Name: Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin KDM5A/RBP2 histon demetilazının genomik hedeflerini belirlemek için ChIP-Seq yöntemini. Bu teknik epigenetik düzenleme ve gen regülasyonu çalışmalarında araştırmacılara önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH den 115.347-RSG-08-271-01-GMC ACS ve CA138631 tarafından hibe tarafından desteklenmiştir.

Protokol başlangıçta B. Ren, 2001 uyarlanmıştır. Odom ve arkadaşları tarafından protokol hafif bir değişiklik temsil eder. Bulunabilir 5 <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Ön-blok ve manyetik boncuk antikor bağlayıcı (sonraki adım, bir gece önce uygulanmalı) <ol><li> 1 ml taze BSA / PBS solüsyonu (50 mg 10 ml BSA PBS-Bu çözüm, bir hafta boyunca sürecek). Dynabeads Protein G 100 mcL yıkayın (IP başına birden fazla IP adresleri için, birleştirmek) </li><li> Manyetik bir stand boncuklar kullanarak toplayın ve yıkama işlemi iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Sonra, ul PBS / BSA çözüm boncuk bulamaç (IP başına) 250 10 mikrogram antikor ve 4 geceleme dönen bir platform üzerinde inkübe ° C </li><li> Tamamlandığında, PBS / BSA çözüm 1 ml boncuk üç defa yıkamak ve sonra PBS / BSA çözüm (IP başına) 10 ul tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 2. Hücre çapraz bağlama <ol><li> Bu yordamı başlamak için, yaklaşık 10 8, her immunoprecipitation hücre, ya da IP büyür . Burada, diffüz histiyositik lenfoma U937 hücrelerinin kullanılan ve 96 saat TPA ile monositik farklılaşma için uyarılan. </li><li> Hücre büyümesinin ardından, doğrudan nihai konsantrasyonu% 1 ortam formaldehit ekleyin. Daha sonra, onları 10 dakika boyunca oda sıcaklığında oturup girdap şişeler kısaca ve izin verir. Sonra, medya aspire hücreleri ve buz gibi soğuk PBS 15 ml ile durulayın. Bu yıkama bir kez tekrarlayın. </li><li> Daha sonra, her 6 Lizis Tampon 1 ml (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 10 gliserol,% 0,5 'NP-40, Triton proteaz inhibitörleri içeren X-100,% 0.25) buz üzerinde şişe. Daha sonra, 4 için en az 20 dakika şişeler kaya ° C </li><li> Son olarak, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücrelerin hasat ve 15 ml konik tüpler aktarabilirsiniz. Bu noktada hücreler, -80 ° C'de saklanabilir </li></ol> 3. Hücre Sonikasyon <ol><li> Hücreler dondurulmuş olsaydı, onları Çözülme. Çözülmüş sonra, 10 dakika 3.000 rpm'de 4 hücreleri aşağı dönmeye ° C ve supernatant atın. Sonra, Lizis Tamponu 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1mm EDTA, 0.5 mM EGTA, proteaz inhibitörleri içeren) mL 6 hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça Rock tüpler. </li><li> Santrifüj tekrarlayın ve 2.5 mL Lizis Tampon 3 (proteaz inhibitörleri içeren 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA,% 0,1 sodyum deoksikolatın, 0,5% N lauroylsarcosine,) hücrelerin tekrar süspansiyon . </li><li> Sonra, 50 ve% 60 genlik arasında bir Branson 450 Sonifier mikrotip buzlu su behere koyarak sonication için süspansiyon hazırlamak. </li><li> Çözüm için, 1 dakika buz üzerinde 30 saniye sabit bir patlama ve serin sonikasyon. Bu bakliyat, 10 ila 15 kez tekrarlayın. Daha sonra, tüpün içeriğini pipet ve aşağı ve yeni bir tüp aktarabilirsiniz. Ek bir 5 kez nabız ve çözüm soğutmak için devam edin. </li><li> Sonication ardından,% 10 Triton X-100 çözümü hacminin 1 / 10. 1,5 mL santrifüj tüplerine lizatları aktarın ve bir mikrosantrifüj enkaz döndürün. Sonra yeni bir tüp hücre lizat aktarın. </li></ol> 4. Kromatin Immunoprecipitation <ol><li> Kromatin immunoprecipitation veya ChIP önce giriş örnek olarak hücre lizat 50 mcL kaydedin. Sonra, Dynabeads yukarıda açıklandığı gibi önceden hazırlanmış antikor ön bağlı temizlenir hücre lizat birleştirir. 4 ° C gecede, 50 mcL giriş örnek ek olarak, Rock karışımı. </li><li> Yıkama Tamponu 1 mL (50 mM Hepes KOH, pH 7.6, 0.5 M LiCl, 1mm EDTA,% 0.7 sodyum deoksikolatın,% 1 NP-40) ile boncuk yıkayın. Daha sonra manyetik bir stand, boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için kullanın. Bu yıkama 6 ila 8 kez tekrarlayın. </li><li> Ile son yıkama gerçekleştirin 1 ml TE-artı-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). 