Yumuşak Kas-iskelet Dokular Kök Hücre Yalıtımlı

Bu prosedürün genel amacı, iskelet kası gibi kas-iskelet yumuşak dokulardan yetişkin kök hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle yumuşak dokudan biyopsi alınması, dokunun temizlenmesi ve ince parçalara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise dokunun enzimatik olarak sindirilmesidir.

Prosedürün üçüncü adımı, tekrarlanan ön ekim aşamalarıyla kök hücrelerin izole edilmesidir. Prosedürün son adımı ise izole edilen kök hücrelerin tanımlanmasıdır. Nihayetinde, immünofloresan, mikroskopi ve/veya akış sitometrisi kullanılarak hücrelerin morfolojik ve hücresel davranışlarını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Ortopedik Cerrahi Bölümü Moleküler Patoloji Laboratuvarı'ndan y Lee. Bugün size iskelet kası gibi kas-iskelet sistemi yumuşak dokularından yetişkin kök hücrenin nasıl izole edileceğini göstereceğim. Merhaba, ben Dr. Johnny Ward.

Pittsburgh Üniversitesi Tıp Fakültesi Ortopedik Cerrahi Bölümü'nde profesörüm. Dr. Young Lee ile yakın bir şekilde çalışarak iskelet kası ve standart gibi farklı dokulardan kök hücreleri izole etme prosedürleri üzerine çalışıyorum. Laboratuvarımızda, temel olarak translasyonel tıp uygulamalarına yönelik araştırma çalışmaları için kök hücre izole etmek amacıyla bu prosedürleri kullanıyoruz.

Çalışmaya başlayalım. Kök hücrelerin izole edilebileceği dokular arasında, yabani tip farelerin arka ekstremite tibia veya soleus kaslarından alınan tendonlar ve iskelet kasları yer alabilir. Deri ve kemik kalıntılarını temizledikten sonra, dokuları %5 FBS ile desteklenmiş soğuk HBSS içeren bir kaba yerleştirin.

Ardından, dokuları soğuk HBSS içeren kolajen kaplı kaplara ayrı ayrı yerleştirin. Dokuların ayrıştırılması ve sindirilmesine yönelik temel prosedürleri göstermek için iskelet kası dokuları kullanacağız. İskelet dokularını, dokuların enzimatik sindirimi için kaba bir bulamaç haline getirmek amacıyla mikro makas ve/veya bistüri uçları kullanarak inceyin.

MIT doku bulamaclarını ayrı 15 mililitrelik tüplere aktararak başlayın ve dört santigrat derecede, yaklaşık 3.500 RPM hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. SANE yıkama solüsyonunu HBSS ile yeniden süspanse ederek uzaklaştırın ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, 10 mililitre önceden ısıtılmış %0,2 kolajenaz ekleyerek bulamacı sindirin.

Tip 11'i 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin ve inkübasyon süresince tüpleri her 10 dakikada bir elle çalkalayın. 60 dakikalık inkübasyon tamamlandığında santrifüjleyin ve ardından süspansiyonları 10 ml DYS boşluk çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin ve her 10 dakikada bir elle çalkalayın; 45 dakikalık inkübasyondan sonra santrifüjleyin ve süspansiyonları 10 ml %0,2 tripsin içeren HBSS çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

Genellikle tüpleri her 10 dakikada bir tersyüz ederek 37 °C'de 15 ila 20 dakika inkübe ederiz; ardından inkübasyon tamamlanmış olur. Burada gösterildiği gibi dokulardan yeterli miktarda tekil hücre salındığında, elde edilen hücreleri santrifüjleyin ve hücre peletini beş mL proliferasyon ortamı (PM) içinde yeniden süspanse edin. Ekstrakatı önce iki kez 18 gauge iğneden, ardından bir kez 23 gauge iğneden ve son olarak bir kez 27 gauge iğneden geçirerek hücre süspansiyonunu disosiye edin.

Son olarak, prepl tekniğine başlamak için hücre ekstraktını 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Yeni hazırlanan hücre ekstraktını santrifüjleyin ve peletleri proliferasyon ortamında yeniden süspande edin. Hücre karışımının beş mililitresini kolajen kaplı bir T 25 flaskına aktarın ve PP1 olarak işaretleyin; ardından hücreleri nemlendirilmiş %5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

İki saat sonra, yapışmayan hücreleri kolajen kaplı yeni bir T 25 flaskına aktarın ve PP iki olarak işaretleyin. PP bir olarak etiketlenen önceki T 25 flaskına beş mililitre PM ekleyin.

Her iki balonu da 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. 24 saat sonra, PP iki'deki yapışmayan hücreleri yeni bir kolajen ENC kaplı T 25 balonuna aktarın ve bunu PP üç olarak işaretleyin. PP iki olarak etiketlenen balona beş mililitre proliferasyon ortamı ekleyin.

Flaskları inkübatöre geri yerleştirin. Popülasyon PP altısına kadar prosedürü her 24 saatte bir tekrarlayın. Kök hücre popülasyonu oluşturulmuş olur.

İzole edilen PP altı hücrelerinin sayısı oldukça azdır ve FBS açısından zengin bir proliferasyon ortamında tutulmaları gerekir. Bu ortam günlük olarak değiştirilmiştir. Bununla birlikte, PP altı kültüründeki hücrelerin çoğu, takip eden bir ila iki haftalık kültürleme süreci boyunca ölecektir.

Genişletmenin ardından genellikle bir ila iki hafta sonra büyük ve sağlıklı bir PP six popülasyonu oluşturulur. Süspansiyon halindeki diğer tüm hücre gruplarını da muhafaza ederek proliferasyonlarına izin verin ve bunları ters mikroskop kullanarak düzenli olarak inceleyin. PP one ve PP two flasklarına tutunan erken yapışkan hücreler çoğunlukla fibrotik hücrelerdir.

Hücreler, 48 ila 96 saat arasındaki daha uzun bir süre sonunda kolajen kaplı flasklara tutunurlar. PP üç ve PP dört çoğunlukla miyoblastlardır. Kas uydu hücreleri genellikle çoğunlukla PP beşte görülürken, daha sonraki prepl hücreleri (96 saat veya sonrası, PP altı) yetişkin kök hücreler olarak kabul edilir ve küçük, yuvarlak ve şeffaf görünürler.

İzolasyonun başlangıcında, kök hücre antijeni bir ve CDC 34 gibi kök hücre belirteçlerinin ekspresyonları için immünohistokimya ile daha ayrıntılı şekilde karakterize edilebilirler. Fare sekumundan kök hücrelerin nasıl izole edileceğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, tüm işlemler boyunca steriliteyi korumayı hatırlamak önemlidir.

Kök hücre izole edildikten sonra, hücrelerin kök hücre özelliklerini korumak için bu hücreleri düşük yoğunlukta kültürlediğinizden emin olun. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, çalışmalarınızda başarılar dilerim ve bunu deneylerinizde kullanmayı denemenizde size bol şans dilerim.

Teşekkürler.