Name: Yumuşak Kas-iskelet Dokular Kök Hücre Yalıtımlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Öğrenin, iskelet kası gibi yumuşak doku biyopsilerinden enzimatik sindirim ve tekrarlı ön plakalama ile yetişkin kök hücre izolasyonu. Bu yöntem rejeneratif tıp araştırmaları için güvenilir hücre kaynağı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, güncel film ve slayt düzenleme hakkında yardım için Sayın Kyle Holden ve Sayın Jonathan Lucas için hücre izolasyonu, teknik yardım, Bayan Haiying Pan ve Bay Ian Bellayr büyük takdir. Dr: Geçtiğimiz yıllarda modifiye preplate tekniklerinin geliştirilmesi ile ilgili olan kişilerin aşağıdaki listeye çok teşekkürler. Burhan Gharaibeh, Baohong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita Ron Jankowski, Makato Ikezawa. James H. Cummins, Ryan Pruchnic, Joseph Feduska, Rebecca C. Schugar, Haiying Pan ve Jessica Tebbets teknik yardım için teşekkür ediyoruz. Yazar ayrıca Müsküler Distrofi Derneği (MDA), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Savunma Bakanlığı (DOD), UPMC, Pittsburgh Çocuk Hastanesi, Anabilim Dalı Bu çalışma için mali destek kabul etmek gibi. Ortopedi ve Travmatoloji ve Pittsburgh Üniversitesi.

