Name: Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin, fare dokularında DNA çift iplikçikli kırıklarını γH2AX fokusları ile tespit ve kantitasyon yöntemini. Bu immünofloresan protokol, hastalık modellerinde DNA hasarını değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. LM Melbourne Araştırma (University of Melbourne) ve Biyomedikal Görüntüleme CRC ek burs tarafından desteklenmektedir. Monash Micro Görüntüleme desteği (Dr Stephen Cody ve Iska Carmichael), bu iş için çok değerli idi. MMT Ulusal Sağlık Enstitüleri Dr Olga Sedelnikova uzman yardım ve tavsiye için minnettar olduğunu.

Dokular <ol><li> Akciğer dokusu, optimal kesim sıcaklığında (OCT) bileşik 4583 kalıplar içine gömülü bir CM Leica 1950 Kriyostat (5 mikron) kesitli ve poli-L-lisin slaytlar monte edilmiş. </li></ol> Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü&#39;nde Dr. Simon Royce donmuş numuneler elde edilmiştir. Akciğer dokusunun tedavi edilmezse Balb / c farelerinde ve birçok insan astım 6 patolojik özellikleri gösteren kronik allerjik solunum yolları hastalığı, bir fare modelinde elde edildi. Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, bilimsel amaçlar için laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Avustralya Kanunu Uygulama yapışır Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü Hayvan Etik Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. <ol start="2"><li> Bölüm 1 saat oda sıcaklığında kurumaya izin verildi. </li></ol> Immünofloresan boyaması <ol><li> Bölüm 20 dakika boyunca% 2 (w / v) fosfat paraformaldehid tamponlu salin (PBS) ile tespit edildi. </li><li> Bölümler her biri için 15 dakika PBS içinde iki yıkar ile dengelenmiş. </li><li> Bölüm, her biri için 10 dakika PBS üç yıkar takip 20 dakika boyunca% 70 etanol (-20 ° C ila soğutulmuş) ile tedavi edildi. </li></ol> Bu noktada slaytlar 2 haftaya kadar 4 ° C&#39;de kapalı kaplarda saklanır olabilir. <ol start="4"><li> Bölümler her biri için 10 dakika PBS ile üç defa yıkanır ve sonra taze,% 0.5 &#39;lik Tween-20 ve% 0.1 içeren PBS içinde% 8 BSA içeren PBS içinde hazırlanan 100μL bloke oda sıcaklığında 1 saat süreyle Triton X-100 (PBS-TT) . Tüm inkubasyon nemlendirilmiş bir boyama çukurda yapıldı. </li><li> Bölüm 5 dakika PBS-TT ile yıkandı ve hidrofobik bir çevre doku etrafında bir Pap kalem ile kutlandı. </li><li> Aşırı tampon kapalı uçlu ve birincil tavşan poliklonal anti-γH2AX antikor (PBS içinde% 1 BSA, 1:500 sulandırılmış; Millipore) 100μl, oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon için her bölüm eklendi. Kuluçka primer antikor ile 4 gece yapılabilir ° C Daha fazla kanıt için, bu γH2AX odakları DSBs temsil DSB onarım protein tanıyan bir primer antikor de kullanılıyor olabilir. Örneğin, co-lokalizasyon γH2AX ve fosfor ATM yaygın olarak kullanılan bir kombinasyonudur. </li><li> Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle; bölümler her biri için 5 dakika PBS-TT iki kez yıkanır ve sekonder antikor 100μl (Invitrogen Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG% 1&#39;lik BSA ile seyreltilmiş, 1:500) ile inkübe edildi . (Seyreltilmiş antikor prosedürü boyunca karanlıkta tutuldu). </li><li> Bölüm üç kez her biri için 5 dakika PBS-TT ile yıkanmalı ve 37 ° 30 dakika 0.5mg/mL RNAse A ° C ile inkübe </li><li> Nükleer counterstaining ve montaj propidium iyodür içeren Vectashield orta ile yapıldı. </li><li> Slaytlar oje ile kapatılır ve bir gece önce 4 ° C karanlıkta analiz saklandı. </li></ol> Mikroskopi / Analiz <ol><li> (- Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG γH2AX) ve PI (543 nm) lazerler Zeiss LSM510 Meta Konfokal Mikroskop standart GFP kullanarak görüntü elde etmek için kullanılır oldu. </li></ol> Görüntüler bir adım boyutu 0,5 mikron ile Z-serisi bir desen elde edildi. Analizi sırasında, bireysel uçakları deconvoluted, üst üste odaklarının en aza indirmek için öngörülen azami bir görüntü elde etmek yığılmış. Bir parçacık sayımı öncesinde maksimum yansıtılan görüntü yaratma yöntemi sadece ince bir bölümü (örneğin 5μm) ve arka plan boyama önemsiz olduğu durumlarda kullanılmalıdır. Önemli bir arka plan ile kalın bölümlerde analiz edilmelidir Bolte ve Cordelieres (2006) tarafından açıklandığı gibi, 3B Nesne Sayaç gibi daha karmaşık bir analiz 7 kullanılmalıdır. <ol start="2"><li> Metamorph (Moleküler Cihazlar, ABD) odakları numaraları ölçmek için birleşti (kırmızı ve yeşil) görüntüleri oluşturmak için kullanılmıştır. </li></ol> Metamorph doku kesitlerinde odakları daha doğru elle sayılır (göz) kullanılarak tipik olarak odaklar numaraları ölçmek için kullanılan olabilir de. Ilgi Örneğin akciğer epitel hücreleri için özel hücre tipleri, kantitatif için seçilebilir. Bu histoloji ve hematoksilen ve eosin ile boyandı seri bölümleri referans alınarak yapılabilir.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

