Name: Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, ökaryotik hücrelerden poliribozomları izole etmek için sakkaroz gradyan santrifüjasyonunu kullanarak translasyon regülasyonunu nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, protein sentezi dinamiklerini incelemek için altın standarttır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu yöntemin ilk olarak John Woolford kabul etmek istiyorum, TGK GM057483 ve AI076245 NIH tarafından desteklenen ve ÇHC GM77073 tarafından desteklenmektedir.

1. % 7-47 sakkaroz degradelerin hazırlanması <ol><li> Gradyanlar sürekli olmasına izin kullanmadan önce sakaroz gradyanlar bir gün hazırlayın. % 7 steril ve 4, 50mm NH 4 Cl içeren% 47 sakaroz çözümleri, 50mm Tris-asetat pH 7.0 ve 12mm MgCl 2 ve mağaza ° C 1 . </li><li> 6 gradyanlar aşağıdaki sakaroz konsantrasyonu her 48 ml için% 7 ve% 47 sukroz stok çözelti karışımı için. 1mm bir nihai konsantrasyonu her sakaroz çözeltisini DTT (1M stok) ekleyin. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Final Konsantrasyon </td><td> 7% sakaroz </td><td> 47% sakaroz </td></tr><tr><td> % 7 </td><td> 48 ml </td><td> 0 </td></tr><tr><td> % 17 </td><td> 36 ml </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> % 27 </td><td> 24 ml </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td> % 37 </td><td> 12 mL </td><td> 36 ml </td></tr><tr><td> % 47 </td><td> 0 </td><td> 48 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Gradyanlar dökmek için, 20 ml şırınga Parafilm ile güvence altına alınması ve sızdırmazlık Pasteur pipeti eklemek veya uzun bir iğne kullanınız. 1 x 3.5 "polyallomer ultrasantrifüjdeki tüp alt% 7 sakaroz 7 mL ekleyin. Sonraki 7 mL, 0.3 'ün, tüpün alt kısmına yakın Pasteur pipet yerleştirerek ve herhangi bir hızlı pipetleme altında% 17% 7 çözüm sakaroz çözeltisini eklemek 7 mL% 27,% 37 ve% 47 sukroz çözümleri ile ml / sn. tekrarlayın. karıştırma minimum 4 ° C gecede rotorlar, şişe ile birlikte. Mağaza gradyanlar meydana geldiğini belirterek, katmanları arasında net çizgiler dikkat etmelisiniz örnekleri hasat için kullanılacak tüpleri. </li></ol> 2. Maya özü hazırlanması <ol><li> 0.8-1.0 bir OD 600 125 ml maya kültürü büyütün. Nihai konsantrasyonu 100 mg / ml kültür Siklohekzimidsiz ekleyin ve 30 sallayarak ° C'de 15 dakika süreyle devam. </li><li> Bu arada, 80 mikrogram / ​​ml sikloheksimid, 200 mg / ml heparin,% 0.2 DEPC, ve 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1M NaCl, 30mm MgCl 2 içeren lizis tamponu hazırlamak. Bu noktadan itibaren buz her şeyi tutun. </li><li> 250 ml santrifüj şişeye kültür dökün ve buz ile doldurun. 5 dakika 4 ° C için 8.000 xg (SLA-1500 rotor 7250 rpm) Santrifüj Pelet buz lizis tamponu ve 15 ml polipropilen tüplere transfer 10 ml ile bir kez yıkayın. 