Genel olarak, komple değiştirilmiş preplate prosedürü hazırlık 1-2 gün, 1 hafta teknik yordamı gerçekleştirmeden, 2-3 gün hücre immünsitokimya kimlik, kök hücre nüfus büyümesi ek bir 2-3 hafta gerektirir. Kök hücre kültürü için gerekli ekipman, bir tezgah üstü santrifüj, CO2 inkübatör, Laminer akış doku kültürü kaputu ve floresans ve bir dijital kamera ile donatılmış bir inverted mikroskop içeren diğer hücre kültür sistemleri bu benzer . Izole edilen kök hücreler de klonlanmış olabilir ve mevcut ya da gelecekteki çalışmaları için 1,2 sıvı nitrojen içinde uzun vadeli saklanabilir. Bu prosedür için kullanılan tüm reaktifler ve malzemelerin steril olması ve aseptik olarak ele gerekir. Adım 1: Hazırlık <ol><li> Kollajen kat doku kültürü yemekleri ve balonları: buzağı deri (1 litre suda 0.1 g; Sigma-Aldrich) türetilen Tip I kollajen. Kat için plasticware içerir: T-25 şişeler 1,2 önce açıklandığı gibi, 6 veya 12 sıra tabak, yemekler (60 ve 100 mm, BD Falcon). Yavaşça kollajen bile kaplama sağlamak için 4 saat boyunca plasticware, her yarım saatte bir sallamak. Kollajen çözüm daha sonra kaldırılır. Ve kaplı plasticware sonra kısırlık sağlamak için, UV ışık ve kaput, hem doku kültürü kaputu kurumaya izin verilir, ve son olarak Tekrar kapatılan veya daha sonra kullanmak için kapalı. </li><li> Hücre kültür ortamı hazırlayın, 50ml Isı İnaktif Fetal Bovine Serum (FBS, Invitrogen), 50ml At Serum (HS, Invitrogen) ve 5 ml Civciv Embriyo Extract (CEE; Doğru Chemical Co 400ml DMEM (Invitrogen DMEM, yüksek glukoz): ) bir tek 0.22 mikron 500 ml steril filtre sistemi (Corning) kullanarak filtreli elektrik süpürgesi olacak. Steril penisilin / streptomisin çözüm (Invitrogen) sonunda 100 Birimler / mL eklenecektir. Hazırlanan çözümler en az bir ay süreyle 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Bu çözüm, balon hücreleri ayırmak için kullanılan bölme kültürleri veya transplantasyon için hücrelerin hazırlanması. </li><li> Hücre izolasyon çözümleri kadar Isınma: Aşağıdaki reaktifler 37 kadar ısınmış olması için ° C hücre izolasyonu için kullanılması önce: Hank Tamponlu Tuz Çözüm (HBSS, Invitrogen); 0.2% (ağırlık / hacim) kollajenaz-tip XI (Sigma Dispase 2.4 units/1mL (Invitrogen);% 0.5 &#39;lik (ağırlık / hacim) tripsin (Invitrogen) başına 3.200 ml HBSS kollajen sindirim birimlerinin ortalama-Aldrich). </li><li> Cerrahi teçhizat hazırlık sterilize:: Cerrahi işlem de dahil olmak üzere steril cerrahi aletler gerektiren farklı büyüklükteki forseps, mikro-makas, iris makası ve / veya bisturi ağızları. Ayrıca, 15 ve 50 ml polipropilen santrifüj tüpleri (BD Falcon); Hücre süzgeç (gözenek büyüklüğü 70 m) (BD Falcon), 18 - 23 - ve 27-gauge iğne (BD PrecisionGlide), 10 - veya 20 ml steril şırıngalar (BD). </li></ol> Adım 2: Doku biyopsi, izolasyon ve mekanik disosiasyon 1-4 Doku biyopsileri steril bir kültür kaputun altında yapılır ve taze hasat tendon ve iskelet kasları, wild-tip farelerden hindlimb (Kadın C57BL/6J, 4-5 yaş hafta ya da daha genç, Jackson tibia veya soleus kas elde edilen Laboratuvar). Biyopsi örnekleri görünür bir bağ dokusu, kan damarları ve yağ dokusu daha sonra kaldırılır. Tendon ve kas dokuları, deri ve kemik kalıntıları kaldırmak için bir cerrahi diseksiyon mikroskobu altında dikkatle tespit ve bir tabak içinde bulunduğu soğuk (4 ° C) HBSS (% 5 FBS ile takviye). Izole dokularda sonra soğuk HBSS içeren kollajen kaplı yemekleri ayrı ayrı yerleştirilir ve kaba bir bulamaç haline mikro-makas ve / veya bisturi ağızları kullanarak (&lt;1x1 mm 3) kıyılmış olacak . Adım 3: Enzimatik sindirim dokuların: Kıyılmış doku adımları 2,4,5 bir dizi enzimatik ayrışmış <ol><li> Ayrı 15 ml tüpler ve 4 ~ 3500 rpm&#39;de santrifüj ° C 5 dakika içine kıyılmış doku çamurlar aktarın. </li><li> Süpernatantı HBSS ile yıkayın ve tekrar santrifüj tekrarlayın. </li><li> Süpernatantı prewarmed% 0.2 kollajenaz tip XI (Sigma) 10 ml ekleyerek bu çamurlar sindiremez. 