Tedavi edilmezse Balb / c farelerinde ve fare akciğer dokusunun kronik allerjik solunum yolları hastalığı bir fare modeli kullanılan bu gösteri amacı için. Biz biraz daha yüksek tedavi edilmezse bölümlerine göre hasarlı akciğer gözlenen ortalamaları ile hücre başına odaklarının sayısındaki farklılıklar quantitated. Özellikle, sırasıyla kantitatif, tedavi edilmezse doku ve kronik alerjik solunum yolları hastalığı doku / hücre başına 6.5 odaklar ve 9.4 odaklar başına / hücre (bölüm başına 20 hücre manuel sayma) belirtilir...

<table><tbody><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Non-spesifik antikor bağlanmasını engellemek için BSA (%1) kullanılır. Primer ve sekonder antikorlar BSA içerisinde seyreltilir.</td></tr><tr><td>PBS (Ca içermeyen)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ve Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Kesim Sıcaklığı (OCT) Bileşiği 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Poli-L-lizin lamlar</td><td>Menzel-Glaser</td><td>SF41296SP</td><td>Donuk doku kesitlerini elektrostatik olarak çeker ve ek kaplamalara veya yapıştırıcılara olan ihtiyacı azaltır.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reaktif</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (%0,5), hücreleri permeabilize etmek için kullanılan bir deterjandır</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Hücrelerin permeabilizasyonu için Triton X-100 (%0,1) kullanıldı.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-&amp;#947;H2AX (tavşan poliklonal antikor)</td><td>Primer Antikor</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>Primer antikör dilüsyonu (1:500), %1 BSA içinde.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (H+L)</td><td>Sekonder Antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>Sekonder antikorun %1 BSA içindeki dilüsyonu (1:500).</td></tr><tr><td>Etanol (%70)</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNAz A</td><td>Reaktif</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum iyodür içeren Vectashield ortamı</td><td>Reaktif</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>Propidium iyodür (kırmızı bir nükleer boya) içeren gliserol bazlı bir montaj medyumu. Bu medyum, kırılma indisine uygun yağ bazlı bir lens ile birlikte kullanılmalıdır.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Not: Yaygın olarak kullanılan DNA boyası: 4,6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI). Yalnızca uygun eksitasyon lazerine sahip mikroskoplarda kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Mini PAP Kalemi</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Lameller (22x50mm)</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Cam Coplin Jar</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Küveti</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Konfokal Mikroskop</td><td></td><td>Konfokal Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM Leica 1950 Kriyostat</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Görüntüleme analizi için yazılım</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