3 dakika 4 ° C 5900 xg (SLA-600TC rotor ~ 6,000 rpm) Santrifüj 1.5mL tüp lizis tamponu, transfer 0,5 mL pelletini tekrar ve soğutulmuş, pişmiş asitle yıkanmış cam boncuklar 0.5 mL ekleyin. Vorteks, 30 sn arasında her aralık buz tüpü soğutma dört 30 sn aralıklarla hücreleri. Lizis tamponu başka bir 0.5 ml 1.5 ml tüp içine ekleyin. Santrifüj bir mikrosantrifüj maksimum hızı (bir Eppendorf 5417R mikrosantrifüj 14.000 rpm) 10 dk 4 ° C Supernatant yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. OD 260 / OD 280 oranı (bkz. aşağıda adım 3.1) belirlemek için ayrı bir tüp 10 ul çıkarın. -80 Mağaza özleri ° C </li></ol> 3. Memeli hücrelerinde alıntılar hazırlanması <ol><li> Yapışık hücreler için ~% 70 izdiham 100 mm tabak içinde büyür. 11 ml degrade başına bir 100 mm çanak (tipik verim ~ 20 OD 260 adet) ihtiyacınız olacak. Doğrusal degrade boyutları daha büyük veya daha küçük miktarda Ölçeği. Yapışmaz hücreleri için, 11 ml degrade başına yaklaşık 1 x 10 7 hücreleri ihtiyaç vardır. </li><li> Lizis için, önce 100 mcg / mL Siklohekzimidsiz ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Buz plakaları aktarın ve hücreleri buz PBS içinde iki kez yıkayın. Gelecekteki tüm adımları 0-4 ° C'de yapılan ZORUNLU </li><li> Aspirasyon PBS tüm izlerini silmek (plakalar buz açılı yatakta süzdürülür) ve 1 ml lizis tamponu, kazıma ve önceden soğutulmuş 1,5 mL tüp transfer ekleyin. Lizis tampon parçaları, hücre tipi ve büyüme koşulları için optimize edilmiş olması gerekir. Iyi bir başlangıç ​​tampon 20 mM Hepes KOH, pH 7.4, 15 mM MgCl 2, 200 mM KCl,% 1 Triton X-100 (v / v), 100 mg / ml sikloheksimid, 2 mM DTT, 1 mg / ml heparin. Temel değişkenler, magnezyum ve potasyum klorür gibi dahil edilmesi veya çıkarılması sitoskeletal veya membran bağlı polysomes artırmak için non-iyonik deterjan dışlanma konsantrasyonları. 27 gauge şırınga iğnesinin iki kez geçerek ya da B Tipi havaneli kullanarak Dounce homojenizasyon 5-10 darbeleri hücreleri Lyse. Şırınga veya Homojenizatör kullanmadan önce ön soğutulmuş olmalıdır. </li><li> 5 dakika buzdolabında mikrosantrifüj 14.000 xg'de dönerler. Sukroz gradient (memeli hücreleri için bu Triton X-100 ve heparin eksik lizis tamponu yapılır ama başka türlü, 1.2 ve 1.3 'de açıklandığı gibi) ya da daha sonra kullanılmak üzere sıvı azot flaş dondurma taze lizat aktarın. </li></ol> 4. Gradyanlar santrifüj <ol><li> Buz üzerinde polyribosome lizatları çözülme. Ayrılmış 10 mcL örnek 1 ml su ekleyerek ve bir spektrofotometre ile OD 260 / OD 280 oranı okuma lizat nükleik asit konsantrasyonu belirleyin. Açıklandığı gibi yetişen bir maya kültürü tipik verim 50 OD adettir. </li><li> Degrade yüzeyine yakın tüp duvar, hafifçe degrade üstüne lizat 25 OD 260 adet tabaka karşı yerleştirilen ucu ile bir pipet kullanarak. Için lizatı 35 mL degrade 500 ul genellikle yüklenir. Lizis tamponu tüm gradyanlar eşit hacimde yüklü sağlamak için kullanılabilir. Düşük miktarda malzeme daha iyi çözünürlük verir. Forseps kullanarak, sallanan bir kova rotor kova içine dikkatlice düşük gradyanlar. </li><li> Xg 100.000 (Surespin 630 rotor 23.000 rpm), 4 saat 4 gradyanlar Santrifüj ° C Bu protokol, küçük hacimli gradyanlar için adapte edilebilir. </li></ol> 5. Veri ve kesirler Toplanması <ol><li> Yaklaşık 30 dakika önce tamamlanması için 4 saat spin Model 184 tüp delici iğne takın. Online Isco Model kalem