Name: Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Öğrenin yetişkin zebra balığında intraperitoneal enjeksiyon yöntemini; soğuk su anestezisi ve mikroşırınga kullanarak glukoz homeostazı araştırmaları için uygulayın. Bu teknik metabolik süreçleri incelemekte değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Hibe 5-2007-97 (VEP), Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen hibe R01DK064973 (VEP), R01DK48494 (LHP), T32DK07074 (SCE destekleyen), K01DK083552 (MDK) ve Chicago Üniversitesi Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi için P60DK20595 tarafından. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIDDK veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Pre-enjeksiyon Hazırlıkları <ol><li> Enjeksiyon için en az 24 saat önce Hızlı balık. Bu bağırsak ampul (mide) içeriğini boşaltmak olacaktır. Temel açlık protokol temiz bir tank, kendi normal yoğunlukta balık transferi için, daha sonra gıda kesintisi. (Örneğin, kan şekeri çalışmaları için) daha sıkı şartlar gerektirir, uzun süreli açlık, Tartışma ek konuları bakın. </li><li> Cortland tuz solüsyonu (Perry ve ark, 1984) hazırlayın. Distile su ile 100 mL hacim için aşağıdaki çözülür: 725 mg NaCl (124.1 mM) 38 mg KCl (5.1 mM) 41 mg Na 2 HPO 4 (2.9 mM) 24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1.9 mM) 16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1.4 mM) 100 mg NaHCO 3 (11.9 mM) 4 g Polyvinylpyrrolidone (PVP) (% 4) 1.000 USP birimleri Heparin Filtre, sterilize ve 4 saklamak ° C </li><li> Mikroskop hazırlayın. <ul><li> Mikroskop tabanı dökülmeleri durumunda koruma için naylon ile örtün. </li><li> Plastik wrap üstüne bir kağıt havlu koyun. Cerrahi tablo kağıt havlu üstüne oturacak. </li><li> Ön ayarlamak cerrahi tablo görüntüleme ve sünger odaklanarak odağı. </li></ul> İpucu: sünger üstüne parmağınızı koyun ve odaklanın. Balık cerrahi masaya bir kez Bu odak ayarı ortadan kaldırmak veya en aza indirecektir. </li><li> Balık tartılır. <ul><li> , Yaklaşık 1 / 3 balık tesisi su ile dolu bir 500 ml beher doldurun. </li><li> Dara dengesi. </li><li> Net kullanarak balık toplayın. Net ve kısa bir süre kağıt havlu üzerinde net dabbing balık uzak aşırı su Wick. Balık behere aktarın. </li><li> Balık tartılır. </li><li> Temiz bir tank için balık aktarın. </li><li> Kendi etiketli tankına her tartılır balık aktarın. </li><li> Balık ağırlığına göre her bir balık için enjeksiyon hacmi hesaplayın. </li></ul></li><li> Şırınga ve enjeksiyon ekipmanı hazırlayın. Enjeksiyon için, 35G Eğimli çelik iğne ve 10 ul NanoFil mikroenjektör tavsiye ederiz. Üreticinin talimatları izleyerek NanoFil şırınga ve silflex tüp hazırlayın. Şırınga ve tüp herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için önemlidir. Şırınga ve tüp dolum sonra, pompa şırınga monte ve program ilk balık için enjeksiyon hacmi. </li><li> Cerrahi bir tablo hazırlayın. <ul><li> Yüksekliği yaklaşık 20 mm, böylece yumuşak bir sünger (# L800-Ge, Jaece Industries gibi) kesin. Düz yüz, 10-15 mm derinliğinde bir kesim olun. Bu kesim, enjeksiyon için balık tutacak çukur. </li><li> 60 mm Petri kabı içine sünger ayarlayın. </li><li> Petri kabı, uygun büyüklükte bir pipet ucu