp YeriVe tamamen örnekleri kuru (bu 45 kadar yapılabilir ° C, bu süreci hızlandırmak için). </li><li> HPLC için numuneleri hazırlamak için, HPLC solvent (su, 60:40,% 1 fosforik asit asetonitril) 12 ul kuru pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> HPLC cihazı (Spherisorb sütun bağlı) sabit çözücü akışı (1 ml / dk) ve basınç (1000 ve 2000 psi arasında belirli bir değer) ayarlayın ve her 1 dakikada bir tüp değiştirmek için bir fraksiyon toplayıcı yerleştirmek. </li><li> HPLC cihazı örnekleri Yük ve fraksiyon toplayıcı aynı anda başlatmak. </li><li> Her numune vadede ve standart bir oligosakkarit karışımı bir çalışma 1 ml 48 kesirler toplayın. </li><li> 500 ul Transferi, her fraksiyon bir sintilasyon flakon ve 3 ml su karışabilir sintilasyon sıvı içeriği karıştırın. </li><li> Şişeleri Yük ve sintilasyon sayacı okuma. </li><li> Kopyaya okuma kesir sayısı bir fonksiyonu olarak çizilir. </li><li> , Aşağıdaki gibi özel bir glukanıdır türler bir zirve içinde kopyaya değerleri temsil eder: kesirler 18-21 M8, M9 Kesirleri 36-39, M5, kesirler 22-26 ile M6, kesirler 27-31 M7, kesirler 32-35 karşılık kesirler G2M9 için 40-42 G1M9 ve kesirler 43-45. </li><li> Her tepe içinde kesirler için kopyaya değerleri toplamı, belirli bir glukanıdır türlerin mutlak miktarını yansıtır. Aslında her glukanıdır türün mutlak miktarı içerdiği mannoz kalıntılarının sayısına göre ayrılmıştır: daha mannoz kalıntılarını içeren türlerin daha fazla etiket, her glukanıdır türün aşağıdaki gibi hesaplanır "göreli molar miktarı" Satın aldığınız için telafi etmek için . Bu değer, daha sonra, her belirli glukanıdır türleri için, "toplam yüzde" elde etmek için elde edilen tüm glukanıdır türlerin göreceli molar miktarda toplamına bölünür. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> Chase (h) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> Endo H (CPM) ile yayımlanan </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> N-glycosidase F (CPM) b ile Çıkış </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> Retentate (CPM) c de Glikoproteinler </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Retentate (CPM) d Dolichol-oligosakkaritler </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Retentate Dolichol-oligosakkaritler (%) e </td><td> 1.4 ± 0.7 </td><td> 0.2 ± 0.2 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: N-bağlı şeker zincirleri deglycosidases ve glikoprotein örneklerinde dolichol-oligosakkaritler varlığı serbest Analizi. NIH 3T3 hücreleri lizat darbe-kovalamaca prosedürü uygulanır. Microcon filtrasyon sonra, etiketli N-bağlı oligosakkaritler, darbe etiketleme sonra (yüksek mannoz tipi) ve N-glycosidase F karmaşık türü (Golgi işlenmiş glukanlardır) karşılık kovalamaca bir süre sonra daha ileri tedavi, endo H olmak üzere serbest bırakıldı endo H dayanıklı oligosakkaritler. Bu kantitatif analiz dolichol-oligosakkaritler, ilk