takın UA-5 Absorbans / Floresan Monitör. Absorbans Güç istikrarlı bir temel analiz örnekleri önce ulaşılması izin izlemek için. Polysome profil Elektronik satın alma grafik kaydedici DI-148U veri toplama ünitesi (DATAQ Araçlar) takarak kolayca elde edilebilir. Profiller daha sonra gerçek zamanlı olarak toplanan ve beraberindeki WinDaq yazılım kullanarak daha sonra ek açıklama için kaydedilmiş olabilir. </li><li> Fluorinert ters akış, hızlı ayarını kullanarak 50ml şırınga pompası doldurun. Hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Şırıngadan tüp delici hortumunu bağlayın ve kısaca, herhangi bir hava kabarcığı hortumu temizlemek için 3 ml / dk ileri yönde Fluorinert akışını açmak. </li><li> Örnek toplamak için akış hücresi sonunda hortumun altında kesirler toplama çalıştırırsanız, tüpler atık beher veya seri yerleştirin. </li><li> Sukroz gradient santrifüj rotor içeren polyallomer santrifüj tüplerine dikkatlice çıkarın ve buz üzerinde (rahatsız edici bir renk geçişlerini önlemek için boş bir tüp ile buz kuyu öncesi form) koyun. </li><li> Hücre özleri analiz etmek, tüp delici degrade tüpü yerleştirin. Tüpün üst prizine bağlayın ve güvenli. Iğne tüpün alt deler ve böylece alt aşamasında santrifüj tüpüne kaldırın. Sonra iğne santrifüj tüpüne dibinden dışarı fırlamıştı, 6mL/min ileri yönde Fluorinert akışı başlar. </li><li> Fluorinert tüp içine akan başladıktan sonra, online absorbans monitör iğne hareketini izlemek. İğnenin taşımak için 60 bir hız ayarı grafik hareketi açmak başlar. 40S ribozomal altbirim polyribosome kompleksleri boyunca devam algılama ve takip serbest malzeme ile başlayan monitör OD 254 kayıt edecektir. RNA veya protein analizi için kesirler toplama ise, tipik olarak 0.2 dakika kesirler (1 ml) alınır. RNA analizi için, kesirler ekstraksiyon tercih edilen yöntem bağlı olarak, doğrudan Trizol (Invitrogen), Fenol veya SDS / proteinaz K içeren tüp içine toplanan olmalıdır. </li><li> Polyribosome profil sonuna ulaşıldığında, Fluorinert, akış santrifüj tüpüne kapatın ve absorbans / floresan monitör grafik hareketi durdurmak. </li><li> Şırıngaya tüp sakaroz çekmek için emin olmak için hızlı bir oranında ters yönde akışını başında şırıngaya santrifüj tüpüne Fluorinert geri çekin. Santrifüj tüpüne sökün tüp delici iğne, alt ve tüp kaldırmak. </li><li> Her sukroz gradient için 5.8 üzerinden 5.5 adımları tekrarlayın. </li><li> Tüm sakaroz gradyanlar analiz edilmiştir, enjektörün içine geri hortum Fluorinert geri çekmek. Parçalama, üst kısmında bulunan atık hortum dahil olmak üzere her bir parçası (tüp delici ve akış hücresi) çıkarın ve su ile iyice durulayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1948/1948fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Siklohekzimidsiz varlığı maya suşu BY4741 (mat his3 Δ 1 leu2 Δ 0 met15 Δ Δ 0 0 ura3) hazırlanan ribozom özü Temsilcisi iz. Ribozomal özü 7% 47 sukroz gradient kullanan fraksiyone ve UV detektörü bağlı bir pompa şırınga aparatı kullanılarak analiz edildi. Polyribosomes ve 80S, 60S ve 40S ribozom içeren Peaks gösterilir.