kutusu kapağının içine sünger ile ayarlayın. Kapak sünger sıcaklık korumaya yardımcı olmak için su tutmak için yeterli büyüklükte olması gerekiyor, ancak bu şekilde almak için yeteri kadar sığ olmalıdır. Biz 11,4 cm L x 7,7 cm G x 1,5 cm olan bir P200 uç kutusu kapağı D. </li></ul> (Petri kutusu kapağı sünger) birlikte monte Bu üç öğe, cerrahi tablo oluşturmaktadır. </li><li> Anestezik hazırlayın. <ul><li> Balık tesisi su ezilmiş buz küpleri kullanarak olun. </li></ul> İpucu: Tipik bir buz küpü tepsisi kullanarak, 10-12 balık uyutmak için 3 tepsi alacak. <ul><li> Temiz bir buz kovası ezilmiş buz doldurun. </li><li> Cerrahi tablo 2.4 litre Rubbermaid gıda saklama kabı gibi daha büyük bir kap içine koyun. </li><li> Tesisin su (sıcak) bazı dış kabı ve cerrahi tablo içine dökün. Ayrıca, sıcak tesisi su rezervi Yakın tutun. </li><li> Dış kabı içine bir termometre koyun. </li></ul></li></ol> 2. Anestezi, Enjeksiyon ve Kurtarma <ol><li> Anestezik dış kabı artı mikroskop bitişik cerrahi tablo yerleştirin. Yakındaki kova buz yongaları var. </li><li> Için su sıcaklığı 17 ° C buz yongaları ekleyerek getir. Önemli: Bu adım için 17 ° C altına gitmeyin. </li><li> Net dış kabı balık aktarmak için kullanın. </li><li> Yavaş yavaş, 12 ila sıcaklığı düşürmek için ° C, birkaç dakika boyunca. Konteyner buz yongaları eklemek </li><li> Monitör balık davranış: 17 ° C veya biraz daha düşük, balık, genellikle yatay pektoral yüzgeçler yaymak gasp ve hızlı operculum'un hareketleri var. Sıcaklığı düşer gibi, balık yüzme molası daha yavaş ve nihayet yüzebilir. Anestezi, cerrahi düzlemine yaklaştı olduğu gibi, nefes nefese duracak ve operculum'un hareketleri yavaş olacaktır. Ele alınması tepki vermezse ne zaman balık enjeksiyon için hazır. En çok balık, 12 ° C yeterlidir. Büyük balık, soğuk wa gerekebilirter. </li><li> Gerekli sıcaklık doyurmak için sünger (~ 12 ° C veya soğuk), basın ulaşılır. </li><li> Parmaklarınızı balık sıcak ve taşıma sırasında anestezi çıkarmak olacağını yeterince soğuk su tutun. </li><li> Soğuk parmakları ile hafifçe çukur sünger balık transferi. Çukur, karın ve solungaçları ile balık yerleştirin. </li><li> Mikroskop aşamasına cerrahi tablo hızla aktarın. </li><li> Hızlı çalışma, dikkatle pelvik yüzgeçler arasındaki orta hat içine iğne takın. İğne cranially işaret etmelidir ve anüs daha yakın pelvis eklenebilir. Iğne vücut duvarına derin hissetmek gerekir. Uygun hacim enjekte edilir ve iğneyi çıkartın. </li><li> Enjeksiyondan sonra, hemen geri balık transferi sıcak su (~ 28.5 ° C), tank su üzerine sünger balık serbest kurtarma için tankı. İpucu: balık yüzme hemen başlamazsa, solungaçları doğru yavaşça su dönen kurtarmak için yardımcı olur. </li><li> Iğne kontrol edin. Bazen bir ölçekte bağlı olabilir ve bir sonraki enjeksiyon önce çıkarılmalıdır. </li><li> Sonraki enjeksiyon için geri anestezi odasına su sıcaklığı 17 ° C sonraki balık tanıtmadan önce getirmek için, sıcak tesisi su kullanmayın. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, 0.5 mg / g glikoz veya araç intraperitoneal aşağıdaki Temsilcisi sonuçları . Balık enjeksiyon için 72 saat önceden içirildi. X-ekseni zamanı, enjeksiyon sonrası gösterir. Ortalama ± SEM.

