Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Glikoproteinler üzerindeki bağsız şeker zincirlerinin analizi, glikanların ve hücrelerin trityumlanmış manoz ile etiketlenmesiyle başlar. Takip (chase) tabağı istenen takip süresi boyunca etiketsiz olarak inkübe edilirken, darbe (pulse) tabağı buz üzerinde soğutulur. Ardından, örnekler lize edilir, ilgilenilen glikoprotein immünopurifikasyon ile saflaştırılır, denatüre edilir ve glikanları enzimatik olarak serbest bırakılır.

Oligosakkaritler, onları proteinlerden ve 30 kilodaltondan daha büyük diğer kontaminanlardan ayıran moleküler filtrasyon ile daha ileri düzeyde saflaştırılır. Daha sonra glikanlar HPLC ile ayrıştırılır. Her bir glikan formunun miktarı, elüye edilen her bir fraksiyondaki radyoaktif sinyal yoğunluğu ölçülerek belirlenir.

Merhaba, ben Tel Aviv Üniversitesi Hücre Araştırmaları ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Hi Geraldo Letter Kremer laboratuvarından Edward Azo. Aynı zamanda Gerardo Letter Kremer Slab'danım. Bugün size metabolik olarak işaretlenmiş ve bağlanmış oligosakkaritlerin izolasyonu ve analizi için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü, hem toplam hücresel glikoprotein havuzları hem de tekil glikoproteinler için şeker zinciri işlemenin dinamiklerini incelemek amacıyla kullanıyoruz. Tamam, hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, 90 mm'lik bir kapta gece boyunca büyütülmüş NIH 3T3 hücrelerini kullanın.

Her örnek için, glikoz açlığı oluşturmak amacıyla kültürler alt konfluen aşamada tutulur; %20le diyalize edilmiş FCS ve sekiz milimolar sodyum piruvat içeren taze 2x glikozsuz besiyeri hazırlanır; istenilen miktardaki 2x besiyerinin bir hacmi, bir hacim deiyonize su ile seyreltilir. Besiyeri ön ısıtmaya tabi tutulur, ardından her hücre örneği beş mililitre taze ön ısıtılmış besiyerinde beş ila 15 dakika boyunca inkübe edilir. Eğer 12 saatten daha uzun süreli bir takip (chase) süresi gerekiyorsa, hücreler steril koşullar altında işlenmelidir.

İnkübasyon süresinin sonunda, pulse ve chase örneklerine karşılık gelen kapları işaretleyin. İmmünopresipitasyon yoluyla glikoprotein analizi için n-glikanları etiketlemek amacıyla, açlık ortamını mililitrede 400 micro curie iki tritium işaretli manoz eklenmiş, önceden ısıtılmış glikozsuz ortamın bir mililitresi ile değiştirin. Toplam glikoproteinlerin etiketlenmesi ve analizi için mililitrede 65 micro curie kullanın.

Açlık ortamını değiştirdikten sonra, hücreleri bir saat boyunca normal doku kültürü koşullarında inkübe edin. Bir saatlik inkübasyonun sonunda, tüm örneklerdeki işaretleme ortamını uzaklaştırın. Pulse örneklerine karşılık gelen örneklere, dört santigrat derece sıcaklıkta iki mililitre PBS'yi dikkatlice ekleyin ve buz üzerine yerleştirin. Bu örnekler pulse örnekleri olarak adlandırılır.

İki mililitre ön ısıtılmış normal complete kültür medyumu kullanın. Chase örneklerini üç kez durulayın. Ardından hücrelere beş mililitre ön ısıtılmış regular medyum ekleyin.

Chase örneklerini, istenen chase süreleri boyunca 37 °C'de bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Chase örneklerinin inkübasyonu sırasında, buz üzerinde bekletilen pulse örneklerini iki mililitre buz gibi soğuk PBS ile üç kez durulayın. Ardından, hücreleri kaptan sıyırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Serbest bırakılan hücreleri, 2 mL PBS içeren 2 mL'lik bir EOR tüpüne yerleştirin. Süpernatanı uzaklaştırmak için hücreleri 16,000 g'de 6 ila 10 saniye boyunca santrifüjleyin ve hücre peletini -80 °C'de dondurun. Kovalama (chase) örneklerinin inkübasyonu tamamlandığında, bunları durulayın.

Pulse örnekleri için gösterildiği şekilde santrifüjleyin ve saklayın. Hücre lizisine geçmeye hazır olduğunuzda hücreleri dondurucudan çıkarın. IP analizi için 300 microliters tampon ekleyerek hücreleri lize edin.

Kısa bir süre vorteksleyin ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. 300 µL tampon B içeren toplam glikoprotein örneklerinin analizi için; hücreleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin ve ardından maksimum genlikte, her biri 10 saniye sürecek şekilde dört kez sonikasyona tabi tutun. Sonrasında örnekleri beş dakika boyunca kaynatın.

Son olarak, tüm lizatları 4 °C'de 20 dakika boyunca 16,000 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir EOR tüpüne aktarın ve peleti atın. Burada gösterilen H two A glikoproteinin immünopresipitasyonu için hedef proteini incelemek amacıyla IP aşamasına geçin.

Lizlenen hücrelerin süpernatantına örnek başına 20 microliter Protein A/G beads ve örnek başına 3 microliter laboratuvarın rabbit polyclonal anti H2A antikorunu ekleyin. Örnekleri, yavaş rotasyonla sürekli karıştırarak 4 °C'de 4 ila 16 saat inkübe edin. İnkübasyon sonunda boncukları çöktürün ve süpernatantı bir vakum yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın, ardından boncukları 500 microliter tampon çözelti ekleyerek dört kez yıkayın.

