Name: Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin, canlı makrofaj hücrelerinde Neu1 sialidaz aktivitesini floresan mikroskopi ile nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, TLR reseptör etkileşimlerini ve iltihaplı hastalıklardaki hücresel yanıtları gerçek zamanlı izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MRS hibe Kısmi destek Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, Nöroloji Araştırma, ARC Harry Botterell Vakfı ve Garfield Kara Kardiyovasküler Araştırma ve Geliştirme Fonu. SRA Kraliçe Üniversitesi Araştırma Ödülü ve Robert J. Wilson Bursu bir alıcı. PJ Kraliçe Lisansüstü Ödülü ve Robert J. Wilson Bursu, bir alıcı. AG ve SA Kraliçe Lisansüstü Ödülü alıcıları. SF Bilim ve Teknoloji (OGSST) Ontario Yüksek Lisans Bursu layık görüldü. AG Kraliçe Franklin Bracken Lisansüstü Bursu almıştır. SA Kraliçe RS McLaughlin Yüksek Lisans Bursu almıştır.

1. Dondurulmuş Makrofaj Hücreler kurtarılıyor <ol><li> -80 Donmuş hücreleri diriltmeyi önce ° C derin dondurucu, bir ihtiyacı% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mg / plasmocin ml ile desteklenmiş filtrelenmiş steril Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile kültür ortamı hazırlamak için. Plasmocin araştırma hücre kültürlerinin mycoplasma kirlenme ortadan kaldırmak ve önlemek için kullanılan bir antibiyotik çözümdür. </li><li> Donmuş hücreleri bir flakon için, bir 4 ml, 1 ml steril bir biyolojik tehlike altına kaput 25 cm 2 hücre kültürü şişesi kültürlü ortamın ekler. </li><li> -80 ° C derin dondurucu donmuş hücreleri flakon alındığında, çabuk, yaklaşık 2-3 dakika sürer steril davlumbaz, el ısınmanın çözdürülen. </li><li> Hücreleri kısa sürede çözülmüş gibi, onlar hızlı bir 1ml steril pipet kullanarak klimalı ortamda içeren balona aktarılır. </li><li> Bir doku kültürü inkübatör 37 ° C ve% 5 CO 2 içeren hücreler balon yerleştirilir. </li><li> Ters bir mikroskop kullanarak% 75 -% 90 konfluent olana kadar hücreleri günlük bazda büyüme ve bağlılık için kontrol edilmelidir. </li><li> Alkol hücre kültürü inkübasyon sırasında, 12 mm yuvarlak cam slaytlar, onları kapsayan biyolojik tehlike altına kabine 1 saat boyunca büyük bir cam petri% 70 etanol ile sterilize edilir, daha sonra kaldırıldı ve reusage için saklanan ve ıslak cam tarafı 24 saat veya kuru kadar, bir UV altında kabin içinde steril-filtreli hava akış maruz bırakılmıştır. </li></ol> 2. Sialidase Testi Kaplama Hücreler <ol><li> Hücreleri kaplama önce, tek bir steril yuvarlak cam slayt dikkatle paslanmaz çelik forsepsle, tırtıklı, &quot;4, steril bir alev tam kavisli kullanarak iyi bir BD Falcon 24-iyi kapaklı düz alt doku kültürü tedavi polistiren plaka yerleştirilir % 75 birleştiği noktada yer hücrelerinin bir şişesi için, genellikle kültür plaka 12 kuyu kullanır. </li><li> Yapışık makrofaj hücreleri için, DMEM klimalı ortamda, steril çevreleme kabin içinde 5 ml steril pipet kullanarak şişeden çıkarılır. Serum içeren herhangi bir ortamda çıkarın ve hücrelerin karşılamak için yeterli pH 7.4 &#39;de tamponlu tuz, kalsiyum-orta ücretsiz (CMF) fosfat 1 ml serum fizyolojik pH 7.4 tamponlu 1x steril Tris yapışık hücreler bir kez yıkayın. Hücrelerin balonuna kaldırın başlayana kadar hücreleri yaklaşık 10 dakika veya 37 ° C inkübatör yerleştirilir. Balon hafifçe sarsan veya kalan yapışık hücrelere gevşetmek için sarsılmış olabilir. </li><li> Balonuna asılı hücreleri 1 mL, 3 mL DMEM klimalı ortamda ekleyin. 