Name: MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Öğrenin MALDI-MS için ultra ince tabaka yöntemiyle protein numune hazırlama tekniklerini. Bu yöntem, kütle spektrometrisinde doğru kütle tayini için temiz plaka kullanımı ve HPLC kalite reaktiflerle hassas analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu ince bir tabaka hazırlanması sırasında pudrasız eldiven giymek çok önemlidir. Örnek plaka temizliği <ol><li> Paslanmaz çelik ya da altın MALDI örnek tabak kullanın. </li><li> MeOH ile yıkayın ve bir Kimwipe hafifçe silin. Yüzeyin çizilmemesi için, Kimwipe yüzey rub veya fırçalayın. </li><li> H 2 O ile yıkayın ve bir Kimwipe hafifçe silin. </li><li> MeOH ile yıkayın ve bir Kimwipe hafifçe silin. </li><li> Gerekirse, her zaman MeOH ile biten MeOH / H 2 O / MeOH temizleme programı tekrarlayın. </li><li> Plaka üzerinde kalan hayalet lekeler veya kalıntı olmadığından emin olun. Hayalet lekeler varsa, eldivenli el (Kimwipes ile ovmak) ile yüzey sürtünme deiyonize su ile plaka durulayın. MeOH / H 2 O / MeOH temizleme döngüsünü tekrarlayın. </li><li> Hemen yıkandıktan sonra plaka kullanın. </li></ol> Ince bir tabaka substrat çözeltisi hazırlanması <ol><li> Doymuş 4-HCCA (2 parça ACN, 1 kısım su,% 0.1 &#39;i son TFA) ve 3 parça izopropanol 1 kısım karıştırın. Not: ince bir tabaka substrat çözeltisi çok kararlı, ve bir yıl boyunca karanlıkta, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir . Aynı zamanda 4 saklanabilir ° C </li></ol> Ince bir tabaka substrat <ol><li> 20-50μL plakanın merkez sol, ve bir pipet ucu tarafında ile yayılması üzerine ince bir tabaka substrat çözeltisi uygulayın. Tek yönde Sweep. </li><li> Çözüm kurur, çok hızlı bir şekilde organik çözücü buharlaşır, plaka yüzey dakika su damlacıkları geride bırakarak. Bu noktada, bir Kimwipe kat ve başlangıçta ile plaka yüzeyine hafifçe kurulayın işaret parmağınıza sarın. </li><li> Yüzey su damlacıkları serbest olduğunda, bir Kimwipe kullanarak tek yönlü süpürme hareketleri ile tüm plaka silin. Not: çözüm plaka yüzeyi boyunca yeterince yayılmış değilse, ACN kompozisyon artırmak ve ince bir tabaka yeniden. Çözüm yayılmasını etkileyebilecek bazı parametreler, ortam nem ve sıcaklık içerir. Not: altın plakalar, tabaka genellikle görüntüleme ve ışık açıları bağlı olarak sarımsı bir yansıması olarak belirir. Çelik plakalar ile, sadece katmanı kenarına normalde görünür. </li><li> Matris Cihazı karışmasını önlemek için plaka sahibi yerleştirerek önce taze bir Kimwipe plaka kenarlarını temizleyin. </li></ol> Matris çözümü hazırlanması <ol><li> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">4-HCCA Doymuş</a> FWI (formik asit 3 parça, 1 kısım su, 2 parça izopropanol), membran ve çözünür proteinler hem analizi için tavsiye edilir . Çok hidrofobik büyük peptidler (M&gt; 4.000 &#39;u) analizi için, özel durumlarda da kullanılır