<ol><li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+SF+%22Fish+Physiology+Volume+X%3A+Gills%2C+Part+B%3A+Ion+and+Water%22">Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water</a>. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).</li>
<li>Brown, L. A. Anesthesia and restraint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+LA+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).</li>
<li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li>
<li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li>
<li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).</li>
<li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwama%2C+GK+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Fishes%2C+Volume+3%3A+Analytical+Techniques%22">Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques</a>. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).</li>
<li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li>
<li>Stoskopf, M. K. Surgery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoskopf%2C+MK+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).</li>
</ol>

Intraperitoneal beş adımları içerir:, açlık, tartma,, enjeksiyon ve kurtarma anestezi. Her adım için en iyi uygulamaların başarıya ulaşmasını sağlamak olabilir vardır. Başarı, sağlıklı bir balık hasta yanı sıra iyi bir deneysel sonuç içerir. Oruç: 24-saatlik hızlı bağırsak ampul boşaltmak gerekir. Bu uygulama balık veteriner edebiyatı (örneğin, Brown 1993) alınmıştır. Ek açlık hususlar aşağıda tartışılmıştır. Uzun vadeli oruç: Biz bir 72 saatlik hızlı enjeksiyondan önce temel düzeyde kan şekeri azaltmak için gerekli olduğunu bulduk (Eames ve ark, 2010). Ayrıca glikoz çalışmalar için balık düzgün oruç tuttuklarını olduğundan emin olmak için gerekli olan çok sayıda prosedür olduğunu bulduk. (Alt kısmında hiçbir enkaz) temiz bir tank ile başlayın. Tanklar açıkça &#39;açlık&#39; olarak etiketlenmiş, çevrimdışı olmalıdır ve bir yerde coşkulu balık bakım personeli onları beslemek olmaz. Tankın dış çevre değerlendirin ve stres, kan şekeri (Chavin ve Young, 1970; Groff ve ark, 1999) yükseltmek için bilindiği gibi bozuklukları vurguladı olan balık önlemek için adımlar atması . Örneğin, bir radyo, her gün balık tankları tutuyordu bankta ameliyat edildi açlık deney vardı. Biz kan şekeri alışılmadık derecede yüksek olduğu ve balık titreşimler tarafından vurgulandı olduğu sonucuna varıldı bulundu. Başka bir stres aşırı kalabalık. Balık, iyi balık yetiştiriciliği uygulamaları ile uyumlu bir yoğunluk tutulmalıdır. Öneriler için, bkz. Brand ve ark . (2002) ve Westerfield (1995). Biz, 9 litrelik tank (3 kat mermerler bu hacim kaplıyor ile) 10-12 balık bir yoğunlukta balık açlık iyi sonuçlar oldu. Cinsiyetlerin ayrılması strese neden olabilir, bu yüzden hızlı sırasında seks karışık bir nüfusu korumak öneririz. Bu yumurta döşenebilir anlamına gelir ve yumurta yedikleri olmayacak böylece sekestre gerekir. Yumurta ayırmak için basit bir yolu, 2-3 kat mermer ile tank alt kapağı. Su kalitesi, yumurta ve atık kaldırma ve günlük yaklaşık% 10-15, tank suyu değiştirerek bakıma ihtiyacı vardır. Sifon, yumurta ve atık çıkarmak için iyi çalışır. Tartım: anestezi değil balık tartım, hassas tartım sağlamak için, beher içine net su transferi en aza indirmek