0.5 mL askıya alınan hücrelerin alın ve onları sterilely 12 mm yuvarlak cam slaytlar içeren doku kültür plaka transfer. Yaklaşık 0.5 x 10 6 hücre yuvarlak cam slaytlara aktarılır. </li><li> Doku kültürü plakası içeren hücrelerin 37 inkübe ° C&#39;de% 5 CO 2 hücreleri yuvarlak cam slaytlar uymak için izin vermek için 24 saat. </li></ol> 3. Sialidase Testi 1. Denetim <ol><li> Çevreleme dolap ya da laboratuvar tezgah ve sırayla aşağıdaki bileşikler karıştırarak ekleyin: (1 sonunda, 1slide, 25 x 75 x 1 mm buzlu): Bir mikroskop lamı yerleştirin 4-MUNANA mcL DAKO 1 + 1 mcL ve son olarak + Tris, 3 mcL tamponlu salin pH 7.4 (TBS). </li><li> Hücreleri içeren bir medya çıkardıktan sonra, iyi köşesine 4 &quot;forsepsle ile dairesel cam slayt hafifçe kaldırın. Dikkatlice forsepsle cam slayt kaldırmak ve karışım çözümü üzerine bakan hücreleri ile slayt mikroskop lamı. </li><li> Derhal, UV filtresi ve floresan görüntü yakalamak için bir dijital kameraya sahip olan bir epi-floresan mikroskopi microcope slayt alır. </li><li> , Sonra floresan modunda geçmek hücrelere kadar, faz kontrast altında mikroskop odaklanın. 1 dakika, 2 dakika, 3 dakika floresan altında hücrelerin fotoğraflar çekin. Faz kontrast altındaki hücreleri tek bir fotoğraf çekin. </li></ol> 2. Pozitif test yapma <ol><li> 4-MUNANA 1 mcL DAKO + 1 mcL LPS + 2 mcL + 1 mcL TBS: başka bir mikroskop lamı üzerine sırayla aşağıdaki bileşikler Nokta. </li><li> Yukarıdaki adımları 3.1.2 3.1.4 tekrarlayın. </li></ol> 3. Nöraminidaz inhibitörü Tamiflu ile birlikte Pozitif test yapma <ol><li> Başka bir mikroskop lamı üzerine aşağıdaki sırayla aşağıdaki bileşikler Nokta: 4-MUNANA 1μL DAKO + 1μL + LPS 2 mcL + Tamiflu 1 mcL. </li><li> Dairesel cam slayt canlı hücreler ile temas halinde bileşiklerin nihai konsantrasyonu 5 seyreltme faktörü olacaktır; Tamiflu konsantrasyonları 1x Tris tamponlu salin pH 7.4 önceden hazırlanmış.. </li><li> Yukarıdaki adımları 3.1.2 3.1.4 tekrarlayın. </li></ol> 4. İnhibitörü Konsantrasyon belirlenmesi Sialidase Faaliyet% 50 (IC 50) Engelleme için gerekli <ol><li> Hücreleri çevreleyen floresan ölçmek için, görüntüleri RBG ölçmek için analiz eklentisi ile ImageJ 1.38x kullanılarak analiz edilmektedir. Hücreleri çevreleyen floresan rasgele 50 spot okuma alın ve toplam floresan ortalama hesaplamak. </li><li> IC 50, doğrusal olmayan regresyon kullanarak y ekseni üzerinde x-ekseni üzerinde ortalama floresan karşı (örneğin, log ng / ml), günlük birimleri olarak dönüştürülür inhibitör konsantrasyon bir komplo oluşturulur. </li></ol> 5. Başarı sırları <ol><li> Kültür hücreleri mycoplasma gelen kirlenme olduğundan emin olun. Biz bunun için rutin kontrol etmek için bir kültür ortamında Plasmocin kullanabilirsiniz. </li><li> Yapay nöraminidaz substrat, 4-MUNANA, taze hazırlanmış olmalıdır. Hazırlanan zemin sialidase tayini için bir hafta içinde kullanılabilir. </li><li> Hücre hattı hücre yüzeyinde düşük reseptör ifade varsa, bir stimülasyon için daha yüksek bir doz ligand kullanabilirsiniz. </li><li> Biz de 6 kat fazla geçişli hücreler reseptör fenotip kaybedebilirsiniz yaşadım. Taze, dirilen hücrelerin kültür olmalıdır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Ekli temsilcisi sonuçları ile sialidase testinin animasyonlu protokol <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">Powerpoint dosyası</a> .