2 dakika 3.000 rpm'de mikrosantrifüj boncuk Spin 4 ° C Santrifüj sonrasında, herhangi bir kalıntı TE tampon aspirat. </li><li> Sonra, örnekleri Elüsyon Tampon (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA,% 1 SDS) 100 mcL ekleyin. Hemen sonra, 65 numunelerin inkübasyon ° C'de 10 ila 15 dakika. Süspansiyon boncuk tutmak için 1.5 ml tüp raf her 2 dakikada karşı tüpler kazıyın. </li><li> Santrifüj ve manyetik standı kullanarak boncuk toplamak ve PCR tüp süpernatantı transfer. Sonra, önceden kaydedilmiş bir giriş örnek almak ve Elüsyon Tampon 3 cilt. </li><li> Son olarak, 65 gece termal cycler içine IP ve giriş örnekleri yerde ° Cçapraz bağlantıların ters. </li><li> Ertesi gün, örnekleri TE tampon 1 hacim ekleyin. Daha sonra, nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml RNaz A ekleyin. 37 için 1 ila 2 saat termal cycler örnekleri inkübe ° C </li><li> Inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml proteinaz K ekleyin. Daha sonra, 2 saat boyunca termal cycler numune 55 ° C'de inkübe. </li><li> Sonra, fenol ile bir kez, bir ses örnekleri ayıklayın. Kloroform: izoamil alkol, fenol, bir ses örnekleri ikinci kez ayıklayın. Izoamil alkol: Son olarak, bir kez daha bir hacim kloroform örnekleri ayıklamak. </li><li> Sonra, her bir örnek için 30 mg glikojen ekleyin. Ayrıca, numunelerin etanol 0.2 Molar ve iki ciltlik bir son konsantrasyonu NaCl ekleyin. 30 dakika inkübe -80 ° C Inkübasyondan sonra, numuneler ve spin süpernatantı süzün. Pelet 500 mcL% 75 etanol ile yıkayın. Sonra, pelet ve kuru onlara su 40 mcL yeniden askıya. </li><li> Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutları kontrol etmek için,% 1.8 agaroz jel 5 mikrogram, arıtılmış giriş örnek jel yüklemek ve çalıştırmak. Sonication prosedürü aralığı 150-350 baz çifti parçaları üretmek gerekir. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değiştirerek ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> 1 IP örneklerinin ul ve seyreltme serisi ile girdi örnek bir gen-spesifik PCR gerçekleştirerek kontrolü bağlayıcı bölgelerde zenginleştirme ChIP sağlamlık ve özgünlüğü kontrol için. IP ve giriş örnekleri kalitesini test etmek için iki ya da üç "bound" bölgeler ve ilişkisiz bir kontrol bölgesi seçilmesi gerekir. </li></ol> 5. Genomik DNA amplifikasyonu <ol><li> IP giriş numune numune veya 200 ng 34 ul ile başlayarak, son onarım, Genomik DNA Sample Hazırlık Seti kullanarak DNA parçalarının 'A' kuyruk ek ve adaptörleri ligasyonu gerçekleştirmek <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc, San Diego, CA). </li><li> MinElute PCR Arıtma kiti kullanılarak DNA arındırmak ve daha sonra 50 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış edildiğini tampon EB (10 mM Tris Cl, pH 8.5) Zehir Örneğin, sırasıyla, IP ve giriş DNA örnekleri son yürütülmesi için 23 mcL ve 46 mcL kullanın. </li><li> 20 mcM Sol_PCR_2 mcL adaptörleri ile DNA'nın 23 mcL kullanarak PCR ve kit 25 mcL Phusion DNA polimeraz, 20 mcM Sol_PCR_1 1 mcL, ve 1 yapın. PCR reaksiyonu aşağıdaki gibi çalıştırın: 98, 2) 10 saniye 98 ° C, 3) 30 saniye 65 ° C ° C 1) 4) 30 saniye 30 saniye 72 ° C; adımları yineleyerek adım 2-4 18 72 kez ve daha sonra 5 dakika ° C, son olarak 4 tutarak ° C </li><li> PCR ardından QIAGEN MinElute PCR Arıtma Kiti ile DNA arındırmak. Ön tampon EB-50 sıcak 15 mcL ° C ve DNA Zehir. Örnek 01:04 0.5 mcL seyreltilir ve bir Nanodrop okuma yapmak. </li></ol> 6. Amplifiye ürünlerin Jel arıtma <ol><li> Çoğaltılan ürünlerin arındırmak için, HPLC-sınıf su kullanarak 50 ml% 1.8 agaroz jel hazırlayın. TAE ve etidyum bromür agaroz erimesinden sonra ekleyin. Daha sonra, jel dökün. Giriş ve IP örnekleri yükleme tamponu 4 mcL ekledikten sonra jel yükleyin. Daha sonra, 45 dakika için 120 volt jel çalıştırın. </li><li> Çalıştırıldıktan sonra jel analiz edin. Jel, 150 ve 350 baz çifti üretilir aralığında o parçaları ortaya çıkarmak gerekir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. </li><li> Vergi bir neşter ile 150 350 baz çifti aralığı madde içeren jel bölgesi. Adaptörü adaptörü bant eksize önlemek için dikkat edin, yaklaşık 120 baz çifti çalışır. Üreticinin talimatlarına göre bir QIAquick Jel Ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA kurtarın. Özellikle QIAquick Jel Ekstraksiyon Kit, 400 mg veya daha az bir jel dilim için bir sütun kullanabilirsiniz. Ekstraksiyon işlemine başlamak için 3 cilt, 1 hacim jel tampon QG ekleyin. 1 hacim izopropanol ekleyin ve sütun karışımı yük. 0.5 ml QG sütun yıkamak için kullanın, kiti kılavuzda açıklanan standart prosedür takip etti. H 2 O önceden ısıtılmış 50 ° C DNA Zehir. 