retentate etiket önemsiz bir kısmını oluşturmaktadır belirlenir. Notlar: <ol class="lalpha"><li> NIH 3T3 hücreleri darbe [2 - 3 H] ile etiketlenmiş mannoz ve tam orta ile kovaladı. Microcon YM30 yoluyla hücre parçalama ve filtrasyon sonra, yüksek mannoz N-bağlı oligosakkaritler endo H. kuluçka tarafından retentates serbest bırakıldı </li><li> Endo (a) Microcon retentates H-dayanıklı malzeme daha sonra N-glycosidase F inkübe ve sintilasyon sayacı ölçülen oligosakkaritler serbest bırakıldı. </li><li> Metanol: su 10:10:03 habercisi glikolipitler kaldırmak ve 1N NaOH içinde çözünür ve bir sintilasyon sayacı sayılır unextracted malzeme Microcon retentates (a) endo H tedavi öncesi, kloroform ile 4 kez çıkarıldı olarak elde. </li><li> Dolichol-oligosakkaritler (c) 1 açıklanan ve sintilasyon sayacı sayılır alıntılar saflaştırıldı. </li><li> Ortalama retentate toplam cpm dolichol-oligosakkaritler (d) yüzde 3 deneyler (c + d). </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. 1s sonra tedavi edilmezse hücreleri ve proteozomal inhibisyonu üzerine toplam NIH 3T3 glikoproteinler Pulse-kovalamaca analizi ile darbe etiketleme [2 - 3 H] biz bazı glucosylated beklenen bir profil eldeöncüleri (GLC 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) ve G1M9) kalan, fakat M9 içinde mevcut etiket ve M8 türlerin çoğu, ikincisi tüm glikoz kırparak ve bir mannoz kalıntısı (Şekil 1 A) sonucu. No ücretsiz mannoz veya diğer küçük öncüleri arınma titizlik doğrulayan tespit edildi. Oldukça uzun bir 8h kovalamaca ardından M7-6 ve M5 küçük bir miktar kırpma daha kapsamlı olduğunu, ancak en önemli türler, M9 ve M8 (Şekil 1 B) olmaya devam etmiştir. Kovalayan bir proteozomal inhibitörü (30 mcM MG-132) huzurunda yapıldı ise, bu aynı kesilmiş türlerin (Şekil 1 C) küçük bir birikim vardı. <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. ERAD bir substrat şeker zincirleri Kantitatif analiz toplam glikoproteinler. (A) Şekil 1'de birine benzer bir deneyde, her oligosakkarit türün bağıl molar miktarda mannoz içerik dayanarak hesaplandı. (B) Biz her glukanıdır tür için elde edilen kopyaya değerler dönüştürülür, sonra bütün türlerin mevcut bağıl molar miktarda toplamı göre her tür yüzde iki deneyler ortalama kovalamaca zamanın bir fonksiyonu olarak çizilen oldu. Benzer (A) ERAD substrat ASGPR H2A salınan bu glukanlardır hariç incelendi sonra varlığında 4h kovalamak için proteozomal inhibitörü MG-132 varlığı ya da yokluğu 4h için darbe etiketleme ve kovalamaca (C) Değerler (A) ve (B) ASGPR H2A ve glikoprotein havuzu için karşılaştırılır. MG-132 (D) N-bağlı şeker zinciri ER süreçleri kırparak Programı. Şeker kırpma işlemleri bu M9-8 karşılaştırıldığında ERAD hedeflenen proteinleri (R) Golgi ve ötesinde çıkın. Bağlantılı M6-5 yol Mannoz kalan 5-6 mannoz kalıntılarının tür verim N-glukanlardır kırparak ERAD süreci ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