60 dakika için 37 ° ° C&#39;de sürekli tüpler hafifçe sallanan. Alternatif olarak, her 10 dakikada bir, el sallayın. </li><li> Santrifüj ve 10 ml dispase (2.4 Birimler / mL Gibco) çözümü bu çamurlar tekrar süspansiyon. Elleriyle sallayarak veya her 10 dakikada bir hafifçe sallanan 37 ° C&#39;de 45 dakika inkübe edin. </li><li> 10 ml% 0.2 tripsin HBSS çözüm bu çamurlar Santrifüj ve yeniden askıya. Kuluçka tek hücreleri, mikroskop altında süspansiyon gözlemleyerek yapılabilir dokulardan yayımlanan hangi ölçüde değişecektir. Tüpleri ile tersine ° C 37 30 dakika aşmak için tavsiye veya her 10 dakikada bir nazikçe sallanan değildir. </li><li> Sonuçlanan hücre Santrifüjs ve yeniden askıya hücre pelletini Silahların Yayılmasını Önleme Orta (PM) 10 ml. </li><li> Iğne bir dizi özü geçerek hücre süspansiyonu ayrıştırmaları. Hücreler daha sonra bir 18G ile 23G 2 kez geçti ve nihayet bir 27G iğne. </li><li> 70 mikron hücre süzgeç vasıtasıyla hücre özü iletin. </li></ol> Adım 4: hücre adezyon oranı 1-3 dayalı farklı hücre popülasyonlarının izole Preplating <ol><li> Santrifüj ve hücre pelletleri tekrar süspansiyon Silahların Yayılmasının Önlenmesi Orta. </li><li> Plate hücre kollajen kaplı bir T-25 balonuna (veya 60 mm yemek) üzerine karışımları ve PP1 olarak işaretlemek. Hücre süspansiyonu, mikroskop altında çok sayıda kırılma çekirdek ve diğer enkaz sahip olarak dikkat edilmelidir. </li><li> 37 inkübe ° C, 2 saat boyunca nemlendirilmiş bir,% 5 CO 2 inkübatör . </li><li> T-25 balonuna (veya 60 mm çanak) ve mark PP2 olarak yeni bir kollajen kaplı nonadherent hücreleri aktarın. PP1 etiketli plakasına PM 5 ml ekleyin. Balona ekleyebilirsiniz erken yapışan hücreler çoğunlukla miyofibroblastlar 3. </li><li> (Ya da çanak) T-25 balon yeni bir kollajen kaplı nonadherent hücreleri transferi ve PP3 olarak işaretlemek, başka bir 24 saat süreyle inkübatör şişeler dönün. Silahların Yayılmasının Önlenmesi Orta PP2 etiketli plakasına 5 ml ekleyin. Bu balona eklemek Bu kalarak hücreleri çoğunlukla fibroblastlar 2,3. </li><li> Inkübatör şişeler dönün ve 24 saat içinde nüfus PP6 oluşturuluncaya kadar işlemi tekrarlayın. Her grup askıya hücreleri korumak ve çoğalmaya başlar ve ters bir mikroskop kullanılarak düzenli olarak incelemeye olanak sağlar. Kas uydu hücreleri genellikle PP5 2 çoğunlukla görülürken PP3-PP4 çoğunlukla matür. </li><li> Yavaş yavaş kalarak hücrelerinin çoğu genellikle PP6 takın. Bu aşamada hücreler küçük, yuvarlak, ışık kırılma görünür ve sayısı çok azdır ve bir kök hücre nüfus 1,2 olarak kabul edilir. </li></ol> Adım 5: Tanımlama ve izole edilen kök hücrelerin genişlemesi <ol><li> Izole PP6 hücreleri sayıca çok azdır ve günlük değiştirildi FBS zengin Silahların Yayılmasını Önleme Orta (% 20 DMEM içinde FBS) muhafaza edilmesi gerekir. Hücrelerin çoğu, kültür, aşağıdaki 1-2 hafta boyunca PP6 kültür kalıp mevcut, ama büyük, sağlıklı PP6 nüfus genellikle genişleme ek bir 1-2 hafta sonra oluşturulur. Farelerden elde edilen izole edilen kök hücreler, son derece 1 (SCA1) kök hücre antijen, CD34, fetal karaciğer kinaz 1 (Flk1) ve immünositokimyasal boyama aracılığı ile görsel olarak diğer kök belirteçlerinin 1,2,6,7 ifade eder. Bu kök hücrelerin, aynı zamanda birden fazla farklılaşma kapasiteleri 3,6,8 sergilemek . </li><li> Izole hücreler korunur ve farklılaşma 1,2 önlemek için (iyi ya da &lt;% 20-30 izdiham şişesi veya çanak 12 50-100 hücreleri iyi tabaklar /) düşük bir kültür hücre yoğunluğu genişletilmiş. Çok az sayıda hücre genişleme sırasında klonlar formu ve bu klonlanmış kök hücrelerinin başka herhangi bir yeterlilik çalışmaları için uzun süre proliferasyonu (LTP) yaptırmalıdırlar. Klonlanmış kök hücreler de% 10 DMSO ile PM orta örneğin genel hücre depolama prosedürleri kullanarak sıvı azot deposu olabilir. Kök hücreler, herhangi bir diğer geri çalışmalar için düşük geçiş stoklarının bir dizi olun. </li></ol>