<ol><li>Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+allowing+an+mRNA+secondary+structure+diminishes+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+iso-1-cytochrome+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
<li>Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stabilization+of+preinitiation+complexes+by+formaldehyde+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking.</a> Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).</li>
<li>Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+distribution+of+phospholipid+hydroperoxide+glutathione+peroxidase+mRNA%3A+evidence+for+a+block+in+elongation+at+the+UGA%2Fselenocysteine+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon.</a> Rna. 6, 1573-1584 (2000).</li>
<li>Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuan%2C+HJ+%22Analysis+of+mRNA+formation+and+function%22">Analysis of mRNA formation and function</a>. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).</li>
<li>Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenocysteine+codons+decrease+polysome+association+on+endogenous+selenoprotein+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs.</a> Genes Cells. 6, 121-129 (2001).</li>
<li>Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+upstream+open+reading+frame+regulates+translation+of+GADD34+during+cellular+stresses+that+induce+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).</li>
</ol>

Polyribosome profilden elde edilen bilgiler, hücre translasyonel durumu içine değerli bilgiler sağlayabilir. Buna ek olarak, ribozomal alt birimden kendilerini montaj durumu 2 tespit edilebilir. Örneğin halfmers veya 80S ve profil üzerinde sağa doğru hafif bir omuz daha büyük zirveleri varlığı bağlı 40S katılmadan 60S bekleyen subunit subunit gösterir. Sahne eklenen Siklohekzimidsiz veya diğer uzama inhibitörü yokluğunda deneme uzama 3 değiştirilmiş olup olmadığını gösterir kaçıp oranı, analiz sağlar. Kesirler kendilerini reaktiflerin kesirler, Kuzey ya da Batı blot ribozomal alt popülasyonlar belirli bir mRNA veya protein dernek sonraki belirlenmesi için zengin bir kaynak. Aktif ribozom ile ilişkili mRNA&#39;ların toplam havuzu ilişkili bir mikroarray 4 ya da derin bir sıralama analizi 5 üzerinden tespit edilebilir . Protein dernekleri de uygun reaktif 6 bağlayan bir haç ilave edilerek stabilize olabilir. Memeli hücrelerinde Polyribosome analizi de istikrarlı polysomes almak için gerekli koşulları belirleyen en belirgin zorluklar açısından farklı bir protokol olarak söz değer. Literatürde bildirilen tampon sistemler, 7-10 yaygın olarak değişken böylece lizis tamponu hücre türüne özgü optimizasyonu için bir gereklilik olabilir, ya da tampon sistemi ile çalışmak için istekli dikkat kadar önemli olmadığını eşit makul taze lizatları düşük sıcaklıklarda tutulur. Bildiğimiz kadarıyla memeli polysome oluşumunu etkileyen parametreler sistematik bir değerlendirme rapor edilmemiştir.

<table><tbody><tr><td>polyallomer ultrasentrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>326823</td><td>1 x 3.5 in. (25x89mm)</td></tr><tr><td>Fluorinert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7698</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td>Diğer suşlar da aynı derecede iyi çalışmaktadır</td></tr></tbody></table>

Ökaryotik polyribosome profil analizi

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein sentezi, birçok düzeyde düzenlenir karmaşık bir hücresel süreçtir. Örneğin, küresel çeviri, amino asit, açlık ya da büyüme faktörü çekilmesi gibi hücresel stresler çeşitli başlatma aşamasında veya uzama fazı inhibe olabilir. Alternatif olarak, bireysel mRNA&#39;ların çeviri mRNA lokalizasyonu veya cognate microRNA varlığı ile düzenlenir. Protein sentezi çalışmaları sık sık çeviri düzenleme ya da protein sentezi hatalarına mekanizmalarına ışık tutacak polyribosome analiz kullanmaktadır. Bu testte, mRNA / ribozom kompleksleri ökaryotik hücreler izole edilir. Bir sakaroz yoğunluk gradiyenti tek bir ribozom veya monosome bağlı mRNA&#39;ların polyribosomes olarak bilinen çok sayıda ribozom bağlı mRNA&#39;ların ayırır. Gradyanlar Fraksiyonu farklı ribozomal nüfus ve ilişkili mRNA&#39;ların veya protein ölçümü ve izolasyon sağlar. Tanımlanmış koşullar altında monosomes polyribosomes oranı farklılıklar çeviri başlangıcı ya da uzama / sonlandırma ya hatalarına göstergesi olabilir. Polyribosome kesirler mRNA&#39;ların Sınav bireysel mRNA&#39;ların kohort deneysel koşullar değişiklik tercüme olmadığını ortaya çıkarabilir. Buna ek olarak, ribozom montaj Eðim ayrılmış küçük ve büyük ribozomal altbirim doruklarına analizi ile izlenebilir. Bu video, maya hücreleri, sukroz gradient özü ayırma ve sonuçların yorumlanması ham ribozomal özler hazırlanması için bir yöntem mevcut. Bu prosedür, memeli hücreleri kolayca uyarlanabilir.

Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Protein sentezi, birçok düzeyde düzenlenen karmaşık bir hücresel süreçtir. Örneğin, küresel translasyon başlangıç aşamasında inhibe edilebilir...