için alınması olmalıdır. Net (balık), kağıt havlu, lekelenen ise, aşırı su çoğunluğu kaldırılmış olabilir ve ağırlığını doğru olarak ölçülebilir. Önce ağırlığında balık uyutmak için daha kolay olabilir, ama biz bir gün içinde iki kez balık anestezi olası etkileri test etmedim. Biz anestezi yapıldıktan sonra yeniden ağırlığında balık daha sonra file / blot yöntemi ile ilk balık ağırlığında bizim teknik test ve hafifçe kuru lekelenen. Ağırlık yöntemleri arasında anlamlı bir fark bulundu (P = 0,7927, t-testi). Ayrıca, biz bu file / (yok blot) düşülmektedir gibi sadece en kısa sürede beher balık transferi ile karşılaştırıldığında, blot yöntemi etkilenen kan şekeri olmadığını test etti. Biz iki transfer yöntemleri arasında kan glikoz düzeyi açısından anlamlı bir fark bulundu (P = 0,2241, t-testi). Anestezi: Kimyasal anestezi birçok çalışmalar için uygun olabilir. Burada birçok anesteziklerin (tricaine/MS-222 (Brown, 1993) dahil), kan şekeri yükseltmek için, alternatif olarak soğuk su anestezi göstermiştir. Daha önceki çalışmalarda, soğuk su kan şekeri (Eames ve ark, 2010) zebrafish yükseltmek değil yaptığı tespit ettik. Soğuk su anestezi için, sıcaklık yavaş yavaş azaltılmalıdır. Düşüş oranı, küçük balık büyük balık daha hızlı altında gidiyor, balığın büyüklüğüne bağlı görünüyor. Enjeksiyonu takiben, balık (aşağıya bakın) anestezi çok yavaş iyileşmekte olduğunu gözlemleyebiliriz. Başlangıç ​​sıcaklığı sıcaklığı çok hızlı bir şekilde azalmıştır çok düşük, ya da zaman zaman da yol açabilir. Başlangıç ​​sıcaklığı suya girdikten sonra eğer yanal balık virajlarda çok düşük. Başlangıç ​​sıcaklığı doğruysa, balık başlangıçta dengesini koruyacaktır. Pektoral yüzgeçler, yatay konumda döndürmek gasp ve hızlı operculum&#39;un hareketleri var. Genellikle, yüzmek. Sıcaklık düştükçe, hareketleri azalacak ve balık denge kaybedersiniz. Balık tepki olmadan işlenebilir bir cerrahi anestezi düzlemine ulaşılır. Cerrahi anestezi altında balık korumak için, parmaklarınızı, soğuk olabilir, bu yüzden balık işleme önce su tutmak gerekir. Sünger balık anestezi için kullanılan suyun aynı sıcaklıkta soğuk muhafaza edilmelidir. Sufficie su ile sünger doyurmak için önemlidir.balık üzerine konulduğunda anesteziyi idame ettirmek için ntly soğuk. Enjeksiyon: üstlenen enjeksiyonları öncesinde, vücut duvar kalınlığı bir anlamda almak için en az bir balık incelemek isteyebilirsiniz. Bu karın boşluğuna girmek için iğne eklemek için ne kadar ihtiyacı yargılamak için yardımcı olabilir. Ayrıca, iğneyi, iğne karın boşluğuna girdiğinde vücut duvarı &quot;vermek&quot; hissedebilirsiniz. Enjeksiyon sırasında, hasta mutlu etmek için adımlar atın. Sünger enjeksiyon sırasında canlandırılması balık önlemek için doğru sıcaklık soğuk su ile doymuş olduğundan emin olun. Iyi doymuş ve yumuşak bir sünger, ölçekler ve cildi kaplayan mukus zarar en aza indirmek için önemlidir. İyi doymuş sünger solungaçları gazlı tutmak için de önemlidir. Biz çok Malzemeleri altında aşağıda listelenmiştir köpük sünger tavsiye ederiz. Son olarak, bir kez balık anestezi, balık altında olduğu zaman en aza indirmek için hızlı çalışır. Kurtarma: balık hemen hemen sıcak bir tankın su girdikten sonra anestezi kurtarmak gerekir. Balık kurtarma hız solungaçları doğru girdap su yavaşça hemen yüzme