<ol><li>Gharaibeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu-Petersen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+population+of+muscle+stem+cells+in+mice%3A+potential+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.</a> J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).</li>
<li>Li, Y. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+muscle-derived+cells+into+myofibroblasts+in+injured+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle.</a> Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).</li>
<li>Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &amp, Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+donor+muscle+precursor+cells+into+an+area+of+muscle+regeneration+in+the+host+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse.</a> J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).</li>
<li>Lu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+progenitor+populations+from+Pax7-deficient+skeletal+muscle+based+on+adhesion+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics.</a> Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+muscle-derived+cells+capable+of+enhancing+muscle+regeneration+and+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing.</a> J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptors+in+the+maturation-dependent+adenoviral+transduction+of+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers.</a> Gene Ther. 8, 627-637 (2001).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells+differentiate+into+haematopoietic+lineages+but+retain+myogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential.</a> Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).</li>
<li>Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+based+on+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine based on muscle stem cells.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).</li>
<li>Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+for+the+musculoskeletal+system+based+on+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells.</a> J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).</li>
</ol>

Bu, bazı yetişkin dokularda çok kök hücreler içerdiğini kabul edilmiştir. Çalışmanın son birkaç yıl içinde, kök hücre, iskelet kas ve tendon gibi yumuşak kas-iskelet dokuları, tespit edilmiştir. Tendon ve iskelet kası yetişkin kök hücreleri izole etmek için başarılı bir laboratuvarda kullanılan olmuştur değiştirilmiş preplate tekniği olarak bilinen bu akım protokol detaylarının bir prosedür. Hücreleri yukarıda açıklanan değiştirilmiş preplate tekniği kullanarak çeşitli popülasyonları kollajen kaplı şişeler (Şekil 1) yap...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11995-073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile inaktive edilmiş at serumu</td><td>Invitrogen</td><td>#26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Civciv embriyo ekstresi</td><td>Accurate Chemical</td><td>#CE650T-10</td><td></td></tr><tr><td>100U ml penisilin/streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Invitrogen</td><td>#14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Tamponlu Tuz Çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>#24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip XI %0.2(ağırlık/hacim)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C7657</td><td></td></tr><tr><td>Dispase 2.4U ml</td><td>Invitrogen</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA %0.5(ağırlık/hacim) (10x; 5g litre tripsin (1:250)</td><td>Invitrogen</td><td>#15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Flask kaplama için kollajen: Buzağı derisinden türetilmiş Tip I kollajen 0.1 g litre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C-9791</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>#D-2650</td><td></td></tr></tbody></table>

yumuşak kas-iskelet dokular kök hücre yalıtımlı

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Yetişkin kök hücreleri uzun rejeneratif tıp uygulama ile ilgili olarak ele alınmıştır. Yetişkin kök hücreleri, çok soyundan hücre farklılaşması ve kendi kendini yenileme yeteneği geçmesi etkileyici yetenekleri nedeniyle yaralı ve hastalıklı dokuların tedavisi için büyük bir heyecan yarattı. En önemlisi, bu niteliklere otolog hücre nakli tedavileri kullanmak için onları avantajlı hale getirmiştir. Geçerli protokol, kas-iskelet sistemi, örneğin, tendon ve kas, yumuşak doku 1 değiştirilmiş preplate tekniğini okuyucularına tanıtacak<sup&gt; St</sup&gt; Orta kollajen kaplı şişelerde yerleştirilen enzimatik olarak ayrışmış ve sonra. Orta ve kalan yüzen hücreler oluşur süpernatant, seri, yeni şişeler için günlük transfer edilir. Kök hücreler (seri transferleri veya preplates) genellikle 5-7 gün sürer şişeler uymak için en yavaş. Bu tekniği kullanarak, yetişkin kök hücreler bu dokuların mevcut oldukça non-invaziv prosedürler yoluyla kolayca hasat edilebilir.

Balona hücre bağlılık hızına göre kas-iskelet yumuşak dokulardan Yalıtımlı yetişkin kök hücreleri.

Yumuşak Kas-iskelet Dokular Kök Hücre Yalıtımlı

Yetişkin kök hücreler, rejeneratif tıptaki uygulamaları açısından uzun süredir tartışılmaktadır. Yetişkin kök hücreler, büyük ölçüde ... üretmiştir.