37 az 5 dakika 30 H 2 O ul sütun ° C'de aşağı iplik önce. </li><li> Kuru ısı olmadan Speedvac tam 11 mcL aşağı örnek. Örnek 1 mcL çıkarın ve Nanodrop spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçmek. </li><li> Son olarak, açıklanan Illumina Genom AnalyzerIIe kullanarak zenginleştirilmiş gen ürünleri belirlemek <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>6 / 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Aşağıdaki deneme genel amacı KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase genomik hedefler belirlemektir. (P1) Bu, uygun büyüklükte DNA parçaları üretmek için sonicated, çapraz bağlantılı kromatin hazırlanması ile elde edilir. (P2) ikinci bir adım olarak, RBP2 bağlı DNA parçaları RBP2 antikorlar immunoprecipitated. Sonraki (P3), kurtarılan DNA parçalarının ucunda tamir ve adaptörleri Illumina Küme Station akış hücreleri genomik DNA analizi için kütüphaneler hazırlamak için genomik DNA ucu üzerine bağlandı. DNA kütüphaneler döngü az sayıda kullanarak PCR ile güçlendirilir. (P4) Son olarak, aydınlatıcı sıralı kısa benzersiz insan genomu hizalanır okur, önemli zirveleri RBP2 zenginleştirilmiş bölgeleri tanımlamak için tanımlanan ve en yakın genlere açıklamalı vardır. (P5) Sonuçlar RBP2 zenginleştirilmiş bölgelerin genom kimlik dayalı RBP2 hedef genleri ile ilişkili moleküler fonksiyonları elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutlarını kontrol etmek için kromatin sonication sonuçlarını kontrol etmek, 5 mg (1 / 10), saflaştırılmış giriş numunenin% 1.8 agaroz jel üzerinde yüklenmiştir . Beklendiği gibi, bizim sonication işlem aralığı 150-350 bp parçaları üretti. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değişen, buna göre ayarlanabilir olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Amplifiye ürünler Jel arıtma PCR ürünleri adaptörleri kaldırmak ve küme yeni nesil platform için şablonlar bir boyut aralığı seçmek için bir jel üzerinde çalıştırılır. Bu jel, 150 ve 350 baz çifti aralığında üretilen parçaları olduğunu gösterir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. Bir neşter ile jel tüketim Seçili bölge. Bakım yaklaşık 120 baz çifti çalışır adaptörü adaptörü bant önlemek için alınmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Izoform-spesifik antikor RBP2 büyük ve küçük izoformları arasında ayırım sağlar. RBP2 protein yapısı etki alanı görünümünde sunulmaktadır . Katalitik histon demetilasyon JmjC etki alanı ve ilişkili JmjN etki, sekans spesifik DNA bağlanmasını, potansiyel DNA veya diğer proteinler ve çok sayıda PHD alanlarını ile etkileşime girebilir C5HC2 çinko parmak yeteneğine sahip bir KURAK etki alanı: RBP2 birkaç etki alanı içerir. RBP2 izoformları arasında ayırt izin iki anti-RBP2 antikorlar, kalın çizgi ile gösterilen RBP2 parçaları karşı elde edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Şekil 5a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5a"> Şekil 5a. Kromozom ve Ensembl genleri ile birlikte RBP2 bağlayıcı bölgelerin Genel Bakış. Genomik koordinatları (tüm izoformlarını ve büyük izoformu) bağlayıcı bölgeleri tespit zenginleştirilmiş RBP2 kromozom bilge sunulmaktadır. Ensembl genler Occupances (sürüm 54; hg18) kromozomlarda (Bu resim 10 kromozom) siyah çubuklar (üst panel) olarak sunulmuştur. Her RBP2 bağlayıcı bölgenin orta paneli tüm RBP2 izoformları kromozom 10 üzerinde bağlayıcı bölgeleri gösterir dikey bir çizgi olarak temsil ve alt panel RBP2 büyük izoformu bağlayıcı bölgeleri gösterir. Orta ve alt paneller örtüşen bakış ve kromozom 10 RBP2 izoformları belirli doluluk verir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Şekil 5b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5b"> Şekil 5b. RBP2 hedef genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizi. İlgi haritası FDR gösteren zenginleştirilmiş RBP2 (ve büyük tüm izoformları) (genler yakın RBP2 bağlayıcı bölgeye) bağlı genler arasında Moleküler Fonksiyon kategoriler GO (p-değeri ≤ 0.05) önemli ölçüde düzeltilmiş. Kırmızıya doğru renkler yüksek istatistik önemi gösterir, sarı düşük istatistik önemi gösterir ve gri hiçbir istatistik önemi gösterir. Zenginleştirme analizi RBP2 hedef genlerin birbiriyle örtüşen ve izoform spesifik moleküler fonksiyonları gösterir.