başlamazsa. Eğer toparlanmanın yavaş, sonra balık çok çabuk altında gitti ve uygun anestezi prosedürü ayarlamanız gerekir. Anestezi altında yavaş toparlanma olası nedenleri tartışılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Köpük Sünger</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri kabı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet ucu kutusu kapağı</td><td></td><td></td><td>çok derin olmayan, örn. 1.5 cm</td></tr><tr><td>Plastik saklama kabı</td><td></td><td></td><td>derin, örn. 7 cm </td></tr><tr><td>Termometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kırılmış buz</td><td></td><td></td><td>tesis suyundan hazırlanmış</td></tr><tr><td>Ilık tesis suyu</td><td></td><td></td><td>1 liter veya daha fazla</td></tr><tr><td>500 ml beher</td><td></td><td></td><td>tartım için</td></tr><tr><td>NanoFil şırınga</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>veya Hamilton şırınga</td></tr><tr><td>35 gauge iğne</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF35BV-2</td><td>eğimli uçlu</td></tr><tr><td>Silflex tüp</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SILFLEX-2</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III ve Micro4 kontrol ünitesi</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMPS-1</td><td></td></tr><tr><td>Ayak pedalı</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15867</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streç film</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortland tuz çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Kimyasal zebrafish tedavi için uygun bir yöntem balık tarafından ele alınacak tank su, reaktif tanıtmak. Ancak, bu yöntem reaktif emilir veya balık başına ne kadar zor biliyor yapar. Metabolik çalışmalar özellikle de ilgili bazı deneysel sorular, ağırlığına göre her bir balık için belirli bir miktar sunarak daha iyi ele alınabilir. Burada yetişkin zebrafish içine intraperitoneal (IP) enjeksiyon için bir yöntem mevcut. Enjeksiyon, karın boşluğuna pelvis posterior. Bu prosedür, büyük balıklar için kullanılan veteriner yöntemler uyarlanmıştır. Biz sıfır mortalite gibi, güvenli. Ayrıca, 127 enjeksiyonlar sadece 5 enjeksiyon yerinde kanama, kanama ve bu vakaların her biri, kısa süreli, kalıcı birkaç saniye idi ve kan kaybı miktarı küçüktü. Bu yordamı ile Başarı, anestezi, enjeksiyon ve kurtarma ağırlığında, oruç da dahil olmak üzere birkaç adım ile balık nazik işleme gerektirir. Önlemler prosedür boyunca stresi en aza indirmek için gereklidir. Önlemler küçük bir enjeksiyon hacmi ve 35G iğne ile içerir. Biz Cortland tuz çözeltisi ozmotik tatlı su balıkları için dengeli bir araç olarak kullanırlar. Solungaçları Havalandırma, enjeksiyon sırasında suya doymuş bir sünger içinde bir çukur balık tutarak, yavaş operculum&#39;un hareketleri sağlayan bir cerrahi anestezi uçak, ilk balık getirerek enjeksiyon işlemi sırasında tutulur ve ikinci sırada yer alıyor. Biz, şekeri enjekte ve kan glikoz düzeyi yükselmeye ve normal bir sonraki geri izleme IP enjeksiyon yararını göstermektedir. Stres, teleost balık kan şekeri artırmak için ve Bilindiği gibi, araç-enjekte ve non-enjekte yetişkinlerde kan şekeri düzeylerini karşılaştırmak ve yordam kan şekeri önemli bir artışa neden olmadığını göstermektedir.

