Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, KDM beş, Jared bir, RBB iki histon demetilazın genomik hedeflerini belirlemektir. Bu, ikinci bir adım olarak uygun boyutta DNA parçaları üretmek için sonikasyon yapılan çapraz bağlı kromatinin hazırlanmasıyla elde edilir. RBB iki bağlı DNA fragmanı, RBB iki antikoru ile immüno-çökeltilir.

Daha sonra, geri kazanılan genomik DNA, dizileme için PCR ile amplifiye edilir. Son olarak, Illumina dizilenmiş kısa okumalar, insan genomuna benzersiz bir şekilde hizalanır ve önemli zirveler tanımlanır ve en yakın genlere açıklanır. Rbbb'yi tanımlamak için, iki zenginleştirilmiş Rbbb bölgesinin genom çapında tanımlanmasına dayanan Rrb B ile ilişkili moleküler fonksiyonları gösteren iki hedef gen sonucu elde edilir.

Merhaba, ben Mike. Chicago'daki Illinois Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Genetik Bölümü'nde Dr. Elizabeth Bencia'nın laboratuvarından. Ve ben de BARCEL Biyomedikal Araştırma Parkı Üniversitesi PO P fea'da Dr.NGA liderliğindeki Biyomedikal genomik laboratuvarındanım.

Ve ben Danielle Dal. Ve ben William Richter. İkimiz de Yardımseverlik Beceri Laboratuvarı'ndayız.

Bugün size kromatin, immünopresipitasyon ve dizileme için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda dermatoloğunun bağlanma bölgesini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu işleme başlamak için, sekizinci hücrelere yaklaşık 10 tane büyütün. Her immünopresipitasyon veya ip için. Burada, diffüz osteolitik lenfoma.

U9 37 hücreleri, formaldehit çözeltisinde hücre büyümesini takiben 96 saat boyunca TPA ile monositik farklılaşma için kullanılır ve indüklenir, doğrudan% 1'lik bir nihai konsantrasyona kadar% 1'lik bir son konsantrasyona kadar şişeyi kısa bir süre döndürün ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Daha sonra ortamı aspire edin ve hücreleri 15 mililitre buz gibi soğuk PBS ile durulayın. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın.

Daha sonra, buz üzerindeki şişelerin her birine bir tane olmak üzere altı mililitre lizis tamponu ekleyin. Daha sonra şişeleri dört santigrat derecede 20 dakika sallayın. Son olarak, hücreleri bir hücre sıyırıcı kullanarak toplayın ve bunları 15 mililitrelik konik tüplere aktarın.

Bu noktada, hücreler eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Hücreler donmuşsa, onları dışarı atın. Çözüldükten sonra, hücreleri döndürün ve tırnağı atın.

Daha sonra hücreleri altı mililitre lizis tamponu ikide yeniden süspanse edin, tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe sallayın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve hücreleri 2.5 mililitre lizis tamponu üçte yeniden süspanse edin. Daha sonra, süspansiyonu, bir Branson 450 sonier'in mikro ucu% 50 ile% 60 genlik arasında ayarlanmış bir buzlu su kabına yerleştirerek sonikasyon için hazırlayın.

32. sabit patlama için çözeltiyi sonikleştirin ve buz üzerinde soğutun. Bir dakika boyunca bu darbeleri 10 ila 15 kez tekrarlayın, ardından tüpün içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyin ve yeni bir tüpe aktarın. Çözeltiyi nabız atmaya ve soğutmaya devam edin.

Sonikasyonu takiben beş kez daha,% 10 Triton X 100'ü çözelti hacminin 10'da birine ekleyin. Daha sonra lizatları 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve kalıntıları kromatin, immünopresipitasyon veya çipten önce bir mikro santrifüjde döndürün. Giriş numunesi olarak 50 mikrolitre hücre lizatından tasarruf edin.

