Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin zebra balığının periton boşluğuna bir çözelti enjekte etmektir. Bu örnekte, laboratuvarımızda glikoz enjekte edeceğiz. Bu prosedürü kan glikoz stazını incelemek için kullanıyoruz.

Bu işlem, öncelikle vücut ağırlığının gramı başına ne kadar solüsyon enjekte edileceğini belirlemek için balığın tartılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, balığın soğuk su ile anestezi altına alınmasıdır. Prosedürün üçüncü adımı ise balığın mikroskop tablasına transfer edilmesi ve enjeksiyonun yapılmasıdır.

Prosedürün son adımı, balığı toparlanması için tankına geri döndürmektir. Nihayetinde, kan glikoz seviyelerinin ölçümü yoluyla glikoz homeostazındaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben University of Chicago'daki Organizma Biyolojisi ve Anatomi Bölümü'nden Victoria Prince Laboratuvarı'ndan Mary Kinkle.

Ben de Prince Laboratuvarı'ndan Stephanie Ames. Bugün size yetişkin Zebrafish'lere intraperitonal enjeksiyon yapma prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü kan glikoz homeostazının düzenlenmesini incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Balıkları enjeksiyona hazırlamak için, öncelikle balıkları temiz bir tanka aktarın ve yem vermeyi kesin. Bağırsak ampul içeriğinin boşalması için balıkları 24 saat, kan glukoz seviyelerini bazal düzeylere indirmek için ise 72 saat aç bırakın.

Bu protokolde kullanılan yoğunluk, üç kat mermer bulunan dokuz litrelik tank başına 10 ila 12 karışık cinsiyetli popülasyondur. Mermerler, yumurtaların yenmemesi için onları hapseder. Tankı sifonlama yoluyla yumurtaları ve atıkları her gün temizleyin.

Ardından, 124,1 millimolar sodyum klorür, 5,1 millimolar potasyum klorür, 2,9 millimolar sodyum pirofosfat, 1,9 millimolar magnezyum sülfat heptahidrat, 1,4 millimolar kalsiyum klorür dihidrat, 11,9 millimolar sodyum bikarbonat, dört gram polivinil pirrolidon ve 1000 USP ünite heparin kullanarak, deiyonize su ile son hacmi 100 mililitre olacak şekilde Cortland tuz çözeltisini hazırlayın; filtreleyin, sterilize edin ve dört derece Celsius'ta saklayın. Sonra, beş gram glukozu 10 mililitre Cortland tuz çözeltisinde çözün. 0,5 miligram/µL glukoz çözeltisi hazırlamak için filtreleyin, sterilize edin ve dört derece Celsius'ta saklayın.

Ardından, yumuşak bir süngeri düz yüzeyinden yaklaşık 20 milimetre yüksekliğe gelecek şekilde keserek cerrahi masayı hazırlayın. Enjeksiyon sırasında balığı tutmak için 10 ila 15 milimetre derinliğinde bir kesik yapın. Süngeri 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve süngerli Petri kabını bir P 200 pipet ucu kutusu kapağının içine yerleştirin.

Ardından, koruma amacıyla mikroskop tabanını plastik streç film ve kağıt havlu ile kaplayarak mikroskobu hazırlayın. Olası dökülmelere karşı, cerrahi masayı kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Cerrahi masaya bakarak ve süngere odaklanarak odağı önceden ayarlayın.

Balık cerrahi masa üzerindeyken daha sonra yapılacak odak ayarlarını en aza indirmek için parmağınızı süngerin üzerine koyun ve ona odaklanın. Ardından, 500 mililitrelik bir beherin yaklaşık üçte birini balık tesisi suyuyla doldurarak balığı tartın. Balığı, mümkün olduğunca az fazla suyla birlikte ağla behere aktarın ve ağırlığını kaydedin; tartılan her balığı etiketlenmiş şeffaf bir tanka aktarın.

Enjeksiyon hacmini ağırlığa göre hesaplayın. Bu örnekte, Cortland tuz çözeltisinde çözülmüş, vücut ağırlığının gramı başına 0,5 miligram glikoz içeren bir çözelti enjekte edeceğiz. Çözeltimiz mikrolitre başına 0,5 miligram olduğundan, hesaplama şu şekildedir: balık ağırlığı (gram) x 1 = enjekte edilecek hacim (mikrolitre); şırıngayı ve ilgili enjeksiyon ekipmanlarını hazırlayın.

Bu protokolde glikoz enjeksiyonu için 30 G eğimli çelik iğne, ultra mikro pompa, mikro dört işlemci ve 10 µL nano dolumlu mikro şırınga kullanılmaktadır; şırıngayı Cortland tuzlu çözeltisinde çözünmüş 0,5 mg/µL glikoz ile doldurun. Şırıngadaki tüm hava kabarcıklarının temizlenmesi önemlidir; şırıngayı ultra mikro pompaya monte edin ve mikro dört işlemci üzerindeki numaralı tuş takımını kullanarak ilk balık için enjeksiyon hacmini nanolitre cinsinden girerek programlayın. Son olarak, balık tesisi suyundan yapılmış yeterli miktarda buz küpünü ezerek buz anestezisini hazırlayın.