Biz yetişkin zebrafish intraperitoneal göstermektedir. Biz bir Micro4 denetleyicisi ve UltraMicroPump III tarafından kontrol edilen bir 10 ul NanoFil mikroenjektör kullanın. Bu gösteri, bir anestezik olarak soğuk su kullanımını içerir.

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

Zebrafishlerin kimyasal olarak işlem görmesi için kullanılan pratik bir yöntem, reaktifin balıklar tarafından emileceği tank suyuna eklenmesidir. Ancak, ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin zebra balığının periton boşluğuna bir solüsyon enjekte etmektir. Bu örnekte, laboratuvarımızda glikoz enjekte edeceğiz. Bu prosedürü kan glikoz stazını incelemek için kullanıyoruz.Bu işlem, öncelikle vücut ağırlığının gramı başına ne kadar solüsyon enjekte edileceğini belirlemek için balığın tartılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, balığın soğuk su ile anestezi altına alınmasıdır. Prosedürün üçüncü adımı ise balığın mikroskop tablasına aktarılması ve enjeksiyonun yapılmasıdır.Prosedürün son adımı, balığı iyileşmesi için akvaryumuna geri döndürmektir. Sonuç olarak, kan glukoz seviyelerinin ölçümü yoluyla glukoz homeostazındaki değişiklikleri gösteren veriler elde edilebilir. Merhaba, ben Chicago Üniversitesi Organizma Biyolojisi ve Anatomi Bölümü'ndeki Victoria Prince Laboratuvarı'ndan Mary Kinkle.Ben de Prince Lab'dan Stephanie Ames. Bugün size yetişkin Zebrafish'lere intraperitonal enjeksiyon uygulama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kan glikoz homeostazının düzenlenmesini incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Balıkları enjeksiyona hazırlamak için, öncelikle balıkları temiz bir tanka aktarın ve yem vermeyi kesin. Bağırsak bulb içeriğinin boşalması için balıkları 24 saat, kan glikoz seviyelerini bazal seviyelere düşürmek için ise 72 saat aç bırakın.Bu protokolde kullanılan yoğunluk, üç kat mermer içeren dokuz litrelik tank başına 10 ila 12 karışık cinsiyetteki popülasyondur. Mermerler, yumurtaların yenmemesi için onları hapseder. Yumurtaları ve atıkları tankı sifonlayarak günlük olarak temizleyin.Ardından, 124.1 millimolar sodyum klorür, 5.1 millimolar potasyum klorür, 2.9 millimolar sodyum pirofosfat, 1.9 millimolar magnezyum sülfat heptahidrat, 1.4 millimolar kalsiyum klorür dihidrat, 11.9 millimolar sodyum bikarbonat, dört gram polivinil pirrolidon ve 1000 USP ünite heparin içeren Cortland tuz çözeltisini deiyonize su ile 100 mililitre son hacme tamamlayarak hazırlayın; filtreleyin, sterilize edin ve dört degrees Celsius'ta saklayın. Sonra, beş gram glukozu 10 mililitre Cortland tuz çözeltisinde çözün. 0.5 milligrams per microliter glukoz çözeltisi elde etmek için filtreleyin, sterilize edin ve dört degrees Celsius'ta saklayın.Ardından, yumuşak bir süngeri düz yüzeyinden yaklaşık 20 milimetre yüksekliğinde kesecek şekilde cerrahi masayı hazırlayın. Balığı enjeksiyon sırasında tutabilmek için 10 ila 15 milimetre derinliğinde bir kesik oluşturun. Süngeri 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve süngerli Petri kabını bir P 200 pipet ucu kutusu kapağının içine yerleştirin.Ardından, mikroskop tabanını koruma amacıyla plastik streç film ve kağıt havlu ile kaplayarak mikroskobu hazırlayın. Olası dökülmelere karşı cerrahi masayı kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Cerrahi masaya bakarak ve süngere odaklanarak odaklamayı önceden ayarlayın.Balık cerrahi masaya yerleştirildiğinde odak ayarını minimuma indirmek için parmağınızı süngerin üzerine koyun ve ona odaklanın. Ardından, 500 millilitrelik bir beherin yaklaşık üçte birini balık tesisi suyuyla doldurarak balığı tartın. Ağ ile balığı, mümkün olduğunca az fazla suyla birlikte behere aktarın ve ağırlığı kaydedin; tartılan her balığı net bir şekilde etiketlenmiş bir tanka aktarın.Enjeksiyon hacmini ağırlığa göre hesaplayın. Bu örnekte, Cortland tuz çözeltisinde çözünmüş, vücut ağırlığı başına 0,5 miligram glikoz içeren bir çözelti enjekte edeceğiz. Çözeltimiz mikrolitre başına 0,5 miligram olduğundan, hesaplama şu şekildedir: balık ağırlığı (gram) çarpı bir eşittir enjekte edilecek hacim (mikrolitre); şırıngayı ve ilgili enjeksiyon ekipmanlarını hazırlayın.Bu protokolde glukoz enjeksiyonu için 30 5G eğimli çelik iğne, ultra mikro pompa, micro four işlemci ve 10 microliter nano