İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında

Bu protokol, insan kortikal dokusunda beta malters tespitine olanak tanır. İlk olarak, homogenize edilmiş doku prob sonikasyonuna tabi tutulur ve düşük hızlı santrifüjleme ile berraklaştırılır. Ardından, indirgenmiş örnekler SDS tamponunda kaynatılır ve poliakrilamide yüklenir.

Jel proteinleri bir nitrocelluloz membrana aktarılır ve membran, fosfat tamponlu salin içinde buharla ısıtılır. Son olarak, bir orbital çalkalayıcı üzerinde membran; önce birincil antikor, ardından HRP konjuge ikincil antikor ve x-ışını filmine maruz bırakılmadan önce luminal peroksit reaktifi ile gece boyu inkübe edilir. Merhaba, ben Emory Üniversitesi Yerkes Ulusal Primat Araştırma Merkezi Nörobilim Bölümü'ndeki Larry Walker laboratuvarından Rebecca Rosen.

Bugün size, ısı ile indüklenen antijen geri kazanımıyla birlikte SDS jel elektroforezi ve immünoblotlama kullanarak Abeta multimerlerini ve kortikal homojenleri nasıl tespit edeceğinizi göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, Alzheimer hastası insanlardan ve yaşlı insan dışı primatlardan alınan tespit edilmemiş kortikal dokulardaki farklı Abeta multimerlerinin seviyelerini ve dağılımını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Yaklaşık yüz miligram fiksasyon yapılmamış kortikal doku ile başlayın ve yaklaşık 30 eşit havan darbesiyle, buz gibi soğuk 400 µL tampon çözelti içerisinde homojenize edin. %20 ağırlık/hacim oranı için, doku ağırlığının tampon çözelti hacmine oranı bir mg'a dört µL olmalıdır. Homojenizasyon sonrası homogenatları dört mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın ve beş güç seviyesinde, beşer saniyelik üç kez prob sonikasyonuna tabi tutun.

Sonikasyondan sonra homojenatları 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 3000 G'de beş dakika santrifüjleyin, berraklaşmış süpernatantları dikkatlice alın ve bu ekstraktların 50 mikrolitrelik alikotlarını kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak bir bio acid veya BCA analizi kullanarak, yeni çözülmüş berraklaşmış homojenat alikotlarının toplam protein konsantrasyonunu belirleyin; berraklaşmış %20 kortikal homojenatlar 5 µg/µL'den daha yüksek bir protein konsantrasyonuna sahip olmalıdır ve bu nedenle plak okuyucunun menzili içinde kalmak için 1:10 oranında seyreltilebilir. BCA analizi için, berraklaşmış homojenatların aynı alikotları ile denatüre örnek reaksiyonlarını hazırlayın.

Yaklaşık 50 ila 60 µg toplam protein kullanın ve her birinin aynı toplam proteini içermesi için kortikal homojenatların hacmini buna göre ayarlayın. Çalıştırılacak her bir %10 ila %20 tris-glisinol jel için örnekleri toplam 25 µL hacme hazırlayın. Her bir jel için; 1X PBS'de seyreltilmiş 10 ila 100 ng sentetik Aβ40 veya Aβ42 peptidinden 10 µL, 12,5 µL 2X SDS örnek tamponu ve 2,5 µL 10X indirgeme ajanı kullanarak bir pozitif kontrol hazırlayın.

Beta kontrolü dahil tüm numuneler hazırlandıktan sonra, numuneleri beş ila 10 saniye boyunca vorteksleyin ve bir kuru banyoda 100 °C'de beş dakika boyunca ısıtın, ardından kapaktaki yoğunlaşmayı gidermek için tüm tüpleri hızlıca santrifüjleyin. Numuneleri, bir jel kutusu içerisinde tris SDS çalıştırma tamponuna daldırılmış bir jele yükleyin ve en az bir kuyuya 10 µL seyreltilmemiş moleküler ağırlık markörü yükleyin. Jeli 125 V sabit voltajda yaklaşık 90 dakika boyunca veya 4 kDa markörü jelin alt kısmından yaklaşık 1 cm uzaklığa gelene kadar çalıştırın.

Jelleri plastik kasalardan dikkatlice çıkarın ve transfer sandviçini üretici talimatlarına göre hazırlayın. Blotlama pedlerini ve mikrometre nitrocellüloz membranları tris glisin transfer tamponu ile önceden ıslatın. Blotlama pedlerinde veya filtre kağıdı membran sandviçinde oluşan tüm hava kabarcıklarını giderin.

Transfer düzeneğinin iç haznesini transfer tamponu ile, dış haznesini ise distile su ile doldurun. Transfer işlemini 25 milliamps sabit akım değerinde iki ila üç saat boyunca gerçekleştirin. Transfer tamamlandığında, sandviç yapıyı sökün ve jelleri distile suyla dolu bir kaba, membranları ise tüm protokol adımları için 1X PBS ile dolu bir kaba yerleştirin.

Kurumayı önlemek için jellerin ve membranların tamamen sıvı ile kaplı olduğundan emin olun. Protein transferinin verimliliğini görselleştirmek için jelleri seyreltilmemiş Simply Blue Safe boyası ile yaklaşık bir saat, membranları ise 1x Ponceau S kırmızı boyası ile yaklaşık beş dakika inkübe ederek boyayın. İnkübasyon süresini üretici talimatlarına göre ayarlayın; bu boyama işlemi immünoblotlamayı etkilemeyecektir.