Boncukları çöktürmek ve bağlı proteinleri boncuklardan ayırmak için süpernatantı uzaklaştırın. Endo H kitindeki denatüre edici tampondan 10 µL miktarında boncuk peletine ekleyin ve örnekleri beş dakika boyunca kaynatın. Boncukları çöktürün ve süpernatantı yeni bir EOR tüpüne aktarın.

Ellu proteinleri artık deglikozilasyon için hazırdır. Glikanlar, hem IP hem de toplam protein örneklerinden enzim ve OH kullanılarak ayrıştırılır. IP örnekleri için, her bir örneğe 10 µL 2x endo H reaksiyon tamponu ile birlikte 0,5 µL endo H enzimi ekleyin. Örnekleri 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Toplam glikoproteinler için, hücre lizatlarının süpernatantını 30 kilodalton kesme sınırına sahip bir MicroCon filtreye uygulayın. Toplam protein ekstraktını, 14.000 Gs'de tekrarlanan santrifüjle 100 mikrolitre tampon E ile üç kez yıkayın. Üç dakika boyunca, yıkanmış proteinlerin kaldığı MicroCon'a üç mikrolitre 10 x endo H reaksiyon tamponu ve 1,5 mikrolitre endo H enzimi ekleyin ve IP örnekleriyle birlikte 37 derece Celsius'ta üç saat boyunca inkübe edin.

Üç saatlik inkübasyonun sonunda, IP örneğini deiyonize su ile beş kat seyrelterek yeni bir MicroCon filtrenin üzerine yerleştirin ve 14,000 Gs hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin. Hem IP hem de toplam protein örneklerini 50 µL deiyonize su uygulayıp santrifüjleyerek yıkayın. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. İsteğe bağlı olarak, endo H içeren tüpler aracılığıyla ayrılmış glikanları içeren akış sıvısını saklayın. Endo H dirençli glikoproteinler daha sonra 37 °C'de 16 saat boyunca 15 µL tampon C içinde 200 mU N-glikosidaz F ile inkübe edilir.

Deiyonize su ile elüsyon işlemi az önce gösterildiği şekilde yapılır. Süreci hızlandırmak için 45 °C'ye kadar ısıtmaya sahip bir hızlandırılmış konsantratör kullanarak numuneleri tamamen kurutun. Kuru peletleri 12 µL HPLC çözücüsünde yeniden süspande edin ve numuneleri HPLC cihazına takılı bir sphe veya amino kolona yükleyin.

Numuneleri beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı şekilde çalıştırın. Her numune çalışması için 48 fraksiyon toplayın. Toplanan fraksiyonların CPM değerlerini ölçmek için bir sintilasyon sayacı kullanın ve CPM okumasını fraksiyon numarasının bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün.

Ekteki yazılı protokolde açıklandığı şekilde, tüm glikan türlerinin manoz kalıntısı yüzdesini hesaplayın. Burada, bir saatlik puls etiketleme örneğinden elde edilen toplam glikoproteinlerin şeker zinciri analizine ait temsili sonuçlar yer almaktadır. HPLC fraksiyonlarının CPM okuması, ortaya çıkan profilde fraksiyon numarasının bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülmüştür.

Her bir pik, bilinen glikan standartlarının bir HPLC çalışmasıyla tanımlanan spesifik bir glikan türünü temsil eder. Her glikan türü için, toplam glikanların molar yüzdesi, takip süresinin bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülmüştür. Burada gösterilen süre, proteazom inhibitörü MG 1 32 ile işlem görmüş bir örnekten immünopresipitasyon yoluyla izole edilen spesifik bir yanlış katlanmış glikoprotein için yapılan böyle bir analizi yansıtmaktadır.

Budanmış glikan türü M five six, takip süresi boyunca birikmekte olup bu durum, hatalı katlanmış proteinler üzerindeki oligosakkaritlerin degradasyondan önce kapsamlı bir manoz budanmasına uğradığı sonucuna yol açmaktadır. Bu durum, aynı şekilde işlem görmüş örneklerden elde edilen toplam glikoproteinler üzerindeki oligosakkaritlerle tezat oluşturmaktadır. Burada, takip süresi boyunca M nine eight ana glikan türü olarak kalırken, M five six miktarında yalnızca küçük bir artış görülmektedir. Bu da toplam glikoprotein havuzunun sadece küçük bir kısmının ER ile ilişkili protein degradasyonuna yönlendirildiği sonucunu doğurmaktadır.

Kısaltılmış rad. Ekteki yazılı protokolde daha ayrıntılı açıklandığı üzere, glikoproteinin ömrü boyunca bağsız oligosakkarit kompozisyonunun dinamiklerini takip etmek için canlı hücrelerde palase ve HPLC analizinin kombinasyonunun nasıl kullanılacağını gösterdik. Bu prosedürü uygularken, kovalama örneklerinin radyoaktif izlerle kontamine olmasından kaçınmak gerektiğini unutmamak önemlidir; aksi takdirde, boyut ayırımı sırasındaki kovalama dönemlerinde glikanların istenmeyen şekilde etiketlenmesi meydana gelecektir.

Glikanların fraksiyonlamasının tutarlılığını sağlamak için HPLC'yi sabit bir basınca ayarlamak da önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.