<ol><li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li>
<li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li>
<li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li>
<li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li>
</ol>

RBP2 izoformları arasında işlevsel farklılıklar tespit edilmemiştir. Biz RBP2 izoformları bağlı genomik bölgelerin belirlenmesi ve bu bölgelerde temsil ettiği fonksiyonel kategoride tanımlamak için kapsamlı bir yaklaşım kullandık. Bu elde edilen dizisi biyoinformatik analiz okur takip ChIP Seq analizi ile gerçekleştirildi. RBP2 histon kuyrukları metil lizin kalıntılarının değiştirir. Biz RBP2 büyük izoformu, insan genomu (Şekil 5A) farklı bölgelerinde bu modül bağlama eksik metil histon lisin ve RBP2 küçük izoformu için tanıma modülü içeren bulundu. Önemlisi, izoform belirli bölgelerde ve örtüşen bölgelerinde farklı moleküler fonksiyonları (Şekil 5B) ile genler aittir. Örneğin, &quot;kromatin bağlayıcı&quot; ve &quot;transkripsiyon faktörü bağlayıcı&quot; fonksiyonları RBP2 küçük izoformu gen hedefleri atfedilen olabilir ama değil RBP2 büyük izoformu (Şekil 5B). Gerçek gen karşılaştırarak büyük izoformu özellikle bazı genlerin işe ise tüm izoformları ve RBP2 büyük izoformu (veriler gösterilmemiştir) için, biz de tanımlayabilirsiniz oluşturulan ayarlar.

Oligonükleotid dizileri 2006 Illumina, Inc Tüm hakları saklıdır. <ul><li> Sol_PCR_1 Sıra 5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Sıra 5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