Bir buz kovası doldurmak için, cerrahi masayı 2,4 litrelik kauçuk gıda saklama kabı gibi daha büyük bir kaba yerleştirin. Dış kaba ve cerrahi masaya bir miktar ılık tesis suyu dökün. Yakınınızda yedek bir ılık tesis suyu tankı bulundurun.

Dış konteynere bir termometre takın. Anestezik dış konteyner ve cerrahi masayı mikroskobun yanına yerleştirin. Buz parçalarıyla dolu kovayı yakınınızda bulundurun.

Su sıcaklığı 17 °C olana kadar buz parçaları eklemeye başlayın. Bu adımda 17 °C'nin altına düşmeyin. Balıkları dış konteynere aktarmak için bir ağ kullanın.

17 °C veya biraz daha düşük sıcaklıklarda, balık genellikle göğüs yüzgeçlerini yatay olarak açar, ağzını açıp kapatır ve hızlı auriküler hareketler sergiler. Sıcaklığı birkaç dakika içinde 12 °C'ye düşürmek için kaba yavaşça buz parçaları ekleyin. Sıcaklık düştükçe balık daha yavaş yüzecek ve sonunda yüzmeyi bırakacaktır.

Sonunda solungaç hareketleri duracak ve kulak hareketleri yavaşlayacaktır. Balık, elle tutulmaya tepki vermediğinde enjeksiyona hazır demektir. Gerekli sıcaklığa ulaşıldığında, süngeri doyurmak için üzerine bastırın.

Parmaklarınızın balığı ısıtıp anesteziden uyandırmaması için onları soğuk suda yeterince tutun. Soğuk parmaklarla işlem yaparken, balığı nazikçe sünger haznesine aktarın. Balığı, karnı yukarıda ve solungaçları haznenin içinde olacak şekilde konumlandırın.

Cerrahi masayı hızlıca mikroskop tablasına aktarın. Hızlıca hareket ederek, iğnenin ucunun kranial yöne bakacak ve anüse olduğundan daha yakın bir şekilde pelvik kuşağa konumlanmasını sağlayın. İğneyi pelvik yüzgeçler arasındaki orta hatta yerleştirin.

İğnenin vücut duvarının derinliğine ulaştığını hissetebilmelisiniz. İğneyi yerleştirirken, vücut duvarının esnediğini hissedebilirsiniz. İğne karın boşluğuna girdiğinde, mikro işlemciyi kullanarak uygun hacmi enjekte edin.

Balık vücut ağırlığının gramı başına bir mikrolitre enjekte etmek için ayak pedalını kullanın; enjeksiyondan sonra iğneyi çıkarın ve balığı iyileşmesi için derhal sıcak su tankına geri transfer edin. Balığı tank suyuna sünger üzerinden bırakarak, iğneyi mikroskop altında kontrol edin. Zaman zaman bir pul yapışmış olabilir ve bu pul bir sonraki enjeksiyondan önce temizlenmelidir.

Uygun bir süre geçtikten sonra, alt analizlerinize geçiniz. Enjeksiyondan önce kan glukozunu bazal seviyeye düşürmek için 72 saatlik bir açlığın gerekli olduğu tespit edilmiştir. Bu şekilde, yeşil ile gösterilen enjeksiyon yapılmamış kontrol verileri, burada kırmızı ile gösterilen araç (vehicle) enjekte edilmiş kontrollere göre anlamlı düzeyde farklı olmayan kan glukoz değerleri sergilemektedir.

Buna karşın, mavi çizgi glukoz enjekte edilen balıkların kan glukoz değerlerini göstermekte ve dolaşımdaki glukozun yükseliş ve düşüşünü sergilemektedir. Zaman içerisinde, hem glukoz hem de araç (vehicle) enjekte edilen hayvanlar enjeksiyon prosedürü sırasında cerrahi anestezi altındayken, enjeksiyon yapılmayan kontroller cerrahi anestezi altında değildi. Yetişkin zebrafishlere nasıl intraperitoneal enjeksiyon yapılacağını göstermiş olduk.

Laboratuvarımızda, bir glikoz çözeltisinin IP enjeksiyonunu takiben çeşitli zaman noktalarındaki kan glikoz konsantrasyonu değişimlerini inceliyoruz. Bununla birlikte, size az önce gösterdiğimiz bu teknik, ilgilendiğiniz herhangi bir çözeltiyi enjekte etmek için de kullanılabilir. Bu prosedürü uygularken, balığı yavaşça anestezi altına almaya ve nazikçe tutmaya dikkat edin.

İşte tamamı. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.