Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin zebra balığının periton boşluğuna bir solüsyon enjekte etmektir. Bu örnekte, laboratuvarımızda glikoz enjekte edeceğiz. Bu prosedürü kan glikoz stazını incelemek için kullanıyoruz.

Bu işlem, öncelikle vücut ağırlığının gramı başına ne kadar solüsyon enjekte edileceğini belirlemek için balığın tartılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, balığın soğuk su ile anestezi altına alınmasıdır. Prosedürün üçüncü adımı ise balığın mikroskop tablasına aktarılması ve enjeksiyonun yapılmasıdır.

Prosedürün son adımı, balığı iyileşmesi için akvaryumuna geri döndürmektir. Sonuç olarak, kan glukoz seviyelerinin ölçümü yoluyla glukoz homeostazındaki değişiklikleri gösteren veriler elde edilebilir. Merhaba, ben Chicago Üniversitesi Organizma Biyolojisi ve Anatomi Bölümü'ndeki Victoria Prince Laboratuvarı'ndan Mary Kinkle.

Ben de Prince Lab'dan Stephanie Ames. Bugün size yetişkin Zebrafish'lere intraperitonal enjeksiyon uygulama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, kan glikoz homeostazının düzenlenmesini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Balıkları enjeksiyona hazırlamak için, öncelikle balıkları temiz bir tanka aktarın ve yem vermeyi kesin. Bağırsak bulb içeriğinin boşalması için balıkları 24 saat, kan glikoz seviyelerini bazal seviyelere düşürmek için ise 72 saat aç bırakın.

Bu protokolde kullanılan yoğunluk, üç kat mermer içeren dokuz litrelik tank başına 10 ila 12 karışık cinsiyetteki popülasyondur. Mermerler, yumurtaların yenmemesi için onları hapseder. Yumurtaları ve atıkları tankı sifonlayarak günlük olarak temizleyin.

Ardından, 124.1 millimolar sodyum klorür, 5.1 millimolar potasyum klorür, 2.9 millimolar sodyum pirofosfat, 1.9 millimolar magnezyum sülfat heptahidrat, 1.4 millimolar kalsiyum klorür dihidrat, 11.9 millimolar sodyum bikarbonat, dört gram polivinil pirrolidon ve 1000 USP ünite heparin içeren Cortland tuz çözeltisini deiyonize su ile 100 mililitre son hacme tamamlayarak hazırlayın; filtreleyin, sterilize edin ve dört degrees Celsius'ta saklayın. Sonra, beş gram glukozu 10 mililitre Cortland tuz çözeltisinde çözün. 0.5 milligrams per microliter glukoz çözeltisi elde etmek için filtreleyin, sterilize edin ve dört degrees Celsius'ta saklayın.

Ardından, yumuşak bir süngeri düz yüzeyinden yaklaşık 20 milimetre yüksekliğinde kesecek şekilde cerrahi masayı hazırlayın. Balığı enjeksiyon sırasında tutabilmek için 10 ila 15 milimetre derinliğinde bir kesik oluşturun. Süngeri 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve süngerli Petri kabını bir P 200 pipet ucu kutusu kapağının içine yerleştirin.

Ardından, mikroskop tabanını koruma amacıyla plastik streç film ve kağıt havlu ile kaplayarak mikroskobu hazırlayın. Olası dökülmelere karşı cerrahi masayı kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Cerrahi masaya bakarak ve süngere odaklanarak odaklamayı önceden ayarlayın.

Balık cerrahi masaya yerleştirildiğinde odak ayarını minimuma indirmek için parmağınızı süngerin üzerine koyun ve ona odaklanın. Ardından, 500 millilitrelik bir beherin yaklaşık üçte birini balık tesisi suyuyla doldurarak balığı tartın. Ağ ile balığı, mümkün olduğunca az fazla suyla birlikte behere aktarın ve ağırlığı kaydedin; tartılan her balığı net bir şekilde etiketlenmiş bir tanka aktarın.

Enjeksiyon hacmini ağırlığa göre hesaplayın. Bu örnekte, Cortland tuz çözeltisinde çözünmüş, vücut ağırlığı başına 0,5 miligram glikoz içeren bir çözelti enjekte edeceğiz. Çözeltimiz mikrolitre başına 0,5 miligram olduğundan, hesaplama şu şekildedir: balık ağırlığı (gram) çarpı bir eşittir enjekte edilecek hacim (mikrolitre); şırıngayı ve ilgili enjeksiyon ekipmanlarını hazırlayın.

Bu protokolde glukoz enjeksiyonu için 30 5G eğimli çelik iğne, ultra mikro pompa, micro four işlemci ve 10 microliter nano fill mikro şırınga kullanılır; şırıngayı Cortland tuz çözeltisinde çözünmüş 0.5 milligrams per microliter glukoz ile doldurun. Şırıngadaki tüm hava kabarcıklarını temizlemek önemlidir; şırıngayı ultra mikro pompaya monte edin ve micro four işlemcideki numaralı tuş takımını kullanarak nanolitre cinsinden hacmi girerek ilk balık için enjeksiyon hacmini programlayın. Son olarak, balık tesisi suyundan yapılmış yeterli miktarda buz küpünü kırarak buz anestezisini hazırlayın.