doku Örnekleri γh2ax foci kantitasyonu

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA çift iplikli sonları (DSBs), endojen (fizyolojik veya patolojik) süreçleri veya dışsal faktörler, özellikle iyonlaştırıcı radyasyon ve radiomimetic bileşikleri de ortaya çıkabilir, özellikle ölümcül ve genotoksik lezyonlar vardır. Fosforilasyon serin-139 kalıntı H2A histon varyant, H2AX, son derece korunmuş C-terminal SQEY motifi, γH2AX oluşturan DNA çift iplikli tatili için erken bir cevap.<sup&gt; 1</sup&gt;. Bu fosforilasyon olayı fosfatidil-inosito 3-kinaz (PI3K) proteinleri aile, ataksi telenjiektazi mutasyona uğramış (ATM), DNA-protein kinaz katalitik subunit ve ATM ve RAD3 ilgili aracılık (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Genel olarak, ayrık nükleer γH2AX odaklarının oluşumunda DSB indüksiyon sonuçları kolayca algılanır ve immünofloresan mikroskopi tarafından quantitated hangi<sup&gt; 2</sup&gt;. Verilen bu marker benzersiz özgüllük ve duyarlılık, γH2AX odakları analiz, özellikle radyasyon biyolojisi ve nükleer tıp, biyomedikal araştırma uygulamalarında geniş bir yol açmıştır. ΓH2AX odaklarının kantitatif iyonize radyasyon kaynaklı DSBs bağlamda en yaygın olarak hücre kültürü sistemleri araştırılmıştır. Hücresel radiosensitivity dışında, immünofloresan tabanlı testleri de, etkinliğini radyasyon değiştirerek bileşikler değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Buna ek olarak, özellikle kanser, γH2AX çeşitli DSB-indükleyici bileşiklerinin etkinliğini incelemek için bir moleküler marker olarak kullanılan ve son zamanlarda önemli bir belirteci olarak yaşlanma ve hastalık habercisi olan<sup&gt; 3</sup&gt;. Ayrıca, immünofloresan tabanlı yöntemler, uygun algılama ve kantitatif γH2AX odakları için adapte edilmiş<em&gt; Ex vivo</em&gt; Ve<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Burada, fare dokularda γH2AX odaklarının tespiti ve kantitatif için tipik bir immünofloresan yöntemi göstermektedir.

ΓH2AX odaklarının dayanarak DNA çift iplikli sonlarının kantitasyonu doku radiosensitivity ve radyasyon değiştirerek bileşikler etkileri değerlendirilmesi için, özellikle radyasyon biyoloji, paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada doku örnekleri γH2AX odaklarının kantitatif bir immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA çift zincir kırıkları (DSB'ler), endojen (fizyolojik veya patolojik) kaynaklı olarak ortaya çıkabilen, özellikle ölümcül ve genotoksik lezyonlardır...