Bu prosedürün genel amacı, iskelet kası gibi kas-iskelet yumuşak dokulardan yetişkin kök hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle yumuşak dokudan biyopsi alınması, dokunun temizlenmesi ve ince parçalara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise dokunun enzimatik olarak sindirilmesidir.Prosedürün üçüncü adımı, tekrarlanan ön ekim aşamalarıyla kök hücrelerin izole edilmesidir. Prosedürün son adımı ise izole edilen kök hücrelerin tanımlanmasıdır. Nihayetinde, immünofloresan, mikroskopi ve/veya akış sitometrisi kullanılarak hücrelerin morfolojik ve hücresel davranışlarını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Ortopedik Cerrahi Bölümü Moleküler Patoloji Laboratuvarı'ndan y Lee. Bugün size iskelet kası gibi kas-iskelet sistemi yumuşak dokularından yetişkin kök hücrenin nasıl izole edileceğini göstereceğim. Merhaba, ben Dr. Johnny Ward.Pittsburgh Üniversitesi Tıp Fakültesi Ortopedik Cerrahi Bölümü'nde profesörüm. Dr. Young Lee ile yakın bir şekilde çalışarak iskelet kası ve standart gibi farklı dokulardan kök hücreleri izole etme prosedürleri üzerine çalışıyorum. Laboratuvarımızda, temel olarak translasyonel tıp uygulamalarına yönelik araştırma çalışmaları için kök hücre izole etmek amacıyla bu prosedürleri kullanıyoruz.Çalışmaya başlayalım. Kök hücrelerin izole edilebileceği dokular arasında, yabani tip farelerin arka ekstremite tibia veya soleus kaslarından alınan tendonlar ve iskelet kasları yer alabilir. Deri ve kemik kalıntılarını temizledikten sonra, dokuları %5 FBS ile desteklenmiş soğuk HBSS içeren bir kaba yerleştirin.Ardından, dokuları soğuk HBSS içeren kolajen kaplı kaplara ayrı ayrı yerleştirin. Dokuların ayrıştırılması ve sindirilmesine yönelik temel prosedürleri göstermek için iskelet kası dokuları kullanacağız. İskelet dokularını, dokuların enzimatik sindirimi için kaba bir bulamaç haline getirmek amacıyla mikro makas ve/veya bistüri uçları kullanarak inceyin.MIT doku bulamaclarını ayrı 15 mililitrelik tüplere aktararak başlayın ve dört santigrat derecede, yaklaşık 3.500 RPM hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. SANE yıkama solüsyonunu HBSS ile yeniden süspanse ederek uzaklaştırın ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, 10 mililitre önceden ısıtılmış %0,2 kolajenaz ekleyerek bulamacı sindirin.Tip 11'i 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin ve inkübasyon süresince tüpleri her 10 dakikada bir elle çalkalayın. 60 dakikalık inkübasyon tamamlandığında santrifüjleyin ve ardından süspansiyonları 10 ml DYS boşluk çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin ve her 10 dakikada bir elle çalkalayın; 45 dakikalık inkübasyondan sonra santrifüjleyin ve süspansiyonları 10 ml %0,2 tripsin içeren HBSS çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.Genellikle tüpleri her 10 dakikada bir tersyüz ederek 37 °C'de 15 ila 20 dakika inkübe ederiz; ardından inkübasyon tamamlanmış olur. Burada gösterildiği gibi dokulardan yeterli miktarda tekil hücre salındığında, elde edilen hücreleri santrifüjleyin ve hücre peletini beş mL proliferasyon ortamı (PM) içinde yeniden süspanse edin. Ekstrakatı önce iki kez 18 gauge iğneden, ardından bir kez 23 gauge iğneden ve son olarak bir kez 27 gauge iğneden geçirerek hücre süspansiyonunu disosiye edin.Son olarak, prepl tekniğine başlamak için hücre ekstraktını 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Yeni hazırlanan hücre ekstraktını santrifüjleyin ve peletleri proliferasyon ortamında yeniden süspande edin. Hücre karışımının beş mililitresini kolajen kaplı bir T 25 flaskına aktarın ve PP1 olarak işaretleyin; ardından hücreleri nemlendirilmiş %5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.İki saat sonra, yapışmayan hücreleri kolajen kaplı yeni bir T 25 flaskına aktarın ve PP iki olarak işaretleyin. PP bir olarak etiketlenen önceki T 25 flaskına beş mililitre PM ekleyin.Her iki balonu da 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. 24 saat sonra, PP iki'deki yapışmayan hücreleri yeni bir kolajen ENC kaplı T 25 balonuna aktarın ve bunu PP üç olarak işaretleyin. PP iki olarak etiketlenen balona beş mililitre proliferasyon ortamı ekleyin.Flaskları inkübatöre geri yerleştirin. Popülasyon PP altısına kadar prosedürü her 24 saatte bir tekrarlayın. Kök hücre popülasyonu oluşturulmuş olur.İzole edilen PP altı hücrelerinin sayısı oldukça azdır ve FBS açısından zengin bir proliferasyon ortamında tutulmaları gerekir. Bu ortam günlük olarak değiştirilmiştir. Bununla birlikte, PP altı kültüründeki hücrelerin çoğu, takip eden bir ila iki haftalık kültürleme süreci boyunca ölecektir.Genişletmenin ardından genellikle bir ila iki hafta sonra büyük ve sağlıklı bir PP six popülasyonu oluşturulur. Süspansiyon halindeki diğer tüm hücre gruplarını da muhafaza ederek proliferasyonlarına izin verin ve bunları ters mikroskop kullanarak düzenli olarak inceleyin. PP one ve PP two flasklarına tutunan erken yapışkan hücreler çoğunlukla fibrotik hücrelerdir.Hücreler, 48 ila 96 saat arasındaki daha uzun bir süre sonunda kolajen kaplı flasklara tutunurlar. PP üç ve PP dört çoğunlukla miyoblastlardır. Kas uydu hücreleri genellikle çoğunlukla PP beşte görülürken, daha sonraki prepl hücreleri (96 saat veya sonrası, PP altı) yetişkin kök hücreler olarak kabul edilir ve küçük, yuvarlak ve şeffaf görünürler.İzolasyonun başlangıcında, kök hücre antijeni bir ve CDC 34 gibi kök hücre belirteçlerinin ekspresyonları için immünohistokimya ile daha ayrıntılı şekilde karakterize edilebilirler. Fare sekumundan kök hücrelerin nasıl izole edileceğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, tüm işlemler boyunca steriliteyi korumayı hatırlamak önemlidir.Kök hücre izole edildikten sonra, hücrelerin kök hücre özelliklerini korumak için bu hücreleri düşük yoğunlukta kültürlediğinizden emin olun. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, çalışmalarınızda başarılar dilerim ve bunu deneylerinizde kullanmayı denemenizde size bol şans dilerim.Teşekkürler.