Bir buz kovasını doldurmak için, cerrahi masayı 2,4 litrelik kauçuk gıda saklama kabı gibi daha büyük bir kabın içine yerleştirin. Dış kaba ve cerrahi masaya bir miktar ılık şebeke suyu dökün. Yakınlarda ılık şebeke suyu içeren bir yedek tank bulundurun.

Dış konteynere bir termometre takın. Anestetik dış konteyneri ve cerrahi masayı mikroskobun yanına yerleştirin. Buz parçalarıyla dolu kovayı yakında bulundurun.

Su sıcaklığı 17 °C olana kadar buz parçaları eklemeye başlayın. Bu adım için 17 °C'nin altına düşmeyin. Balıkları dış kaba aktarmak için bir ağ kullanın.

17 derece veya biraz daha düşük sıcaklıklarda, balık tipik olarak pektoral yüzgeçlerini yatay olarak açar, ağzını açıp kapatarak nefes almaya çalışır ve hızlı auriküler hareketler sergiler. Sıcaklığı birkaç dakika içinde 12 °C'ye düşürmek için kaba yavaşça buz parçaları ekleyin. Sıcaklık düştükçe, balık daha yavaş yüzmeye başlayacak ve sonunda yüzmeyi bırakacaktır.

Sonunda solungaç hareketleri duracak ve kulakçık hareketleri yavaşlayacaktır. Balık, elle tutulmaya tepki vermediğinde enjeksiyon için hazır hale gelmiş olur. Gerekli sıcaklığa ulaşıldığında, süngeri doyurmak için üzerine bastırın.

Parmaklarınızın balığı ısıtıp anestezi etkisinden çıkarmaması için soğuk suda yeterince beklettiğinizden emin olun. Soğuk parmaklarla işlem yaparken balığı nazikçe sünger teknesine aktarın. Balığı, karnı yukarıda ve solungaçları teknede olacak şekilde konumlandırın.

Cerrahi masayı hızla mikroskop tablasına aktarın. Hızlı çalışarak, iğnenin ucunun kraniyal yöne bakacak ve anüsten ziyade pelvik kuşaka daha yakın olacak şekilde dikkatlice konumlandırın. İğneyi pelvik yüzgeçlerin arasındaki orta hatta yerleştirin.

İğnenin vücut duvarının derinliğine ulaştığını hissedebilmelisiniz. İğneyi yerleştirirken, vücut duvarının esneyip yol verdiğini hissedebilirsiniz. İğne karın boşluğuna girdiğinde, mikroişlemci kullanarak uygun hacmi enjekte edin.

Enjeksiyondan sonra, balık vücut ağırlığının gramı başına bir mikrolitre enjekte etmek için ayak pedalını kullanın; ardından iğneyi çıkarın ve balığı iyileşmesi için hemen sıcak su tankına geri aktarın. Balığı tank suyunun üzerindeki süngerden serbest bırakarak iğneyi mikroskop altında kontrol edin. Ara sıra bir pul yapışmış olabilir ve bu pul bir sonraki enjeksiyondan önce temizlenmelidir.

Uygun bir süre geçtikten sonra, downstream analizlerinize geçiniz. Enjeksiyondan önce kan glikozunu bazal seviyeye düşürmek için 72 saatlik bir açlığın gerekli olduğunu saptadık. Bu şekilde, yeşil ile gösterilen enjeksiyon yapılmamış kontrol verileri, burada kırmızı ile gösterilen vehicle enjekte edilen kontrollerden önemli ölçüde farklı olmayan kan glikoz değerlerini sergilemektedir.

Buna karşın, mavi çizgi glikoz enjekte edilen balıkların kan glikoz değerlerini göstermekte ve dolaşımdaki glikozun yükseliş ve düşüşünü sergilemektedir. Zaman içinde, hem glikoz enjekte edilen hem de araç (vehicle) enjekte edilen hayvanlar enjeksiyon prosedürü sırasında cerrahi anestezi altındayken, enjeksiyon yapılmayan kontroller cerrahi anestezi altında değildi. Yetişkin zebra balıklarına intraperitoneal enjeksiyonun nasıl yapılacağını göstermiş olduk.

Laboratuvarımızda, bir glikoz çözeltisinin IP enjeksiyonunun ardından çeşitli zaman noktalarındaki kan glikoz konsantrasyonu değişimlerini inceliyoruz. Ancak, size az önce gösterdiğimiz bu teknik, ilgilendiğiniz çözeltiyi enjekte etmek için de kullanılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken balığı yavaşça anesteziye tabi tutmayı ve nazikçe tutmayı unutmayın.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.