olabilir. Proteinleri tespit etmek için kullanılan matris çözümü, tamamen yöntemin avantajları yenerek, ince bir tabaka substrat eriyecektir olarak ~% 50 organik içeriği fazla değildir ki emin olun. </li></ol> Ince bir tabaka substrat Testi <ol><li> Plaka üzerinde matris çözüm Spot 0.5μL. Beyaz çökelek, ince bir tabaka ve damlacık arasındaki arayüz görünecektir. Bu katman tamamen damlacık alt kapakları, genellikle 10-15 saniye içinde, bir vakum hattı ile aşırı sıvı aspire. Çökelti oluşturmak için 30 saniye daha uzun sürerse, bu ince bir tabaka substrat ve / veya matris çözümü ile ilgili bir sorun olabileceğine dair bir göstergesidir. </li></ol> Örnek uygulama <ol><li> Başlangıç ​​çözümleri analit konsantrasyonu 10 ve 1000μM içinde olması gerekir. </li><li> 0.2 2μM arasında nihai bir analit konsantrasyonu matris çözümü analit çözüm sulandırınız. Örneğin, örnek ve matris çözüm 9μl 1μl ile başlar. Not: matris nihai çözüm doymuş yakın olduğundan emin olun, aksi takdirde ince bir tabaka substrat çözülür. Not: terbiyeli sinyaller elde etmek için gerekli analit konsantrasyonları çözüm karmaşıklığı ve kompozisyon (örneğin, kirleticiler) ve analit ionizability son derece bağımlıdır. Not: tek bir adım seyreltme iyi sonuç vermezse, bir başka sulandırma adım denemelisiniz. Sezgilere rağmen, yüksek oranda konsantre analit çözümleri nadiren iyi spektrumları üretir. Not: Zar proteinleri genellikle büyük dilüsyonları gerektirir. </li><li> Plaka örnek / matris karışımı Spot 0.5μl. Beyaz çökelek, ince bir tabaka ve damlacık arasındaki arayüz oluşturacak. Bu çökelti matrisi ve analit cocrystallization. Bu katman tamamen damlacık alt kapsar, usu10-15 saniye içinde bir müttefik, bir vakum hattı ile aşırı sıvı aspire. Çökelti oluşturmak için 30 saniyeden daha uzun sürerse, kristalizasyon engeller veya analit çok yoğun olduğu bir bulaşan bir göstergesi olabilir. </li></ol> Kalibratörü uygulama <ol><li> 0.1-0.5μM arasında son kalibratörü konsantrasyon ile benzer bir şekilde kalibrant / matris karışımı hazırlayın. </li><li> Spot 0.5μl kalibrant örnek noktalara yakın plaka / matris karışımı. Bu fiziksel yakınlık plaka spektrumu calibrants birkaç lazer çekim eklemek için örnek satın alma sırasında kalibratörü nokta, örnek noktaya taşınmış olan bir sözde-dahili kalibrasyon prosedürü kullanılır. Bu yaklaşım, sadece harici kalibrasyon daha yüksek bir kütle doğruluğu kalibrasyon garanti eder. </li></ol> Adım Yıkama <ol><li> Buz gibi% 0,1 sulu TFA çözüm yaklaşık 2μL her yerinde yıkayın. Bir vakum hattı ile aşırı sıvı aspire. </li></ol> Kitle spektrumu Alımı <ol><li> Artık kitle spektrumu elde etmek için hazır. FWI matris çözümü kullanıyorsanız formylation olarak analit geri dönüşü olmayan bir değişiklik önlemek için mümkün olan en kısa sürede size spektrumları almanız gerekir. </li></ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