izoform özel gen hedefler belirlemek için chip kullanarak genom analizi

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Hedeflerine transkripsiyonel ve epigenetik faktörlerin İşe Alım kendi düzenlenmesinde önemli bir adım. Göze çarpacak belirli histon modifikasyonları bağlamak protein etki işe özellikli. Böyle bir etki birkaç kromatin bağlayıcı proteinler bulunan bitki homeodomain (PHD). Epigenetik faktörü RBP2 birden fazla PHD etki vardır, ancak, farklı işlevleri vardır (Şekil 4). Özellikle, bir insan lösemi RBP2 onkojenik füzyon bulunan C-terminal PHD etki alanı, histon H3 (H3K4me3) 1 lizin 4 trimethylated bağlanır. C-terminal PHD içeren RBP2 izoformu karşılık gelen transkript 2 monositler içine promonocytic, lenfoma kaynaklı, U937 hücrelerinin farklılaşma sırasında birikir. Her iki veri setleri ile tutarlı olarak, genom analizi farklılaştırılmış U937 hücrelerinde RBP2 protein H3K4me3 3 için yüksek derecede zenginleştirilmiş genomik bölgelerde lokalize aldığını gösterdi. Için RBP2 hedeflerine Yerelleştirme H3K4me3 RBP2 histon demethylase aktivite ve transkripsiyonel aktivite azalması nedeniyle bir azalma ile ilişkilidir. Buna karşılık, RBP2 iki diğer doktoralıların H3K4me3 bağlamak mümkün değildir. Özellikle, RBP2 C-terminal etki alanı PHD küçük RBP2 izoform 4 yoktur. H3K4me3 ile etkileşim yoksun RBP2, küçük izoformu genomik yerde büyük izoformu farklıdır düşünülebilir. RBP2 izoformları genomik yerde fark RBP2 fonksiyonunda gözlenen çeşitlilik için hesap. Özellikle, RBP2 retinoblastom protein (pRB) aracılığı ile hücre farklılaşmasında önemli bir oyuncu. 2) bir RBP2 bağlı genler farklılaşma-1) RBP2 farklılaşma bağımsız bir şekilde bağlı genler: izoformları arasında ayrım gözetmeksizin bu veriler, daha önceki genom analizi ile uyumlu olarak, iki ayrı grupta RBP2 hedef genlerin tespit bağımlı bir şekilde. Izoformları arasında yerelleştirme farkları belirlemek için ChIP-Seq genom yer analizi yapıldı. Hepimiz RBP2 hedefleri bulunan iki RBP2 izoformları tespit antikorlar kullanma. Ayrıca biz sadece büyük ve küçük RBP2 izoform (Şekil 4) bağlayan antikorlar var. Büyük izoformu hedefler belirledikten sonra, bir sonra küçük izoformu hedefleri ortaya çıkarmak için tüm RBP2 hedeflerden çıkarabilirsiniz. Bu veriler katkı genomunda bağlayıcı sitelerine protein alımında kromatin-etkileşim etki göstermektedir.

Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Transkripsiyonel ve epigenetik faktörlerin hedeflerine yönlendirilmesi, bu faktörlerin düzenlenmesinde temel bir adımdır. Yönlendirme sürecinde öne çıkanlar arasında ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir KDM5A/KDM5B/KDM5C histone demetilaz olan KDM5A'nın genomik hedeflerini belirlemektir. Bu işlem, ilk olarak çapraz bağlanmış kromatin hazırlanması ve ikinci adım olarak uygun boyutta DNA fragmanları üretmek için sonikasyon uygulanmasıyla gerçekleştirilir. KDM5A'ya bağlı DNA fragmanları, KDM5A antikorları kullanılarak immünopresipite edilir.Ardından, geri kazanılan genomik DNA, sekanslama için PCR ile çoğaltılır. Son olarak, Illumina ile sekanslanan kısa okumalar insan genomuna özgün şekilde hizalanır; anlamlı pikler belirlenerek en yakın genlerle ilişkilendirilir. Rbbb iki hedef genini tanımlamak amacıyla, genom genelindeki Rbbb iki zenginleşmiş bölgelerin belirlenmesine dayanarak Rrb B iki hedef geni ile ilişkili moleküler fonksiyonları gösteren sonuçlar elde edilir.Merhaba, ben Mike. Chicago'daki Illinois Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Genetik Bölümü'nde Dr. Elizabeth Bencia'nın laboratuvarından geliyorum. Ben de BARCEL Biyomedikal Araştırma Parkı Üniversitesi'nde Dr. NGA liderliğindeki Biyomedikal Genomik laboratuvarından Ala.Ben Danielle Dal. Ben de William Richter. İkimiz de Benevolence Beceri Laboratuvarı'ndayız.Bugün sizlere kromatin immünopresipitasyon ve sekanslama prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda histon demetilazların bağlanma bölgelerini incelemek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Bu prosedüre başlamak için, her bir immünopresipitasyon veya ip için yaklaşık 10⁸ hücre büyütün. Burada, diffüz osteolitik lenfoma kullanılmıştır.U 9 37 hücreleri kullanılır ve hücre büyümesini takiben 96 saat boyunca TPA ile monositik farklılaşma için indüklenir; formaldehit çözeltisi doğrudan besiyerine %1 nihai konsantrasyona gelecek şekilde eklenir. Ardından balonu kısa bir süre çalkalayın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Sonrasında besiyerini aspire edin ve hücreleri 15 mililitre buz gibi soğuk PBS ile durulayın. Bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.Ardından, buz üzerindeki her bir erlene altı mililitre lizis tamponu bir ekleyin. Sonra erlenleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca sallayın. Son olarak, hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve 15 mililitrelik konik tüplere aktarın.Bu noktada hücreler -80 °C'de saklanabilir. Hücreler dondurulmuşsa, onları çözdürün. Çözdürme işlemi tamamlandıktan sonra hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı atın.Ardından hücreleri altı mililitre lizis tamponu iki içerisinde tekrar süspanse edin ve tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe sallayın. Santrifüj işlemini tekrarlayın ve hücreleri 2,5 mililitre lizis tamponu üç içerisinde tekrar süspanse edin. Sonrasında, süspansiyonu buzlu su dolu bir behere yerleştirerek sonikasyona hazırlayın ve genliği %50 ile %60 arasında ayarlanmış bir Branson 450 sonikatörün mikro ucunu kullanın.Çözeltiyi 32 saniyelik sabit bir patlama şeklinde sonike edin ve buz üzerinde soğutun. Bu darbeleri bir dakika boyunca 10 ila 15 kez tekrarlayın, ardından tüpün içeriğini pipetle yukarı aşağı çekerek yeni bir tüpe aktarın. Çözeltiyi darbeli sonikasyon ve soğutma işlemine devam ettirin.Sonikasyondan sonra beş kez daha, çözelti hacminin onda birine %10 Triton X 100 ekleyin. Ardından lizatları 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve kromatin immünopresipitasyon veya chip öncesinde kalıntıları mikro santrifüjle çöktürün. Hücre lizatının 50 mikrolitresini girdi örneği olarak saklayın.Ardından, berraklaştırılmış hücre lizatı, yazılı protokolde açıklandığı şekilde önceden hazırlanmış antikor bağlı dyna beadlerle birleştirildi. Karışımı, 50 µL girdi örneğiyle birlikte dört °C'de gece boyunca sallayarak inkübe edin. Boncukları bir mL yıkama tamponu ile yıkayın.Ardından, boncukları toplamak için manyetik bir stant kullanın ve süpernatantı uzaklaştırın. Bu yıkama işlemini altı ila sekiz kez tekrarlayın. Son yıkamayı bir mililitre TE artı 50 millimolar sodyum klorür ile gerçekleştirin.Santrifüj işleminin ardından boncukları bir mikro santrifüjde döndürün ve kalan TE tamponunu aspire edin. Ardından, örneklere hemen 100 µL elu tamponu ekleyin.Numuneleri 65 °C'de 10 ila 15 dakika inkübe edin. Boncukların süspansiyon halinde kalmasını sağlamak için tüpleri her iki dakikada bir 1,5 mL tüp rafına sürterek hafifçe çalkalayın. Boncukları santrifüj ve manyetik stand kullanarak toplayın ve SNAT'ı bir PCR tüpüne aktarın.Ardından, daha önce saklanan girdi örneğini geri alın ve üç hacim elüsyon tamponu ekleyin. Son olarak, IP ve girdi örneklerini gece boyunca 65 °C'de termal döngüleyiciye yerleştirin. Ertesi gün çapraz bağları geri çevirmek için örneklere bir hacim TE tamponu ekleyin.Ardından, RNA A'yı 0.2 µg/µL nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin. Örnekleri termal