Bu prosedürün genel amacı, hücre lizatlarından mono zon ve polizom fraksiyonlarını ayırmak ve karşılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili hücrelerin kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise hücre lizatının hazırlanmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, lizatı bir sükroz gradyanı aracılığıyla santrifüj etmektir. Prosedürün son adımı ise gradyanı fraksiyone etmek ve farklı ribozomal popülasyonları bir UV izi aracılığıyla görselleştirmektir. Nihayetinde, poliribozom profil analizi yoluyla farklı deneysel koşullar altında translasyondaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben UMD ve J Robert Wood Johnson Tıp Fakültesi'nin Moleküler Genetik, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji bölümünde Dr. Terry Goss Kinsey'nin laboratuvarından Anthony Esposito. Ben de Marcus Lewis, yine buradaki R-W-J-M-S'deki Kinsey Laboratuvarı'ndanım.Bugün size poliribozom analizi için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, mutasyonlar veya çevresel faktörlerden kaynaklanan protein sentezi değişikliklerini incelemek için kullanıyoruz. Haydi başlayalım. Sükroz.Gradyanların süreklilik kazanması için, kullanımdan bir gün önce hazırlanması gerekir. Aşağıdaki sakroz konsantrasyonlarının her birinden 48 mililitre hazırlamak için %7 ve %47'lik sakroz stok çözeltilerinin uygun hacimlerini karıştırın: %7, %17, %27, %37 ve %47. Her sakroz çözeltisine, nihai konsantrasyon bir milimolar olacak şekilde bir molar DTT ekleyin. Gradyanları dökmek için, para film ile sabitleyip sızdırmaz hale getirerek bir pasta pipeti 20 mililitrelik bir şırıngaya takın.Bir inç x 3,5 inç boyutundaki bir polimer ultra santrifüj tüpünün tabanına yedi mililitre %7 sükroz ekleyin. Ardından, pastör pipet ucunu tüpün tabanına yakın tutarak ve yavaşça pipetleme yaparak, %7'lik çözeltinin altına yedi mililitre %17 sükroz çözeltisi ekleyin. Her bir katmanın dökülmesi 20 saniyeden az sürmemelidir.Gradyan oluşturulduğunda, işlemini %27, %37 ve %47'lik sakroz çözeltilerinin her birinden yedi mililitre kullanarak tekrarlayın. Katmanlar arasında, minimum düzeyde karışımın gerçekleştiğini gösteren net çizgiler gözlemlemelisiniz. Tüm gradyanları, örnekleri toplamak için kullanılacak rotorlar, şişeler ve tüplerle birlikte dört derece Celsius'ta gece boyunca saklayın.Maya hücrelerinden ekstrakt hazırlamak için, öncelikle 25 mililitrelik maya kültürlerini 0,8 ile 1 arasında bir OD 600 değerine ulaşana kadar büyütün. Kültüre, nihai konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde sikloheksimid ekleyin ve 30 °C'de 15 dakika boyunca çalkalamaya devam edin. 15 dakika sonra, kültürü 250 mililitrelik bir santrifüj şişesine aktarın ve etrafını buzla doldurun.Bu noktadan itibaren her şeyi buz üzerinde tutun; 4 °C'de, 8.000 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Pellet'i 10 mL buz soğuk liziz tamponu içerisinde yeniden süspanse edin ve 15 mL'lik polipropilen tüplere aktarın. 4 °C'de, 5.900 ×g hızda üç dakika boyunca santrifüjleyin.Pelleti 0,5 milliliters lizis tamponunda süspanse edin. Süspansiyonu 1,5 milliliter mikro santrifüj tüpüne aktarın ve ardından 0,5 milliliters soğutulmuş, asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin. Hücreleri, her aralık arasında tüpü 30 saniye boyunca buz üzerinde tutarak, 32 saniyelik dört aralıkla vorteksleyin.Ardından, 1,5 ml'lik santrifüj tüpüne 0,5 ml daha lizis tamponu ekleyip 4 °C'de beş dakika boyunca 5.000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir 1,5 ml'lik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin.Son olarak, süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Ekstrakt, lizatı sakroz gradyanına aktarana kadar minus 80 degrees Celsius sıcaklıkta