Daha sonra, temizlenmiş hücre lizatını, yazılı protokolde tarif edildiği gibi daha önce hazırlanmış olan antikora bağlı dyna boncukları ile birleştirdi. 50 mikrolitrelik giriş örneğine ek olarak karışımı, gece boyunca dört santigrat derecede sallayın. Boncukları bir mililitre yıkama tamponu ile yıkayın.

Ardından boncukları toplamak ve süpernatanı çıkarmak için manyetik bir stand kullanın. Bu yıkamayı altı ila sekiz kez tekrarlayın. Bir mililitre TE artı 50 milimolar sodyum klorür ile son bir yıkama yapın.

Santrifüjlemeyi takiben boncukları bir mikro santrifüjde döndürün, kalan TE tamponunu aspire edin. Daha sonra numunelere 100 mikrolitre elu tamponu ekleyin. Hemen sonra.

Numuneleri 65 santigrat derecede 10 ila 15 dakika inkübe edin. Boncukları askıda tutmak için tüpleri her iki dakikada bir 1,5 mililitrelik bir tüp rafına çizin. Santrifüjleme ve manyetik stand kullanarak boncukları toplayın ve SNAT'ı bir PCR tüpüne aktarın.

Ardından önceden kaydedilmiş giriş örneğini alın ve üç hacim elüsyon tamponu ekleyin. Son olarak, IP'yi yerleştirin ve s'yi yerleştirinampleleri gece boyunca 65 santigrat derecede termal döngüleyiciye yerleştirin. Ertesi gün çapraz bağları tersine çevirmek için, numunelere bir hacim TE tamponu ekleyin.

Daha sonra, mikrolitre başına 0.2 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona RNA'lar A ekleyin. Numuneleri termal döngüleyicide 37 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, mikrolitre başına 0.2 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona proteinaz K ekleyin.

Daha sonra numuneleri termal döngüleyicide 55 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Daha sonra, numuneleri bir hacim fenol ile bir kez çıkarın. Numuneleri bir hacim fenil kloroform izoamil alkol ile ikinci kez ekstrakte edin.

Son olarak, numuneleri bir hacim kloroform izoamil alkol ile bir kez daha çıkarın. Daha sonra her numuneye 30 mikrogram glikojen ekleyin. Ayrıca, numunelere 0.2 molar nihai konsantrasyona sodyum klorür ve iki hacim etanol ekleyin.

Onları eksi 80 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, numuneleri döndürün ve snat'ı boşaltın. Peletleri 500 mikrolitre %75 etanol ile yıkayın, ardından kurutun ve 40 mikrolitre suda tekrar süspanse edin.

SONICATION prosedürü tarafından üretilen DNA fragmanlarının boyutlarını kontrol etmek için, saflaştırılmış giriş örneğinin beş mikrogramını% 1.8'lik bir agro jel içine yükleyin ve jeli çalıştırın. Sonikasyon prosedürü 150 ila 350 baz çifti aralığında parçalar üretmelidir. Bununla birlikte, fragmanlar bu aralığa düşmezse, sonikasyon prosedürü, genomik DNA'nın amplifikasyonundan önce patlama sayısını ve genliği değiştirerek ayarlanmalıdır.

Yazılı protokolde açıklandığı gibi numunelerin boyutunu, konsantrasyonunu ve zenginleştirmesini kontrol edin. Genomik DNA'nın amplifikasyonuna başlamak için, 34 mikrolitre IP örneği ve 200 nanogram giriş örneği elde edin. Yazılı protokolde açıklandığı gibi bir Illumina genomik DNA örneği hazırlama kiti kullanarak DNA parçalarına adaptörlerin eklenmesini ve bağlanmasını gerçekleştirin ve onarın.

Bir mini lut PCR saflaştırma kiti kullanarak DNA'yı saflaştırın ve ardından 50 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış tampon EB içinde elüte edin. IP ve giriş DNA örnekleri için sırasıyla 23 mikrolitre ve 46 mikrolitre kullanın. Kitten 25 mikrolitre füzyon, DNA polimeraz adaptörleri ile 23 mikrolitre DNA kullanarak PCR reaksiyonunu yapın.