Merhaba, ben Epigenomik Tıp ve İnsan Epigenetiği Laboratuvarlarından Michelle Tang. Baker IDI Kalp ve Diyabet Enstitüsü'nde doçent olan Dr. Tom Carianne tarafından yönetilmekteyiz. Bugün, hastalıklı dokulardaki DNA hasarı miktarını belirlemek için in vivo bir gamma H2AX immünofloresan testi gerçekleştireceğim.H2AX, toplam Sahel histon H2A'nın yaklaşık %2 ila %10'unu temsil eden ve memeli hücrelerinin serin 139 konumundan hızla fosforile olan bir histon varyantıdır. DNA hasarına yanıt olarak H2AX'in fosforile olmuş formu gamma H2AX olarak da bilinir ve çift zincirli kırıkların sayısı ile gamma H2AX arasında doğrudan bir korelasyon olduğu saptanmıştır. Gamma H2AX hassas bir moleküler belirteçtir ve çift zincirli kırıkların erken bir göstergesi olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, DNA hasarını tespit etmek için kullanışlı bir tekniktir.Gamma H2AX, floresan mikroskobu altında DNA hasarının olduğu bölgelerde nükleer odak noktaları olarak görselleştirilebilir. Bu deney kapsamında, Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü'nden Dr. Simon Royce tarafından temin edilen fare akciğer dokularını kullanacağım. Hava yolu hiperreaktivitesi, hava yolu yeniden şekillenmesi ve hava yolu inflamasyonu dahil olmak üzere insan astımının birçok patolojik özelliğini gösteren kronik alerjik hava yolu hastalığı fare modelinin akciğer dokularındaki DNA hasarını inceleyeceğim.Deneye başlayalım. Örnekleri yaklaşık 20 dakika boyunca kriyostatın içine yerleştirerek -20 °C'ye düşürerek başlıyoruz. Optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşikleri için, doku kesitlerinin lamlardan ayrılmaması amacıyla mikroskop lamları kullanılır.İmmünofloresan boyama sırasında, örnekleri chuck'a sabitlemek için OCT kullanılır; chuck'ı, güvenli bir şekilde tutturulduğundan emin olarak kesim bloğuna yerleştirin. Kriyostatı beş mikrometre doku kesitleri alacak şekilde ayarlayın, bir boya fırçasıyla örnekleri kendinize doğru çekerek dikkatlice kesim işlemine başlayın; mikroskop lamını kesitlerin üzerine yerleştirin, kesitler cam yüzeye yapışacaktır. Devam etmeden önce tüm nemin giderildiğinden emin olmak için kesitlerin oda sıcaklığında bir saat boyunca kurumasına izin verin.İlk olarak, doku kesitlerini kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS içinde hazırlanan %2 paraldehit ile 20 dakika boyunca fikse ediyoruz. Fazla paraldehidi uzaklaştırarak lamları, hücre membranını permeabilize etmek için PBS ile iki kez 15 dakikalık yıkama işlemine tabi tutmak üzere bir Copeland kavanozuna yerleştiriyoruz; permeasyon adımının ardından örnekler -20 °C'de %70 etanol ile 20 dakika boyunca işleme alınır. Örnekler PBS ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkanır.Doku kesitlerinin kurumasını önlemek için her bölgeyi tek tek temizleyin. Lam üzerindeki fazla PBS'yi uzaklaştırın ve ardından kesitleri, 0.5% ile 0.1% arasında Triton X 100 içeren PBS (P-B-S-T-T olarak da bilinir) içindeki %8 BSA ile bloke edin. Bu lamlar oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilir; inkübasyonun ardından örnekler beş dakika boyunca P-B-S-T-T ile yıkanır.Antikorların çekirdeğe nüfuz etmesini kolaylaştırmak için PBS TT kullanılır. Ardından, fazla P-B-S-T-T'yi uzaklaştırmak için lamlar kurulanır ve kurutulur. Kullanılan reaktif miktarını azaltmak amacıyla, kesitlerin etrafı bir pap kalem ile daire şeklinde çizilir.Primer antikor olarak, anti phospho gamma H tox hızlı poliklonal antikor kullanıldı. P-B-S-T-T içinde %1 BSA ile 1/500 oranında dilüsyon hazırlandı. Bu kesitler nemli bölmeye yerleştirildi ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edildi.Fazla primer antikoru uzaklaştırmak için P-B-S-T-T ile beşer dakikalık iki yıkama işlemi gerçekleştirmeden önce primer antikoru boşaltın. Lamları çıkarın ve fazla P-B-S-T-T'yi kurulayın. Floor 4 88 goat anti Reid IJJ antikoru kullanılmıştır.P-B-S-T-T içerisinde %1 BSA ile hazırlanan 1/500 dilüsyonundaki sekonder antikor örneklere eklendi. Kesitler ardından nemli bir kamarada bir saat boyunca inkübe edildi; üç kez beşer dakikalık N-P-B-S-T-T yıkamaları gerçekleştirilmeden önce sekonder antikor boşaltıldı.Her bir yıkama adımı boyunca ışığa maruz kalmayı önlemek için Copeland kavanozunu alüminyum folyo ile kaplayın. Lamları çıkarın ve fazla P-B-S-T-T'yi kurulayın. Sitoplazmik boyanmayı azaltmak için PBS içinde 0.5 mg/mL RNAse A eklemesi yapılmıştır.Numuneler daha sonra 37 °C'de %5 karbondioksit ile 30 dakika boyunca inkübe edilir. İnkübasyonun ardından RNAs A boşaltılır ve kesitlerin kurumasını önlemek için numuneler kısaca P-B-S-T-T ile yıkanır. Montaj medyumu eklenmeden önce numuneler alüminyum folyoya sarılı tutulmalıdır.Slaytları tek tek çıkarın ve fazla P-B-S-T-T'yi tampon kâğıdıyla alın. Her bir kesitin üzerine, kırmızı bir nükleer boya olan propidyum iyodür içeren vector shield montaj ortamı ekleyin. Ardından, hava kabarcığı kalmamasına dikkat ederek lamelli dikkatlice yerleştirin ve fazla vector shield'ı emici bir kâğıtla temizleyin.Ardından, sızdırmazlığı sağlamak ve örneklerin kurumasını önlemek için lamelin kenarlarını cilalayın. Son olarak, lamlar mikroskopi için gerekli olana kadar örnekleri dört derece Celsius sıcaklıkta, karanlık bir yerde saklayın. 63 kat yağ daldırma objektifi kullanılarak dijital görüntüler elde etmek için bir zeiss LSM 510 meta konfokal mikroskop kullanılmıştır; Alexa fluor 488 için 488 nanometre ve propidyum iyodür boyası için 543 nanometre dalga boyunda argon ve helyum neon lazerler kullanılmıştır.Her bir alan, 0,5 micrometers adım boyutu ve tek seferlik zoom ile sekiz ila 15 optik Z serisi kesitten oluşmuştur. Görüntüler ayrı TIF dosyaları olarak dışa aktarılmış ve metamorph Images kullanılarak analiz edilmiştir. zes LSM five 10 meta fokal mikroskoptan elde edilen görüntüler, görüntü analizi ve ilk gözle sayım için metamorph programında açılmıştır. Z serisi olarak elde edilen floresan görüntüler, maksimum projeksiyon filtreleri kullanılarak 2D bir görüntü oluşturmak amacıyla dekonvolüsyona tabi tutulmuş ve üst üste istiflenmiştir.Bu işlem, daha az yoğun odakların kaybını en aza indirmek için yapılmıştır. Maksimum projeksiyon görüntüleri ikili bir görüntüye dönüştürülür ve arka planı azaltmak ve odak tespitinin hassasiyetini artırmak için top hat gibi morfolojik filtreler uygulanır. Karşılık gelen propidyum iyodür görüntüleri yüklenir ve nükleer bölgeler tanımlanır.Bu bölgeler, alan başına odak sayısını belirlemek amacıyla çekirdeklerin etrafına manuel olarak bölgeler çizilerek vurgulanır. Bu bölgeler top hat görüntülerine aktarılır ve hafif eşik filtreleri uygulanır. Eşik değeri, odaklarla uyumlu olacak ve her bir alan içerisinde herhangi bir arka plan girişini önleyecek şekilde, görsel karşılaştırma yapılarak dikkatle seçilmiştir.Odakların sayımı için IMA entegre morfo analizi kullanılmıştır. Alternatif olarak, sonuçların güvenilirliğini sağlamak amacıyla manuel sayımlar gerçekleştirilebilir. Böylece, hastalıklı dokulardaki DNA hasarı miktarını belirlemeye yönelik in vivo immünofloresan boyama protokolü tamamlanmış olur.Bu teknik, farklı stimülasyonların neden olduğu DNA hasarının tespit edilmesi için uygundur. Bununla birlikte, iyonlaştırıcı radyasyona verilen yanıtların ve radyosensitivitenin değerlendirilmesi için en uygun yöntem olacaktır. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler.