Tüm reaktifler en yüksek kalitede (örneğin HPLC grade) olduğu kritik öneme sahiptir. Pudrasız eldiven (lateks veya nitril) Paslanmaz çelik ya da altın MALDI örnek plaka Metanol (MeOH) Su Kimwipes alfa-siyano-4-hydroxycinnamic asit (4 HCCA) Trifloroasetik asit (TFA) (H 2 O final konsantrasyon% 0.1) Asetonitril (ACN) Formik asit Isopropanol

maldi numune hazırlama: ultra İnce tabaka yöntemi

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) 1, 2, peptidler ve proteinler analiz etmek için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir. Ultra-ince bir tabaka yöntemi, matris kristalleri bir matris / analit karışımı sonraki kristalizasyon için ekim alanı olarak hizmet veren örnek bir tabak, bir substrat katmanı üretimi (alfa-siyano-4-hydroxycinnamic asit) içerir. Diğer örnek birikimi yaklaşımlar (örneğin kuru damlacık) üzerinden ultra-ince bir tabaka yöntemin avantajları (i), tuzları ve deterjanlar, (ii) daha iyi çözünürlük, ve (iii) yüksek uzaysal tekdüzelik gibi kirleri daha fazla dayanıklılık sağlar. Bu yöntem, proteinlerin doğru kitle belirlenmesi için özellikle yararlıdır. Bu protokol başlangıçta geliştirilmiş ve membran proteinlerin analizi için optimize edilmiş ve başarıyla iyon kanalları, metaboliti taşıyıcılar ve reseptörler analiz etmek için kullanılır, 2 ile 12 transmembran etki alanı 2 arasındaki içeren oldu. Orijinal yayınlandığından beri, aynı zamanda eşit çözünür proteinlerin analizi için yararlı olduğu gösterilmiştir. Gerçekten de, 380 kDa 3 gibi yüksek molekül kitleler de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede, özellikleri olan proteinlerin çok sayıda kullanmıştır. Şu anda tüm proteinlerinin moleküler kitle analizi için tercih edilen bir yöntemdir. Açıklanan prosedür tutarlı, yüksek kaliteli spektrumları üretir ve hassas, sağlam ve uygulanması kolay.

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Bu video, Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyon... ile peptidlerin ve proteinlerin analizi için ultra ince bir matris/analit tabakasının hazırlanmasını göstermektedir.

Proteinlerin hassas kütle tayini için özellikle yararlı olan ultra ince tabaka yöntemi hakkındaki CHI Lab eğitimine hoş geldiniz. Kütle spektrometrisinin hassas doğası nedeniyle, plakayı temizlemek için yalnızca HPLC saflığındaki reaktiflerin yanı sıra pudrasız lateks veya nitril eldivenler kullanıyoruz. Sırasıyla metanol ve su ile durulayın, ardından son olarak tekrar metanol ile durulama yapın.Her durulama arasında, fazla solventi lens mendili kullanarak nazikçe silin. Temiz bir plak elde etmek için bu yıkama adımlarını gerektiği kadar tekrarlayabilirsiniz. Temizleme ve kurutma işlemi tamamlandıktan sonra plaka derhal kullanılmalıdır.Temiz MALDI plakası üzerine 20 ila 30 µL ince tabaka substrat çözeltisi uygulayın ve yayın. Burada, plakayı çizmekten kaçınarak çözeltiyi eşit şekilde yaymak için P20 veya P200 pipet ucu kullanılır. İnce tabaka kurudukça, eğer varsa kalan su damlacıklarını bir kim wipe ile nazikçe tamponlayarak temizleyin.Ardından, ince tabakanın düzgünce oluşması için plakayı bir Kim wipe ile tek ve pürüzsüz bir hareketle nazikçe silin. Son olarak, kütle spektrometresini kontamine etmemek için plakanın kenarlarını temizleyin. Numuneyi uygulamadan önce ince tabakayı test etmek kritik öneme sahiptir.Kristallerin homojen olmadığı ve test noktasının kurumasının çok uzun sürdüğü durumlarda, sorun ince tabakanın kendisinden veya matriks çözeltisinden kaynaklanıyor olabilir; plakayı temizleyin, ince tabakayı yeniden uygulayın ve testi tekrarlayın. İnce tabaka üzerine uygulama yaparken, noktalarınızın tamamen kuruyana kadar buharlaşmasını istemezsiniz. Bunun yerine, kristalleşme yavaşlayıp durduğunda, fazla çözücüyü uzaklaştırın.Vakum aspiratörü kullanarak; tuzlar ve deterjanlar gibi kontaminantların varlığı ile yüksek analit konsantrasyonu kristalleşmeyi engelleyebilir. Örneği daha fazla seyreltmek kristalleşmeyi iyileştirebilir. Karıncaları örneğe yakın konumlandırın. Bu, plakanın örnek noktasından kalibrasyon noktasına taşındığı psödo iç kalibrasyona olanak tanıyacaktır.Numune alımı sırasında, spektruma CAS'den birkaç lazer atışı eklemek, bu yaklaşımın yalnızca harici kalibrasyondan daha yüksek bir kütle doğruluğu kalibrasyonu sağlamasını garanti eder. Analit iyonlaşmasını engelleyebilecek tuz veya deterjan gibi tüm kontaminantların yıkanarak uzaklaştırılması çok önemlidir. Bunu yapmak için, buz gibi soğuk, %0,1 Trifloroasetik asit içeren HPLC grade suyu doğrudan lekelerin üzerine damlatın.Burada gösterildiği gibi, bir vakum aspiratörü kullanarak yıkama solüsyonunu uzaklaştırın. Bu yöntem, hem membran hem de çözünür proteinler için mükemmel spektrumlar üretir.