HPLC ayırma ile canlı hücrelerin içinde glukanlardır darbe-kovalamaca analiz oligosakkarit yapısal değişikliklerin dinamikleri bir glikoprotein ömrü boyunca çalışmak için bir yöntem sağlar. ER katlama, kalite kontrol ve ticareti sistemleri 2-5 sinyalleri üreten bu tip değişikliklerin yer aldığını giderek artan kanıtlar vardır. Bu yöntem değil, sadece belirli bir ilgi glikoprotein için değil, aynı zamanda biz belirli bir ERAD substrat zıt kader ve hücresel bir glikoprotein havuzu karşılaştırıldığında bu makale...

<table><tbody><tr><td>600E Çoklu Çözücü Dağıtım Sistemi kontrolörü</td><td>Waters</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril LiChrosolv (sıvı kromatografisi için gradyan derece)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K veya Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 or 4208</td><td></td></tr><tr><td>Konsantratör 5301, 48 x 1.5 / 2.0 ml sabit açılı rotor dahil</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz edilmiş F&amp;#8211;tal Buzağı Serumu</td><td>Biological Industries</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modifiye Eagle&amp;rsquo;s Besiyeri</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modifiye Eagle&amp;rsquo;s Besiyeri - glukozsuz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu (Titriplex Iii)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf Kiti (1,000,000 units/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;tal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Frac-100 fraksiyon toplayıcı</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 Sıvı Sintilasyon Sayım sistemleri</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>Mannoz, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (Spesifik Aktivite: 15-30Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-karbobenzoksil-lösinil-lösinil-lösinil aldehit (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-glikozidaz F (1000 units/ml)</td><td>Roche Group</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-oktilglukozid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 hücreleri</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>Fosforik asit çözeltisi (49-51%, HPLC için)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitör Kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Sepharose boncukları</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-H2 karboksi-terminal &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat çözeltisi (100mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Spherisorb NH2 Kolonu, 5 &amp;mu;m, 4.6 x 250 mm</td><td>Waters</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-Cell ultrasonik işlemciler VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tampon A:&lt;/strong&gt; PBS içinde %1 Triton X-100, %0.5 w/v sodyum deoksikolat, %2 v/v Proteaz inhibitör kokteyli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tampon B:&lt;/strong&gt; PBS içinde %0.5 w/v SDS, %2 v/v Proteaz inhibitör kokteyli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tampon C:&lt;/strong&gt; N-glikozidaz F reaksiyon tamponu: 200mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8.0, 4mM EDTA, %1.5 N-oktilglukozid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2a &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; stabil olarak eksprese eden NIH 3T3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tampon D:&lt;/strong&gt; PBS içinde %0.5 Triton X-100, %0.25 w/v sodyum deoksikolat, %0.5 w/v SDS, %2 v/v Proteaz inhibitör kokteyli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tampon E:&lt;/strong&gt; PBS içinde %0.5 w/v SDS, %1 v/v 2-Merkapto&amp;#8211;etanol, %2 v/v Proteaz inhibitör kokteyli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

memeli hücrelerinde glikoproteinler n-bağlı Şeker zincirler pulse-kovalamaca analizi

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Eklenti, GLC<sub&gt; 3</sub&gt; Erkek<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; ER doğmakta olan polipeptidlerin oligosakkarit habercisi sekretuar proteinler için ortak bir değişiklik. Bu değişiklik, çeşitli biyolojik süreçlerde sorumlu olmasına rağmen, onun işlevini glikoprotein kalite kontrol ve ticareti için sinyallerinin üretimi rolünü son kanıtlar, ek yönlerini ortaya çıkmaktadır. Böylece, N-bağlı glukanlardır ve işleme ilgili fenomenler yoğun araştırmalar yapılmaktadır. Proteomik analiz için son zamanlarda geliştirilen Yöntemleri glikoprotein N-bağlantılı glukanlardır karakterizasyonu büyük ölçüde düzeldi. Buna rağmen, şeker zinciri işleme dahil dinamikleri bilgiler sağlayabilir yok. Bunun için, etiketleme ve darbe-kovalamaca analiz protokolleri genellikle karmaşık ve çok düşük verim vermesi kullanılır. Biz burada metabolik etiketli N-bağlı oligosakkaritler izolasyonu ve analizi için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol [2 hücre etiketleme dayalı.<sup&gt; 3</sup&gt; H] ilgi ya özellikle immunoprecipitated bir protein veya moleküler filtrasyon (Amicon) takip endo H ve N-glycosidase F ardışık tedaviler, genel glikoprotein havuzu mannoz, denatüre lizis ve oligosakkaritler enzimatik serbest. Bu yöntemde izole oligosakkaritler tek bir monosakkarit bir çözünürlüğe sahip, HPLC analizi, onları oluşan monosakkarit ünitelerinin sayısına göre çeşitli glukanıdır yapılar arasında ayrımcılık sağlar için bir giriş olarak hizmet vermektedir. Bu yöntemi kullanarak, normal şartlarda darbe-kovalamaca sonra proteazom inhibisyonu altında toplam hücre glikoproteinler yüksek mannoz N-bağlı oligosakkarit profilleri çalışma başardık. Bu profiller bir immunoprecipitated ER-ilişkili bozulması (ERAD) substrat elde edilen karşılaştırıldı. Bizim en NIH 3T3 hücresel glikoproteinler nispeten istikrarlı olduğunu ve kendi oligosakkaritler Man için kesilmiş olduğunu göstermektedir<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. Buna karşılık, kararsız ERAD substratlar Man kesilmiş.<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</subBu türlerin taşıyan ve glikoproteinler proteozomal bozulması inhibisyonu üzerine birikir.

Biz, memeli hücrelerinde biyosentezi sonra glikoproteinler erken ömrü boyunca N-bağlı glukanlardır değişiklik analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu darbe-kovalamaca metabolik etiketli glukanlardır, glikoproteinler ve HPLC ile incelenmesi enzimatik serbest analizi ile elde edilir.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

ER'de Glc3Man9GlcNAc2 öncül oligosakkaridinin yeni sentezlenen polipeptitlere bağlanması, salgılayıcı proteinler için yaygın bir modifikasyondur. Her ne kadar...