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

SRA ve PJ eşit ilk yazar olarak katkıda bulunmuştur.

Canlı makrofaj hücreleri 2 sialidase faaliyet algılamak için yeni geliştirilen testi kullanılarak, BMC-2 de canlı doza bağlı olarak makrofaj hücreleri DC-2.4 dendritik hücreler canlı ligand bağlı sialidase faaliyet sialidase aktivite tespit etmek için bu teknolojiyi kullandı HEK-TLR4/MD2, HEK293 SP1 meme adenokarsinom hücreleri, insan WT ve 1140F01 ve WG0544 tip I sialidosis fibroblast hücreleri. Tamiflu gibi nöraminidaz inhibitörleri (oseltamivir fosfat) bir IC 50 0,0194 mcM BMC-2 hücreleri için 1...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Life Technologies tarafından</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation, Floresan Montaj Medyumu</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Tamiflu (Oseltamivir Fosfat)</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

toll-like reseptör etkinleştirme düzenlenmesi neu1 sialidase faaliyet algılama

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Memeli Toll-like reseptörler (TLR), patojen ilişkili moleküler desenleri tanımaya reseptörlerinin bir aile. Sadece TLR mikrobiyal önemli sensörler (örneğin, virüs, bakteri ve parazit) enfeksiyonları, onlar da muhtemelen otoimmün hastalıklar, bulaşıcı hastalıklar, enfeksiyon hastalıkları, patofizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, şiddeti ve süresi, bulaşıcı hastalıklara karşı TLR tepkilerin sıkı kontrol edilmelidir. Bu sensör reseptörler, ligand etkileşimleri ve sinyal bileşenleri yapısal bütünlüğünü anlamak sonraki immünolojik korunması için gerekli olduğunu izler. Ayrıca sensör manipülasyon yoluyla hastalık modifikasyonu için önemli fırsatlar sağlayacaktır. TLR sensörleri sinyal yolakları iyi karakterize olmasına rağmen, parametreler sensörleri ve ligandlar hala yetersiz tanımlanmış kalır arasındaki etkileşimleri kontrol. Biz son zamanlarda, daha önce 1,2 görülmemiştir, doğal ligand TLR aktivasyonu yeni bir mekanizma tespit ettik. Bu ligand bağlı TLR aktivasyon Neu1 sialidase aktivasyonu ile sıkıca kontrol edildiğini göstermektedir. Ayrıca Neu1 sıkıca Neu1 ve matriks metalloproteinaz-9 (MMP-9) reseptörleri 4 karmaşık çapraz konuşma içeren TrkA ve TrkB 3 gibi nörotrofin reseptörleri düzenleyen bildirdin. Sialidase tahlil başlangıçta GPCR Gαi proteinleri ve MMP-9 5 üzerinden makrofajlar, dendritik hücreler ve fibroblast hücreleri hücre yüzeyinde Neu4 sialidase aktivasyonu, bir roman ligand, thymoquinone bulmak için kullanabileceğiniz olmuştur. TLR reseptörleri için, bizim veri Neu1 sialidase zaten, TLR-2, -3 ve -4 reseptörleri ile kompleks ve iki reseptör bağlayıcı ligand üzerine indüklenir göstermektedir. Aktive Neu1 sialidase hidroliz sialyl α-2 TLR-4 dimerization, MyD88/TLR4 karmaşık işe alım, NFkB aktivasyonu ve pro-inflamatuar hücre yanıtlarını sterik hinderance kaldırmak için bağlayıcı ligand uzak ,3-bağlantılı β-galactosyl artıkları. Ortak bir raporda, Neu1 sialidase 6 makrofaj hücreleri fagositoz düzenleyen gösterilmiştir. Birlikte ele alındığında, sialidase testi ligand bağlı reseptör aktivasyonu moleküler mekanizmaları güçlü yorumlarla bize sağlamıştır. Neu1 sialidase ve TLR aktivasyonu arasında kesin bir ilişki, Trk reseptörlerinin henüz tam olarak açıklanamamış olmasına rağmen, hücre düzenleme yollar öncü ya da yeni bir yaklaşımı temsil eder.