fill mikro şırınga kullanılır; şırıngayı Cortland tuz çözeltisinde çözünmüş 0.5 milligrams per microliter glukoz ile doldurun. Şırıngadaki tüm hava kabarcıklarını temizlemek önemlidir; şırıngayı ultra mikro pompaya monte edin ve micro four işlemcideki numaralı tuş takımını kullanarak nanolitre cinsinden hacmi girerek ilk balık için enjeksiyon hacmini programlayın. Son olarak, balık tesisi suyundan yapılmış yeterli miktarda buz küpünü kırarak buz anestezisini hazırlayın.Bir buz kovasını doldurmak için, cerrahi masayı 2,4 litrelik kauçuk gıda saklama kabı gibi daha büyük bir kabın içine yerleştirin. Dış kaba ve cerrahi masaya bir miktar ılık şebeke suyu dökün. Yakınlarda ılık şebeke suyu içeren bir yedek tank bulundurun.Dış konteynere bir termometre takın. Anestetik dış konteyneri ve cerrahi masayı mikroskobun yanına yerleştirin. Buz parçalarıyla dolu kovayı yakında bulundurun.Su sıcaklığı 17 °C olana kadar buz parçaları eklemeye başlayın. Bu adım için 17 °C'nin altına düşmeyin. Balıkları dış kaba aktarmak için bir ağ kullanın.17 derece veya biraz daha düşük sıcaklıklarda, balık tipik olarak pektoral yüzgeçlerini yatay olarak açar, ağzını açıp kapatarak nefes almaya çalışır ve hızlı auriküler hareketler sergiler. Sıcaklığı birkaç dakika içinde 12 °C'ye düşürmek için kaba yavaşça buz parçaları ekleyin. Sıcaklık düştükçe, balık daha yavaş yüzmeye başlayacak ve sonunda yüzmeyi bırakacaktır.Sonunda solungaç hareketleri duracak ve kulakçık hareketleri yavaşlayacaktır. Balık, elle tutulmaya tepki vermediğinde enjeksiyon için hazır hale gelmiş olur. Gerekli sıcaklığa ulaşıldığında, süngeri doyurmak için üzerine bastırın.Parmaklarınızın balığı ısıtıp anestezi etkisinden çıkarmaması için soğuk suda yeterince beklettiğinizden emin olun. Soğuk parmaklarla işlem yaparken balığı nazikçe sünger teknesine aktarın. Balığı, karnı yukarıda ve solungaçları teknede olacak şekilde konumlandırın.Cerrahi masayı hızla mikroskop tablasına aktarın. Hızlı çalışarak, iğnenin ucunun kraniyal yöne bakacak ve anüsten ziyade pelvik kuşaka daha yakın olacak şekilde dikkatlice konumlandırın. İğneyi pelvik yüzgeçlerin arasındaki orta hatta yerleştirin.İğnenin vücut duvarının derinliğine ulaştığını hissedebilmelisiniz. İğneyi yerleştirirken, vücut duvarının esneyip yol verdiğini hissedebilirsiniz. İğne karın boşluğuna girdiğinde, mikroişlemci kullanarak uygun hacmi enjekte edin.Enjeksiyondan sonra, balık vücut ağırlığının gramı başına bir mikrolitre enjekte etmek için ayak pedalını kullanın; ardından iğneyi çıkarın ve balığı iyileşmesi için hemen sıcak su tankına geri aktarın. Balığı tank suyunun üzerindeki süngerden serbest bırakarak iğneyi mikroskop altında kontrol edin. Ara sıra bir pul yapışmış olabilir ve bu pul bir sonraki enjeksiyondan önce temizlenmelidir.Uygun bir süre geçtikten sonra, downstream analizlerinize geçiniz. Enjeksiyondan önce kan glikozunu bazal seviyeye düşürmek için 72 saatlik bir açlığın gerekli olduğunu saptadık. Bu şekilde, yeşil ile gösterilen enjeksiyon yapılmamış kontrol verileri, burada kırmızı ile gösterilen vehicle enjekte edilen kontrollerden önemli ölçüde farklı olmayan kan glikoz değerlerini sergilemektedir.Buna karşın, mavi çizgi glikoz enjekte edilen balıkların kan glikoz değerlerini göstermekte ve dolaşımdaki glikozun yükseliş ve düşüşünü sergilemektedir. Zaman içinde, hem glikoz enjekte edilen hem de araç (vehicle) enjekte edilen hayvanlar enjeksiyon prosedürü sırasında cerrahi anestezi altındayken, enjeksiyon yapılmayan kontroller cerrahi anestezi altında değildi. Yetişkin zebra balıklarına intraperitoneal enjeksiyonun nasıl yapılacağını göstermiş olduk.Laboratuvarımızda, bir glikoz çözeltisinin IP enjeksiyonunun ardından çeşitli zaman noktalarındaki kan glikoz konsantrasyonu değişimlerini inceliyoruz. Ancak, size az önce gösterdiğimiz bu teknik, ilgilendiğiniz çözeltiyi enjekte etmek için de kullanılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken balığı yavaşça anesteziye tabi tutmayı ve nazikçe tutmayı unutmayın.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon nasıl yapılacağını göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Bu videoda, yetişkin bir zebra balığının sırt kaslarına bileşikler vermek için kas içi enjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