quantitation-of-h2ax-foci-in-tissue-samples

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA çift iplikli tatili yanıt Ser-139 H2AX fosforilasyon aşağıdaki formu γH2AX odakları, mikroskobik analiz radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada çekirdeğin içinde radyasyona bağlı γH2AX oluşumu uzamsal dağılımını değerlendirmek için, aktif transkripsiyonu ökromatin bir epigenetik işaretleyici olarak mono-metil histon H3 lizin 4 antikor kullanılır.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

Bu videoda, insan mononükleer hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılma bölgelerinde lokalize olan spesifik DNA hasar yanıt proteinlerini tespit etmek için immünofloresan mikroskopi tekniğini açıklıyoruz. Proteinler, spesifik birincil antikorlar tarafından tanınır ve bu antikorlar, mikroskobik görselleştirme sırasında floresan olan florofor etiketli ikincil antikorlara bağlanır ve proteinlerin hücre çekirdeği içinde farklı floresan odaklar olarak görselleştirilmesini sağlar.

DNA Çift İplikli Kırılmaların Analizi için İmmünofloresan Mikroskobu

Hücresel yaşlanma, hücre döngüsü tutuklama tersinmez durum, çeşitli hücresel stresler tarafından indüklenebilir. Burada, yaşlanmanın işaretlerini değerlendirmek için hücre yaşlanmasının ve yöntemleri ikna etmek protokolleri açıklar.

Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Sunulan yöntem DNA çift iplikçiks breaks (DSBs), hücre döngüsü dağılımı ve apoptosis kantitatif analizi birleştirerek DSB indüksiyon ve onarım hücre döngüsü özgü değerlendirilmesi yanı sıra onarım başarısızlık sonuçları sağlar.

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu protokol, periferik kan lenfositleri üzerinde γ-H2AX odak analizinin slayt hazırlanmasını ve otomatik puanlamasını sunar. Tahlil yöntemini ve hassasiyetini göstermek için, izole lenfositler in vitroışınlandı. Dna DSB algılamanın bu otomatik yöntemi, hızlı ve yüksek verimli biyolojik dozimetri uygulamaları için yararlıdır.

İnsan Periferik Kan Lenfositlerinde γ-H2AX Odak Analizi için Otomatik Mikroskobik Puanlama Yöntemi

Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Öğrenin, fare dokularında DNA çift iplikçikli kırıklarını γH2AX fokusları ile tespit ve kantitasyon yöntemini. Bu immünofloresan protokol, hastalık modellerinde DNA hasarını değerlendirmek için kullanılır.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

Daha fazla video keşfet