Glikoproteinler üzerindeki bağsız şeker zincirlerinin analizi, glikanların ve hücrelerin trityumlanmış manoz ile etiketlenmesiyle başlar. Takip (chase) tabağı istenen takip süresi boyunca etiketsiz olarak inkübe edilirken, darbe (pulse) tabağı buz üzerinde soğutulur. Ardından, örnekler lize edilir, ilgilenilen glikoprotein immünopurifikasyon ile saflaştırılır, denatüre edilir ve glikanları enzimatik olarak serbest bırakılır.Oligosakkaritler, onları proteinlerden ve 30 kilodaltondan daha büyük diğer kontaminanlardan ayıran moleküler filtrasyon ile daha ileri düzeyde saflaştırılır. Daha sonra glikanlar HPLC ile ayrıştırılır. Her bir glikan formunun miktarı, elüye edilen her bir fraksiyondaki radyoaktif sinyal yoğunluğu ölçülerek belirlenir.Merhaba, ben Tel Aviv Üniversitesi Hücre Araştırmaları ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Hi Geraldo Letter Kremer laboratuvarından Edward Azo. Aynı zamanda Gerardo Letter Kremer Slab'danım. Bugün size metabolik olarak işaretlenmiş ve bağlanmış oligosakkaritlerin izolasyonu ve analizi için bir prosedür göstereceğiz.Laboratuvarımızda bu prosedürü, hem toplam hücresel glikoprotein havuzları hem de tekil glikoproteinler için şeker zinciri işlemenin dinamikler

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

, Hücrelerden oluşan bir nüfus hücre döngüsü konumunun belirlenmesi, ya da sinyalleri çoğalması nasıl etkilediğini anlamak, bu protokolü kullanarak flow sitometri ile kolayca ölçülebilir. Biz hücreleri boyama ve hücre döngüsü konumlarını miktarının belirlenmesi için basit bir deneysel yaklaşım raporu.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

O-bağlı glikanların çeşitliliğini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, permetilasyon ve hızlı bir faz bölme yöntemi ile birlikte jel içi indirgeyici β-eliminasyon için yeni bir prosedür, SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerden doğrudan salınan O-bağlı glikanların analizine uygulanır ve kütle spektrometresi ile müteakip glikomik analize uygundur.

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Bu makale, GC-MS tarafından tespit edilmek üzere glikanların bileşen bağlarına özgü monosakkaritlere kimyasal olarak parçalanması yoluyla fraksiyonlanmamış biyoakışkanlardaki glikanların havuzlanmış bileşim profilini analiz etmek için tasarlanmış yeni bir aşağıdan yukarıya glikomik tekniğinin geliştirilmiş bir biçimini sunmaktadır. Potansiyel uygulamalar arasında kanser ve diğer glikan-afektif bozuklukların erken tespiti yer alır.

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Bu Western blot ile SCAP N -glycosylation ve toplam proteinin belirlenmesi için insan hücrelerinden membran fraksiyonu izolasyonu ve numune hazırlama yönelik değişik bir metot tarif etmektedir. Biz daha konfokal mikroskopi kullanılarak SCAP ticaretini izlemek için bir GFP-etiketleme yöntemi tanıtmak. Bu protokol, normal bir biyolojik laboratuvarlarda kullanılabilir.

Scap analizi<em&gt; K</em&gt; İnsan Hücreleri -glycosylation ve Ticareti

Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.

Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) protein yapılarını ve fonksiyonlarını değiştirir. Birden fazla PTM tipinin aynı anda zenginleştirilmesi yöntemleri, analizlerde kapsama alanını en üst düzeye çıkarabilir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisini ve ardından pankreas dokularında protein N-glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı zenginleştirilmesi ve analizi için kütle spektrometresini kullanan bir protokol sunuyoruz.

İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi

Burada, rutin mikroskopi ekipmanı kullanarak hücre içi sialillenmiş N-glikoproteinlerin biyogörüntülemesine izin veren metabolik oligosakkarit mühendisliği, tıklama kimyası ve genleşme mikroskobunu birleştiren basit bir protokol öneriyoruz.

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Öğrenin, memeli hücrelerinde N-bağlı glikanların dinamik değişimlerini pulse-kovalamaca ve HPLC analizi ile izleme yöntemini. Bu teknik glikoprotein biyosentezini ve hücresel süreçleri anlamak için kullanılır.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Daha fazla video keşfet