İntramüsküler (IM) Enjeksiyon: Yetişkin Bir Zebra Balığının Dorsal Kasına Bileşik Uygulama

Bu videoda, Yetişkin Zebra Balığı'nın karın boşluğuna solüsyon iletmek için bir yöntem olan intraperitoneal enjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

İntraperitoneal Enjeksiyon: Yetişkin Bir Zebra Balığının Karın Boşluğuna Çözelti Verme Yöntemi

Bu videoda, intratorasik enjeksiyon kullanarak yetişkin zebra balığının kalbine bileşik verme tekniği açıklanmaktadır.

İntratorasik Enjeksiyon: Yetişkin Zebra Balığı Kalbine Bileşik Teslimat

Bu yöntem, Yetişkin zebrafisinin toraks içine 0.5 − 3 μL solüsyonun enjekte edilmesine dayanır. Prosedür verimli organ zarar vermeden zebra balığı kalbin yakınlığı içine protein ve kimyasal bileşikler sunar. Yaklaşım, kalp çeşitli dokularda eksojen faktörlerin etkilerini test etmek için uygundur.

Yetişkin zebrafish kalp çalışması için intratorasik enjeksiyon

Yetişkin zebra balıklarında yeni bir intraperitoneal (IP) enjeksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Doksorubisin gibi toksik bileşiklerle çalışırken, bu prosedür daha önce bildirilen iki IP yönteminden daha etkilidir. Teknik, zebra balığı modelinde sınırlı deneyime sahip araştırmacılar tarafından kolayca benimsenecek şekilde tasarlanmıştır.

Yetişkin Zebra Balıklarında Vücut Hasarını ve İlişkili Mortaliteyi En Aza İndiren Bir İntraperitoneal Enjeksiyon Tekniği

Burada, yetişkin zebra balıklarına hücrelerin veya farmakolojik ajanların intravenöz enjeksiyonu için optimize edilmiş ve etkili bir protokol sunuyoruz, bu da hücre aşılamasının artmasına ve tedavi edilen zebra balığının hayatta kalma oranlarının artmasına neden oluyor.

Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon

Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü James laboratuar tarafından dsRNA kadın dang virüs limanı A. aegypti sivrisinek, içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. , Enjeksiyon iğneleri kalibre, enjeksiyon kurulum manipüle ve toraks içine enjekte dsRNA tekniği gösterilmiştir.

Bayan A. aegypti Sivrisinek içine dsRNA enjeksiyon

Nöral tüp oluşumu sonra neuroepithelium daraltır ve tüp embriyonik beyin ventriküller oluşturmak için embriyonik beyin omurilik sıvısı (eCSF) ile doldurur katlanabilir. Biz daha iyi, canlı embriyo nöroepitelyal şekli aksine sıvı dolu boşluk görselleştirmek için bu ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi.

Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Bu protokol, yetişkin zebrafish organların tanımlanması ve diseksiyon için bir prosedür açıklanmıştır.

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Öğrenin yetişkin zebra balığında intraperitoneal enjeksiyon yöntemini; soğuk su anestezisi ve mikroşırınga kullanarak glukoz homeostazı araştırmaları için uygulayın. Bu teknik metabolik süreçleri incelemekte değerli bir araçtır.

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

Daha fazla video keşfet