maldi-sample-preparation-the-ultra-thin-layer-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Dopamin değiştirme farmakoterapi L-DOPA ile Parkinson hastalığının en yaygın olarak kullanılan semptomatik tedavi, anormal istemsiz hareketleri olarak adlandırılan diskinezi dahil olmak üzere, yan etkileri ile...

Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

Bu, insan serumu ile düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler selektif geri kazanımı için gözenekli silis ince film dayanan bir teknoloji geliştirilmiştir. Bizim gözenekli cips fiziko-kimyasal özellikleri ince peptid zenginleştirme önemli kontrolü sağlamak ve sonuçta tanısal amaçlı serum proteom profil ayarlı edildi.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Kitle spektometrik görüntüleme (MSI), biyolojik süreçler içine yeni anlayışlar sağlayabilir kendi doğal ortamlarında bileşikleri koruyarak, sağlam dokularda çeşitli kimyasal türler keşfetmek ve tanımlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Burada küçük moleküllerin analizi için geliştirilmiş bir MSI yöntem tarif edilmektedir.

Metabolitlerdeki Soruşturma MALDI-Kütle Spektrometrik Görüntüleme<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Kök Nodüller

Atmosferik basınçta çalıştırılan bir kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) kaynağı, orta kızılötesi lazer desorpsiyonu ve elektrosprey post-iyonizasyonun birleştirilmesiyle geliştirilmiştir. Doku ile ilgili materyalin rezonans desorpsiyonunu kolaylaştırmak için enerji emici matris olarak eksojen buz matrisi kullanıldı. Bu makale, tüm vücut yenidoğan faresinin IR-MALDESI MSI'sini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sağlar.

Kızılötesi Matriks destekli lazer desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon tarafından tüm vücut Kütle Spektrometre Görüntüleme (IR-MALDESI)

Örnek Kurutma işlemleri esnasında alt-tabaka sıcaklığının ayarlanması sayesinde yöntemde MALDI kütle spektrometresi iyon sinyallerin uzaysal farklılıklarını azaltmak için bir kuralı gösterilmektedir.

Kantitatif Uygulamalar için Homojen MALDI Örneklerin Hazırlanması

Numune hazırlama bir roman yöntemi görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak küçük molekül alışverişte algılamak için hücre ve doku coculture karşılamak için geliştirilmiştir.

Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Bu protokolün amacı, biyolojik örneklerde metabolik ve moleküler tespiti en üst düzeye çıkarmak için MALDI MSI kullanarak deneyler planlarken numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.

MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

Bu protokolün amacı, matris yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisi görüntülemesini kullanarak Drosophila beyni gibi küçük dokularda lipit ve metabolit analizi için uygun numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Görüntüleme Kullanarak Drosophila Beyinde Hızlı Lipid Analizi için Örnek Hazırlama

Bu protokol, floresan kılavuzlu, tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometresi için mikroMS kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve birincil sıçan nöronal hücrelerinin gelişmiş moleküler profilini çıkarmayı sağlar.

Bireysel Sıçan Nöral Hücrelerinin Lazer Kaynaklı Postiyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Floresan Kılavuzluğunda Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon

Öğrenin MALDI-MS için ultra ince tabaka yöntemiyle protein numune hazırlama tekniklerini. Bu yöntem, kütle spektrometrisinde doğru kütle tayini için temiz plaka kullanımı ve HPLC kalite reaktiflerle hassas analiz sağlar.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Daha fazla video keşfet