saklanabilir. Pipet ucunu tüpün duvarına, gradyanın yüzeyine yakın bir yere yerleştirin ve lizatı nazikçe gradyanın üzerine katmanlar halinde ekleyin.35 mililitrelik bir gradyan için tipik olarak 500 mikrolitre lizat yüklenir. Forseps kullanarak gradyanı bir salınımlı kova rotorunun kovasına dikkatlice yerleştirin. Gradyanları dört derece Celsius'ta dört saat boyunca 100,000 ×g hızında santrifüjleyin.Dört saatlik santrifüj işleminin tamamlanmasına yaklaşık 30 dakika kala, iğneyi tüp deliciye ve kalemi çevrimiçi absorbans floresan monitörüne takın. Numuneleri analiz etmeden önce stabil bir baz hattına ulaşılmasını sağlamak için absorbans monitörünün gücünü açın.PolyZone profilinin elektronik kazanımı, bir DI 1 48 U veri toplama ünitesi bağlanarak gerçek zamanlı olarak kolayca elde edilebilir. Grafik kaydediciye, şırınga pompasını ters akış hızlı ayarını kullanarak 50 mililitre florin nuts ile doldurun. Hava kabarcığı bulunmadığından emin olun.Şırıngadan gelen hortumu tüp deliciye bağlayın. Ardından, Flo inert akışını ileri yönde dakikada altı mililitre hızında kısa süreliğine başlatın. Hortumdaki hava kabarcıklarını temizlemek için, akış hücresinin sonundaki hortumun altına numune akışını toplamak amacıyla bir dizi tüp yerleştirin.Sükroz gradyanını içeren santrifüj tüpünü tutmak için önceden hazırlanmış bir yuvası olan bir buz kovası hazırlayın. Dört saatlik santrifüjleme işlemi tamamlandığında, santrifüj tüplerini santrifüj rotorundan dikkatlice çıkarın ve gradyanları bozmamaya özen göstererek buz üzerine yerleştirin.Hücre ekstraktlarını analiz etmek için, gradyan tüpünü tüp delicisine yerleştirin, tüpün üst kısmını çıkışa bağlayıp sabitleyin. İğnenin tüpün alt kısmını delmesi için alt platformu santrifüj tüpüne doğru yükseltin. Florin alert akışını ileri yönde, dakikada altı mililitre hızında başlatın.Flut tüpe akmaya başladığında, çevrimiçi UV absorbans monitöründeki iğnenin hareketini izleyin. İğne hareket etmeye başladığında, grafik hareketini 60 hız ayarına getirin. Poliribozom profilinin sonuna gelindiğinde, santrifüj tüpüne giden Flo inert akışını kapatın ve absorbans floresan monitöründeki grafik hareketini durdurun.Sükrozun tüpten şırıngaya çekilmediğinden emin olarak, akışı hızlı bir hızda ters yönde başlatıp Flo inerti santrifüj tüpünden şırıngaya geri çekin. Santrifüj tüpünü tüp delici düzenekten sökün, iğneyi indirin ve tüpü çıkarın. Burada, cyclo heximide varlığında mayadan hazırlanan bir ribozom ekstraktının temsili bir izi gösterilmektedir.Poliribozomlar ile 60 s ve 40 s ribozomlarını içeren UV absorbsiyon pikleri belirtilmiştir. Bu prosedürü gerçekleştirirken poliribozom analizinin nasıl yapılacağını size göstermiş olduk. Bu işlemi yaparken hızlı çalışmaya, örnekleri soğuk tutmaya ve RNA'ları kontaminasyondan uzak tutmaya özen göstermek önemlidir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

Ribozomların çevrilmesi, kodon başına üç nükleotidin peptitlere şifresini çözer. Ribozom profillemesi ile yakalanan mRNA boyunca hareketleri, karakteristik üçlü periyodiklik sergileyen ayak izlerini üretir. Bu protokol, tüm transkriptom düzeyinde aktif olarak çevrilmiş açık okuma çerçevelerini tanımlamak için ribozom profil oluşturma verilerinden bu belirgin özelliği deşifre etmek için RiboCode'un nasıl kullanılacağını açıklar.

De novo Aktif Olarak Çevrilmiş Açık Okuma Çerçevelerinin Ribozom Profil Oluşturma Verileri ile Tanımlanması

Öğrenin, ökaryotik hücrelerden poliribozomları izole etmek için sakkaroz gradyan santrifüjasyonunu kullanarak translasyon regülasyonunu nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, protein sentezi dinamiklerini incelemek için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Daha fazla video keşfet