Bir mikrolitre 20 mikromolar taban PCR bir ve bir mikrolitre 20 mikromolar. Bu nedenle PCR iki, PCR amplifikasyonunu takiben yazılı protokolde açıklandığı gibi PCR reaksiyonunu çalıştırır. Qiagen mini loop PCR saflaştırma kiti ile DNA'yı saflaştırın.

15 mikrolitre tampon EB'yi 50 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın ve DNA'yı seyreltin, numunenin 0,5 mikrolitresini bir ila dört kez seyreltin ve amplifiye edilmiş ürünleri saflaştırmak için bir NanoDrop okuması yapın. HPLC sınıfı su kullanarak 50 mililitrelik %1,8'lik bir AGROS jeli hazırlayın, agros eridikten sonra içine TAE ekleyin ve bromür ekleyin. Sonra jeli dökün, jeli yükleyin.

Giriş ve IP örneklerine dört mikrolitre yükleme tamponu ekledikten sonra, jeli 45 dakika boyunca 120 voltta çalıştırın. Jeli çalıştırdıktan sonra analiz edin. 150 ile 350 baz çifti arasındaki fragmanların üretildiğini ortaya çıkarmalıdır.

Uzunlukları 50 ila 250 baz çifti arasında olan genomik DNA parçalarını temsil ederler. Ve bir adaptör, 150 ila 350 baz çifti aralığındaki malzemeyi içeren jel bölgesini bir neşter ile çıkarır. Yaklaşık 120 baz çiftinde çalışan adaptör adaptör bandını çıkarmamaya dikkat edin.

Üreticinin talimatlarına göre bir kayık hızlı jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı kurtarın. Numuneyi ısı olmadan geri dönülmüş bir hızda tam olarak 11 mikrolitreye kadar kurutun. Numuneden bir mikrolitre çıkarın ve bir NanoDrop spektrofotometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.

Son olarak, Illumina genom analizörünü kullanarak zenginleştirilmiş gen ürünlerini tanımlayın ve yazılı protokolde açıklandığı gibi bağlanma bölgelerini ve hedef genleri analiz edin. Tanımlanmış zenginleştirilmiş RB bağlayıcı protein iki veya RBP iki bağlanma bölgesinin genomik koordinatları, kromozom bazında bir formatta sunulur. Kromozomlardaki topluluk genlerinin dolulukları siyah VAR'lar olarak görselleştirilebilir.

Burada kromozom 10 dolulukları rbp iki bağlanma bölgesi dikey çizgiler olarak gösterilmiştir. Orta panel, kromozom 10 üzerindeki tüm rbp iki izoform bağlanma bölgesini gösterir ve alt panel, rbp iki büyük izoform bağlanma bölgesini gösterir. Bu bilgi, kromozom 10 üzerindeki RBP iki izoformunun örtüşen ve spesifik doluluğuna genel bir bakış sunar.

Burada, rbp ile bağlanan genler arasında yanlış keşif oranı veya FDR düzeltilmiş, önemli ölçüde zenginleştirilmiş gen ontolojisi veya go moleküler fonksiyon kategorileri ile bir ısı haritası gösterilir. Kırmızıya doğru iki renk, yüksek istatistiksel anlamlılığı gösterir. Sarı, istatistiksel anlamlılığın düşük olduğunu ve gri, istatistiksel anlamlılık olmadığını gösterir.

Zenginleştirme analizi, R BP iki hedef geninin örtüşen ve izoform spesifik moleküler fonksiyonlarını gösterir. Bu prosedür sırasında size transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerini nasıl tanımlayacağınızı az önce gösterdik. Uygun boyut aralığında ve verimde DNA parçaları üretmek önemlidir.

Bu, SONICATION adımı sırasında yönergelerimizi izleyerek elde edilebilir. İşte bu kadar. Deneylerinizde iyi şanslar ve izlediğiniz için teşekkürler.