döngüleyicide 37 °C'de bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyon sonrası, proteinaz K'yı 0.2 µg/µL nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin.Ardından örnekleri termal döngüleyicide 55 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, örnekleri bir birim fenol ile bir kez ekstrakte edin. Örnekleri ikinci kez bir birim fenol kloroform izoamil alkol ile ekstrakte edin.Son olarak, örnekleri bir hacim kloroform izoamil alkol ile bir kez daha ekstre edin. Ardından, her örneğe 30 µg glikojen ekleyin. Ayrıca, örneklere final konsantrasyonu 0.2 M olacak şekilde sodyum klorür ve iki hacim etanol ekleyin.Bunları -80 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından örnekleri santrifüjleyin ve süpernatanı dökün. Peletleri 500 µL %75 etanol ile yıkayın, ardından peletleri kurutun ve 40 µL su içerisinde yeniden süspande edin.SONİKASYON prosedürü ile üretilen DNA fragmanlarının boyutlarını kontrol etmek için, saflaştırılmış girdi örneğinden beş mikrogramı %1,8'lik agaroz jele yükleyin ve jeli çalıştırın. Sonikasyon prosedürü, 150 ile 350 baz çifti aralığında fragmanlar üretmelidir. Ancak, fragmanlar bu aralıkta değilse, genomik DNA amplifikasyonu öncesinde patlama sayısı ve amplitüd değiştirilerek sonikasyon prosedürü ayarlanmalıdır.Yazılı protokolde açıklandığı şekilde örneklerin boyutunu, konsantrasyonunu ve zenginleşmesini kontrol edin. Genomik DNA amplifikasyonuna başlamak için, IP örneğinden 34 µL ve girdi örneğinden 200 ng alın. Yazılı protokolde açıklandığı şekilde, bir Illumina genomik DNA örnek hazırlama kiti kullanarak DNA fragmanlarına A-kuyruğu eklemesi ve adaptör ligasyonu gerçekleştirin ve onarın.DNA'yı bir mini lut PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve ardından 50 °C'ye önceden ısıtılmış EB tamponu ile elüe edin. IP ve girdi DNA örnekleri için sırasıyla 23 µL ve 46 µL kullanın. PCR reaksiyonunu, adaptörlü 23 µL DNA ve kit içerisindeki füzyon DNA polimerazın 25 µL'si ile hazırlayın.20 µM konsantrasyonunda 1 µL sole PCR bir ve 20 µM konsantrasyonunda 1 µL sole PCR iki ekleyin. PCR reaksiyonunu yazılı protokolde açıklandığı şekilde yürütün. PCR amplifikasyonunun ardından, DNA'yı Qiagen mini loop PCR saflaştırma kiti ile saflaştırın.15 µL tampon EB'yi 50 °C'ye kadar ön ısıtmaya tabi tutun; DNA'yı seyreltmek için 0.5 µL örneği bire dört oranında seyreltin ve amplifiye edilen ürünleri saflaştırmak için NanoDrop okuması gerçekleştirin. HPLC kalite su kullanarak 50 mL'lik %1,8 AGROS jel hazırlayın; AGROS eridikten sonra TAE ve bromür ekleyin. Ardından jeli dökün ve jeli yükleyin.Giriş ve IP örneklerine dört µL yükleme tamponu ekledikten sonra, jeli 120 voltta 45 dakika boyunca çalıştırın. Jel çalışması tamamlandıktan sonra analiz edin. Analiz sonucunda 150 ile 350 baz çifti aralığında fragmanların oluştuğu görülmelidir.Bunlar, uzunlukları 50 ile 250 baz çifti arasında olan genomik DNA fragmanlarını temsil eder. Ve bir adaptör, 150 ile 350 baz çifti aralığındaki materyali içeren jel bölgesini bir neşter ile kesip çıkarır. Yaklaşık 120 baz çiftinde seyreden adaptör adaptör bandının kesilmemesine dikkat edin.DNA'yı, üretici talimatlarına uygun olarak bir kayak hızlı jel ekstraksiyon kiti kullanarak geri kazanın. Örneği, ısı uygulamadan bir speed vac içerisinde tam olarak 11 µL kalana kadar kurutun. Örnekten 1 µL alın ve DNA konsantrasyonunu bir NanoDrop spektrofotometre kullanarak ölçün.Son olarak, zenginleşmiş gen ürünlerini Illumina genom analizörü kullanarak tanımlayın ve bağlanma bölgeleri ile hedef genleri yazılı protokolde açıklandığı şekilde analiz edin. Tanımlanan zenginleşmiş RB bağlayıcı protein iki veya RBP iki bağlanma bölgelerinin genomik koordinatları kromozom bazlı bir formatta sunulmuştur. Kromozomlardaki ensemble genlerin doluluk oranları siyah VAR'lar şeklinde görselleştirilebilir.Burada kromozom 10 dolulukları gösterilmektedir; RBP2 bağlanma bölgeleri dikey çizgiler olarak belirtilmiştir. Orta panel, kromozom 10 üzerindeki tüm RBP2 izoform bağlanma bölgelerini, alt panel ise RBP2 büyük izoform bağlanma bölgelerini göstermektedir. Bu bilgiler, kromozom 10 üzerindeki RBP2 izoformlarının örtüşen ve spesifik doluluklarına genel bir bakış sunar.Burada, rbp tarafından bağlanan genler arasında, yanlış keşif oranı veya FDR ile düzeltilmiş, anlamlı şekilde zenginleşmiş gen ontolojisi veya go moleküler fonksiyon kategorilerinin yer aldığı bir ısı haritası gösterilmektedir. Kırmızıya yakın iki renk yüksek istatistiksel anlamlılığı, sarı düşük istatistiksel anlamlılığı ve gri ise istatistiksel anlamlılığın olmadığını belirtmektedir.Zenginleştirme analizi, RBP2 hedef genlerinin örtüşen ve izoform spesifik moleküler fonksiyonlarını göstermektedir. Bu prosedür sırasında, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerinin nasıl tanımlanacağını size göstermiş olduk. Uygun boyut aralığında ve verimde DNA fragmanları üretmek önemlidir.Bu durum, SONİKASYON adımı sırasında kılavuzlarımızı takip ederek gerçekleştirilebilir. Hepsi bu kadar. Deneylerinizde başarılar dileriz ve izlediğiniz için teşekkür ederiz.