isolating-stem-cells-from-soft-musculoskeletal-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video yolk kesesi ve aort-gonad mesonephros bölge embriyolardan mikro incelemek ve hematopoietik kök hücreler sıralamak için flow sitometri kullanmak nasıl gösterir.

Murin Yolk Sac ve AGM Erken Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Rejeneratif uygulamalar için idealdir insan iskelet kası liman birkaç çok-soy öncü nüfus içindeki kan damarları. Intima gelen Miyojenik endotel hücreleri, medya perisitler ve adventisyanın gelen adventisyal hücreler: Bu izolasyon yöntemi, kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla üç multipotent öncü hücre popülasyonlarının eşzamanlı arınma sağlar.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar.  Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir.  Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP'lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.

FACS-İzolasyon ve Fibro-Adipojenik Progenitörlerin ve Kas Kök Hücrelerinin Bozulmamış ve Yaralı Fare İskelet Kasından Kültürü

Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi

Bu protokol, kas kök hücrelerinin ve fibro-adipojenik progenitörlerin farelerde bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar. Protokol, tek kas diseksiyonu, floresan aktive hücre sıralama ile kök hücre izolasyonu, immünofloresan boyama ile saflık değerlendirmesi ve 5-etinil-2'-deoksiüridin dahil etme testi ile S-faz girişinin kantitatif ölçümünü içerir.

Sessiz Kök Hücre Popülasyonlarının Bireysel İskelet Kaslarından İzolasyonu

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin, iskelet kası gibi yumuşak doku biyopsilerinden enzimatik sindirim ve tekrarlı ön plakalama ile yetişkin kök hücre izolasyonu. Bu yöntem rejeneratif tıp araştırmaları için güvenilir hücre kaynağı sağlar.

Yumuşak Kas-iskelet Dokular Kök Hücre Yalıtımlı

Daha fazla video keşfet