Yumuşak Kas-iskelet Dokular Kök Hücre Yalıtımlı

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin kök hücreleri iskelet kası gibi kas-iskelet sistemi yumuşak dokularından izole etmektir. Bu, önce yumuşak dokudan bir biyopsi alınarak, debride edilerek ve ince bir şekilde doğranarak gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, dokuyu enzimatik olarak sindirmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, kök hücreleri tekrarlanan ön kaplama adımları ile izole etmektir. İşlemin son adımı, izole edilen kök hücrelerin tanımlanmasıdır. Sonuç olarak, immünofloresan, mikroskopi ve/veya akış sitometrisi kullanılarak hücrelerin morfolojik ve hücresel davranışlarını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Ortopedik Cerrahi Bölümü Moleküler Patoloji Laboratuvarı'ndan Lee. Bugün size yetişkin bir kök hücreyi iskelet kası gibi Muş iskelet sisteminin yumuşak dokularından nasıl izole edeceğinizi göstereceğim. Merhaba, ben Dr.Johnny Ward.

Pittsburgh Üniversitesi Tıp Fakültesi Ortopedik Cerrahi Anabilim Dalı'nda profesörüm. Biliyorsunuz, Dr.Young Lee ile yakın bir şekilde çalışıyorum ve bu prosedürler, bilirsiniz, iskelet kasından farklı kök hücre türlerini izole etmek ve standart gibi dokuları değiştirmek için. Laboratuvarımızda kök hücre izolesi için kullanılan prosedürler temel olarak translasyonel tıp uygulamaları ile ilgili araştırma çalışmaları yapılmaktadır.

Öyleyse çalışalım. Kök hücrelerin izole edilebileceği dokuların, vahşi tip farelerin arka bacaklarının tibia veya soleus kaslarından alınan tendonları ve iskelet kaslarını içermesine izin verin. Deri ve kemik kalıntılarını çıkardıktan sonra,% 5 FBS ile takviye edilmiş soğuk HBSS içeren bir kaba dokuları yerleştirin.

Daha sonra, dokuyu soğuk HBSS içeren kollajen kaplı tabaklara ayrı ayrı yerleştirin. Doku ayrışması ve sindirimi için temel prosedürleri göstermek için iskelet kası dokularını kullanacağız. İskelet dokularını kaba bir bulamaç haline getirmek için mikro makas ve/veya neşter bıçakları kullanın, dokuların pH enzimatik sindirimi.

MIT doku bulamaçlarını beş dakika boyunca dört santigrat derecede yaklaşık 3.500 RPM'de santrifüjde ayrı 15 mililitrelik tüplere aktararak başlayın. Bir HBSS'yi askıya alan Resus ile SANE yıkamasını çıkarın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatı çıkardıktan sonra, 10 mililitre ön ısıtma.% 0.2 kollajenaz ekleyerek bulamaçları sindirin.

Tip 11, 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe eder ve 60 dakikalık inkübasyon tamamlandığında tüpleri her 10 dakikada bir elle sallar. Bulamaçları 10 mililitre DYS boşluk çözeltisinde santrifüjleyin ve ardından yeniden süspanse edin. 37 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin, 45 dakikalık inkübasyon santrifüjünden sonra her 10 dakikada bir elle sallayın ve bulamaçları HBSS çözeltisinde 10 mililitre% 0.2'lik triplerde tekrar askıya alın.

Genellikle 37 santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe ederken, tüpleri her 10 dakikada bir ters çevirirken, inkübasyon tamamlanır. Burada gösterildiği gibi dokulardan yeterli sayıda tek hücre salındığında, elde edilen hücreleri santrifüjleyin ve hücre peletini beş mililitre proliferasyonda yeniden askıya alın. Orta PM, ekstraktı bir dizi iğneden iki kez 18 gauge iğneden, daha sonra bir kez 23 gauge iğneden ve son olarak bir kez 27 gauge iğneden geçirerek hücre süspansiyonunu ayırır.

Son olarak, prepl tekniğine başlamak için hücre ekstraktını 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Yeni hazırlanmış hücre ekstraktını santrifüjleyin ve proliferasyonda peletleri yeniden süspanse edin. Orta plaka, beş mililitre hücre karışımı, kollajen kaplı bir T 25 şişesine ve PP olarak, iki saat boyunca nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derece inkübe edilmiş olarak pazarlayın.

İki saat sonra. Yapışmayan hücreleri yeni bir kollajen kaplı T 25 şişesine aktarın ve PP iki olarak pazarlayın. PP one etiketli önceki T 25 şişesine beş mililitre PM ekleyin.

Her iki şişeyi de 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun. 24 saat sonra, yapışmayan hücreleri PP ikiden yeni bir kollajen ENC kaplı T 25 şişesine aktarın ve PP üç olarak işaretleyin. PP iki etiketli şişeye beş mililitre proliferasyon ortamı ekleyin.

Şişeleri kuluçka makinesine geri koyun. Popülasyon PP altıya kadar her 24 saatte bir işlemi tekrarlayın. Kök hücre popülasyonu oluşturulur.

İzole edilen PP altı hücresi sayıca çok azdır ve FBS'den zengin proliferasyon ortamında muhafaza edilmeleri gerekir. Bu her gün değişti. PP altı kültüründeki hücrelerin çoğu, takip eden bir ila iki haftalık kültür sırasında ölecektir.

Büyük, sağlıklı bir PP altı popülasyonu genellikle bir ila iki haftalık ek bir genişlemeden sonra oluşturulur. Diğer tüm askıda hücre gruplarını da koruyun, çoğalmalarına izin verin ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak düzenli olarak inceleyin. PP bir ve PP iki şişelerine bağlanan erken yapışan hücreler çoğunlukla fibrotik hücrelerdir.

Kollajen kaplı şişelere yapışan hücreler 48 ila 96 saat içinde daha uzun bir süre sonra. PP üç ve PP dört çoğunlukla miyoblastlardır. Kas uydu hücreleri sıklıkla PP beşte görülürken, 96 saat veya daha sonra PP altı sonrası prepl hücreleri yetişkin kök hücreler olarak kabul edilir ve küçük, yuvarlak ve yarı saydam görünürler.

İzolasyonlarının başlangıcında, kök hücre, antijen bir ve CDC 34 gibi kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu için immünohistokimya ile daha fazla karakterize edilebilirler. Size sadece farenin ikinci kütlesinden kök hücreyi nasıl izole edeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, tüm prosedürler sırasında steroidi korumayı hatırlamak önemlidir.

Kök hücre izole edildikten sonra, hücrelerin kök hücre özelliklerini korumak için bu hücreleri düşük yoğunluklu olarak kültürlediğinizden emin olun. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederim ve deneyiminizde iyi şanslar Ve bunu deneyinizde kullanmayı denemeniz için size iyi şanslar dilerim.

Teşekkür ederim.