genome-wide-analysis-using-chip-to-identify-isoform-specific-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bizim Bayesian Değişim Noktası (BCP) algoritması Saklı Markov Modelleri ile modelleme değişim noktaları state-of-the-art gelişmeler üzerine inşa ve kromatin immünopresipitasyon sekans (ChIPseq) veri analizi uygular. BCP geniş ve noktasal hem de veri türleri iyi performans sergilediğini, ancak doğru diffüz histon zenginleştirme sağlam, tekrarlanabilir adalar belirlenmesinde öne çıkmaktadır.

Çeşitli ChIPseq Veri Türleri Genom çapında Analizi İçin Yeni Bir Bayesian değiştir nokta Algoritması

Bu videoda, proteine bağlı kromatin fragmanlarının seçici immünopresipitasyonu yoluyla oligodendrosit öncü hücrelerinin genomik DNA'sının belirli bölgelerindeki protein bağlanma bölgelerini tanımlamak için kromatin immünopresipitasyon tekniğini gösteriyoruz. Bu yöntem, gen regülasyonunda yer alan transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici proteinlerin etkileşimini incelemeye yardımcı olur.

Genomik DNA Üzerindeki Hedef Protein Bağlanma Bölgelerini Belirlemek için Kromatin İmmünopresipitasyonu

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

Bir protokol büyük ölçekli genotipleme gerçekleştirmek için Illumina'nın Infinium tahlilleri kullandığı açıklanmaktadır. Bu deneyler, güvenilir bir şekilde üç gün sonra tek tek DNA numunelerinin yüz üzerinde SNP milyonlarca genotip olabilir. Bir kere üretilen, bu genotipleri farklı hastalıklar veya fenotipleri çeşitli dernekler kontrol etmek için kullanılabilir.

Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili

Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

Belirli genomik bölgelerle ilişkili moleküllerin tanımlanması, bu bölgelerin fonksiyonlarının düzenlenme mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Bu protokol, belirli bir genomik bölge ile ilişkili proteinlerin ve RNA'ların tanımlanması için tasarlanmış DNA bağlayıcı molekül aracılı kromatin immünopresipitasyonu (enChIP) gerçekleştirme prosedürlerini açıklar.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS) tarafından tanımlanan kodlamayan varyantların işlevsel etkilerini üç boyutlu kromatin etkileşimleri kullanarak belirlemek için bir protokol sayılmiyoruz.

Kromatin Konfigürasyonunun Hesaplamalı Analizini Kullanarak Alzheimer Hastalığı Varyantlarının Hedef Genlerine Haritalanması

Bu makalede, ChIP sıvı işleyici platformu kullanılarak belirli bir histone modifikasyonu (H3K27ac) ile ilişkili DNA bölgelerinin yarı otomatik, mikro ölçekli ChIP-Seq protokolü ve ardından etiketleme kullanılarak kütüphane hazırlığı açıklanmaktadır. Prosedür, kalite ve nicelik amaçları için kontrol değerlendirmesini içerir ve diğer histone modifikasyonlarına veya transkripsiyon faktörlerine benimsenebilir.

Büyük Ölçekli Epigenetik Çalışmalar için Yarı Otomatik ChIP-Seq Prosedürü

Öğrenin KDM5A/RBP2 histon demetilazının genomik hedeflerini belirlemek için ChIP-Seq yöntemini. Bu teknik epigenetik düzenleme ve gen regülasyonu çalışmalarında araştırmacılara önemli bilgiler sunar.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Daha fazla video keşfet