Boyama sonucunda protein transferinin yetersiz olduğu görülürse, antijen geri kazanımı için üçüncü adımdaki transfer süresini değiştirin. Oda sıcaklığında yaklaşık 50 mililitre 1X PBS ile doldurulmuş, dayanıklı bir CapEx plastik poşet içindeki membranı bir buharlaştırıcıda ısı ile mühürleyin. Poşeti, 100 °C'ye önceden ısıtılmış buharlaştırıcının içine düz bir şekilde yerleştirin; poşet genleşmeye başladığında, buharlaştırıcıdan çıkarmadan önce 15 dakika daha inkübe edin.

Oda sıcaklığında aşırı kırışmayı önlemek için, membranı poşetten çıkarmadan önce yavaşça soğumasını bekleyin. Membranı dikkatlice poşetten çıkarın ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde beş dakika boyunca 1X PBS ile, ardından beş dakika boyunca TBST ile durulayın. Sonrasında, membranı durulama yapmadan bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca bloklama solüsyonu içerisinde inkübe edin; ardından membranı, bloklama solüsyonu içerisinde 1:1000 ile 1:5,000 arasında seyreltilmiş, A beta ve terminal bölgesine özgü olan primer antikor six E 10 içeren bir kaba aktarın.

Oda sıcaklığında bir saat boyunca ve ardından 4 °C'de çalkalamalı orbital sarsıcıda 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Bir kez hızlıca duruladıktan sonra, membranı 30 dakika boyunca yıkayın. TBST ile orbital sarsıcıda her biri 10 dakika süren üç durulama işlemiyle devam edin.

Membranı, bloklama solüsyonunda 1:10.000 oranında seyreltilmiş HRP konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında, çalkalayıcı üzerinde 90 dakika inkübe edin. Bu protokolde koyun anti-US antikoru kullanılmıştır. Membranı tekrar, önce bir kez hızlı durulama ve ardından orbital çalkalayıcıda üç kez 10'ar dakikalık durulamalarla, TBST içerisinde 30 dakika boyunca yıkayın.

Son yıkamanın ardından, membranı taze hazırlanmış, seyreltilmemiş super signal West Pico ECL reaktifleri içinde beş dakika inkübe edin. Yüksek RPM'de çalışan çalkalayıcı üzerindeyken membranı çıkarın ve fazla reaktifi süzün. Tüy bırakmayan filtre kağıdı veya kim wipe kullanarak membranı, plastik koruyucu sayfalar arasında bir film kasetine yerleştirin ve ek super signal reaktifini tozsuz Kim wipe'lar ile kurulayın.

Gerekirse, 30 saniyelik aralıklarla 30 dakikaya kadar Kodak Biomax MR.Film'e maruz bırakın ve bir film banyosunda geliştirin. Bu deneyde, beş dakika sonra A beta monomer bantları muhtemelen doygunluğa ulaşacaktır. Yedi insan denekten alınan toplam 50 mikrogram protein içeren berraklaştırılmış homojenatlar, multimerik beta amiloid veya a beta ve amiloid öncül proteini veya a PP (A beta peptidinin kesildiği transmembran protein) varlığı açısından analiz edilmiştir.

Burada, 30 dakikalık ve beş dakikalık pozlama sürelerine sahip bir A beta a PP western blot deneyinden temsili görüntüler sunuyoruz. 30 dakikalık pozlama, Abeta'nın çok daha hafif olan dimer, trimer, tetramer ve daha yüksek moleküler ağırlıklı veya ligand bantlarının görselleştirilmesine olanak tanır, ancak beş dakikalık pozlama süresindeki diğer şeritleri aşırı pozlar. Aynı tetramer bandı mevcuttur ancak sönüktür ve diğer şeritlerin net bir şekilde görselleştirilmesine olanak sağlar.

Birinci ila üçüncü şeritlerde Alzheimer hastalığı (AD) olan deneklerden alınan kortikal homojenatlar, dördüncü şeritte Lewy cisimcikli demans (DLB) ve Alzheimer hastalığı tanısı almış bir insan denek, beşinci ve altıncı şeritlerde Lewy cisimcikli demans vakaları ve yedinci şeritte yaşlı, demanssız bir insan kontrol vakası görülmektedir. 6C10 antikoru ile yapılan immünoblotalama, tüm Alzheimer vakalarında Aβ monomerlerini, dimerlerini, trimerlerini, tetramerlerini ve oligomerlerini ortaya çıkarmış; ayrıca iki AD vakasında bol miktarda yüksek moleküler ağırlıklı Aβ multimerleri saptanmıştır, bu durum insan denekler arasındaki Aβ agregasyonunun heterojenliğini göstermektedir.

Sağ şeritteki beta 40, düşük moleküler ağırlıklı bantların kimliğini doğrular. Nörodejeneratif hastalıkları olan insanların beyinlerinden alınan tespit edilmemiş doku homojenatlarında beta multimerlerini belirlemek için bir SDS-PAGE Western Blot deneyi gerçekleştirdiğimizi gördünüz. Bu prosedürü uygularken, daha düşük bolluktaki Abeta multimerlerini ortaya çıkarmak için jel elektroforezi ile ayrıştırmak üzere yüksek konsantrasyonlu kortikal homojenat hazırlamak önemlidir.

Abeta peptidini hedefleyen bir antikor ile immün blotlama yapmadan önce ısı ile indüklenen antijen epitop geri kazanımının gerçekleştirilmesi de önemlidir. Antijen geri kazanımı, immün blotlama sırasında optimal antikor bağlanması için gizlenmiş Abeta epitoplarının açığa çıkarılmasına yardımcı olur. 100 °C sıcaklığı koruyabilen herhangi bir buharlaştırıcı, mikrodalga fırın veya su banyosu yeterli olacaktır.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.