Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Bu prosedürün genel amacı, mono zon ve poli ribozom fraksiyonlarını hücre lizatlarından ayırmak ve karşılaştırmaktır. Bu, önce ilgilenilen hücrelerin kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, hücre lizatını hazırlamaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, lizatı bir sükroz gradyanı ile santrifüjlemektir. Prosedürün son adımı, gradyanı parçalara ayırmak ve farklı ribozomal popülasyonları bir UV izi yoluyla görselleştirmektir. Sonuç olarak, poli ribozom profil analizi ile farklı deneysel koşullar altında translasyondaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben UMD ve J Robert Wood Johnson Tıp Fakültesi Moleküler Genetik, mikrobiyoloji ve immünoloji bölümünde Dr.Terry Goss Kinsey'in laboratuvarından Anthony Esposito. Ve ben Marcus Lewis. Ayrıca burada, R-W-J-M-S'deki McKinsey Laboratuvarı'ndan.

Bugün size poli ribozom analizi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, mutasyonlardan veya çevresel faktörlerden kaynaklanan değişiklikleri ve protein sentezini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Sakaroz.

Degradelerin sürekli hale gelmesi için degradeler kullanımdan bir gün önce hazırlanmalıdır. Aşağıdaki sükroz konsantrasyonlarının her birinden 48 mililitre yapmak için uygun hacimlerde% 7 ve% 47% 27% 37 ve% 47 yapmak için uygun hacimlerde sükroz stok çözeltilerini karıştırın, her bir sükroz çözeltisine bir milimolar nihai konsantrasyona kadar bir molar DTT ekleyin. Degradeleri dökmek için, 20 mililitrelik bir şırıngaya para film ile sabitleyerek ve mühürleyerek bir makarna pipeti takın.

Bir inç x 3,5 inç poli aamer ultra santrifüj tüpünün dibine yedi mililitre %7 sükroz ekleyin. Daha sonra, makarna pipetinin ucunu tüp pipetinin dibine yakın bir yere yavaşça yerleştirerek% 7'lik çözeltinin altına yedi mililitre% 17'lik sükroz çözeltisi ekleyin. Her katmanın dökülmesi en az 20 saniye sürmelidir.

Gradyan delindiğinde %27, %37 ve %47 sükroz çözeltilerinin her biri yedi mililitre ile tekrarlayın. Katmanlar arasında minimum karışımın meydana geldiğini gösteren net çizgiler gözlemlemelisiniz. Dört santigrat derecenin tüm gradyanlarını, numuneleri hasat etmek için kullanılacak rotorlar, şişeler ve tüplerle birlikte gece boyunca saklayın.

Maya hücrelerinden ekstraktlar hazırlamak için, yüz 25 mililitre maya kültürünü 0.8'e bir OD 600'e büyüterek başlayın. Kültüre mililitre başına 100 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar siklo heide ekleyin ve 15 dakika boyunca 30 santigrat derecede çalkalamaya devam edin. 15 dakika sonra, kültürü 250 mililitrelik bir santrifüj şişesine dökün ve buzla doldurun.

Bu noktadan itibaren her şeyi buz üzerinde tutun, dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 8.000 katı santrifüjleyin. Resus, peleti 10 mililitre buzda askıya alın, soğuk lizis, tampon ve 15 mililitre polipropilen tüplere aktarın. Dört santigrat derece Resus'un üç dakikası boyunca yerçekiminin 5, 900 katında santrifüjleyin.

Peleti 0,5 mililitre lizis tamponunda askıya alın. Süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne aktarın ve ardından 0,5 mililitre soğutulmuş fırınlanmış asitle yıkanmış cam boncuklar ekleyin. Hücreleri dört 32. aralık boyunca vorteksleyin ve her aralık arasında 30 saniye boyunca tüpü buz üzerinde çağırın.

Daha sonra 1.5 mililitrelik tüp santrifüjüne 5.000 kez 0.5 mililitre daha lizis tamponu ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekimi. Süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.

Son olarak, supinatı yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpe aktarın. Ekstrakt, lizatı sakaroz gradyanına aktarmak için eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Pipetin ucunu degradenin yüzeyine yakın tüpün duvarına yerleştirin ve lizatı degradenin üzerine nazikçe yerleştirin.

35 mililitrelik bir gradyan için, tipik olarak 500 mikrolitre lizat yüklenir. Forseps kullanarak, gradyanı sallanan bir kova rotorunun kovasına dikkatlice indirin. Gradyanları dört santigrat derecede dört saat boyunca yerçekiminin 100.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.

Dört saatlik dönüşün tamamlanmasından yaklaşık 30 dakika önce. İğneyi tüp deliciye takın ve kalemi çevrimiçi emici floresan monitörüne takın. Numuneleri analiz etmeden önce sabit bir taban çizgisine ulaşılmasını sağlamak için absorbans monitörünün gücünü açın.

PolyZone profilinin elektronik olarak alınması, bir DI 1 48 U veri toplama ünitesi takılarak gerçek zamanlı olarak kolayca elde edilebilir. Grafik kaydediciye, ters akış hızlı ayarını kullanarak şırınga pompasını 50 mililitre florin fıstığı ile doldurun. Hava kabarcığı olmadığından emin olun.

Şırıngadan gelen hortumu tüp deliciye bağlayın. Ve kısa bir süreliğine Flo inert akışını ileri yönde dakikada altı mililitre olarak açın. Hortumdaki hava kabarcıklarını temizlemek için, numune akışını toplamak için akış hücresinin ucundaki hortumun altına bir dizi tüp yerleştirin.

Sükroz gradyanını içeren santrifüj tüpünü tutmak için önceden şekillendirilmiş bir kuyuya sahip bir buz kovası hazırlayın. Dört saatlik santrifüjleme tamamlandığında, santrifüj tüplerini santrifüj rotorundan dikkatlice çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Gradyanları bozmamaya özen gösterin.

Hücre ekstraktlarını analiz etmek için, gradyan tüpünü tüp deliciye yerleştirin ve tüpün üst kısmını prize bağlayın ve sabitleyin. İğne tüpün altını delecek şekilde alt aşamayı santrifüj tüpüne kaldırın. Florin uyarısının akışını ileri yönde dakikada altı mililitre hızla başlatın.

Oluk tüpe akmaya başladığında, iğnenin hareketini çevrimiçi UV absorbans monitöründe izleyin. İğne hareket etmeye başladığında, grafik hareketini 60 hız ayarına getirin. Poli ribozom profilinin sonuna ulaşıldığında, santrifüj tüpüne giden Flo inert akışını kapatın ve absorbans floresan monitöründe grafik hareketini durdurun.

Akışı ters yönde hızlı bir şekilde başlatarak Flo inertini santrifüj tüpünden şırıngaya geri çekin ve tüpten şırıngaya sükroz çekmemeye dikkat edin. Santrifüj tüpünü tüp deliciden sökün, iğneyi indirin ve tüpü çıkarın. Siklo heide varlığında mayadan hazırlanan bir ribozom ekstraktının temsili bir izi burada gösterilmiştir.

Poliribozomlar ve A TS 60 s ve 40 s ribozomları içeren UV absorbans zirveleri belirtilmiştir. Bu işlemi yaparken size poli ribozom analizinin nasıl yapılacağını az önce gösterdik. Hızlı çalışmayı, numuneleri soğuk tutmayı ve RNA'ları serbest bırakmayı hatırlamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.