Sialidase testi canlı makrofaj hücre yüzeyinde reseptör düzeyinde iltihabi hastalıklar mikrobik enfeksiyonlar ve katılımı TLR sensörleri yeni moleküler mekanizma (lar) aydınlatmak basit bir teknik yaklaşım.

Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama

Memeli Toll benzeri reseptörleri (TLR'ler), patojenle ilişkili moleküler kalıpları tanıyan bir reseptör ailesidir. TLR'ler yalnızca ... için kritik sensörler olmakla kalmaz,

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ligandın spesifik reseptörüne bağlanmasına yanıt olarak hücresel yeni on sase aktivitesinin indüklenmesini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağındaki 12 milimetrelik dairesel cam lamlar üzerinde 24 saat boyunca kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, cam lama yapışmış canlı hücreler, mikroskop lamı üzerinde önceden hazırlanmış sase substratı ve reseptör ligandı karışımıyla, spesifik inhibitörlerin varlığında veya yokluğunda, doğrudan temas ettirilir.Floresan görüntüleri görselleştirmek ve dijital olarak kaydetmek amacıyla mikroskop lamı derhal bir floresan mikroskobunun altına yerleştirilir. Zamanla sonuçlar elde edilir. Bu sonuçlar, epi-floresan mikroskobu altında hücreleri çevreleyen mavi floresans yoğunluğuna dayanarak, ligand ile işlem görmüş canlı hücrelerle ilişkili olarak hücre yüzeyindeki yeni nase aktivitesindeki değişiklikleri göstermektedir.Bu tekniği spektrofotometrik analiz gibi mevcut yöntemlere tercih etmenin temel avantajı, daha az reaktif kullanılmasıdır. Ayrıca canlı hücrelerdeki sase aktivitesini gözlemleyebilir ve görüntülerini kaydedebilirsiniz. Bu yöntem, potansiyel olarak yeni ligand reseptör etkileşimlerinin incelenmesi ve belirli enzim veya protein inhibitörlerinin reseptör aktivasyonu üzerindeki etkilerinin gözlemlenmesi gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanması için kullanılabilir.Prosedürü, dondurulmuş makrofaj hücrelerini canlandırmadan önce araştırmalarında bu analizi kullanan laboratuvarımın eski doktora öğrencileri Dr. Ray Amit ve Dr. PT Gath uygulamalı olarak gösterecektir. Steril filtrelenmiş DECS, %10 fetal sığır serumu ve mililitre başına beş mikrogram plazmin antibiyotiği ile desteklenmiş modifiye eagles besiyeri kullanarak kültür ortamını hazırlayın. Ardından, her bir dondurulmuş hücre flakonu için 25 santimetrekarelik bir hücre kültür flakonuna dört mililitre kültür ortamı ekleyin; dondurulmuş hücre flakonunu -80 °C dondurucudan çıkarın ve steril biyo-tehlike koruma kabininde el ile ısıtarak hızlıca çözdürün.Bu işlem yaklaşık iki ila üç dakika sürecektir. Hücreler çözünür çözünmez, bunları kondisyonlu besiyeri içeren hücre kültürü flaskına hızlıca aktarmak için bir mililitrelik steril bir pipet kullanın. Hücreleri içeren flaskı, evirtilmiş bir mikroskop kullanarak 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.Hücrelerin SASE analizi için ekilmesinden birkaç gün önce, %75 ila %90 konfluens seviyesine ulaşana kadar büyüme ve adezyon durumlarını günlük olarak kontrol edin. Hücrelerin ekileceği 12 milimetrelik dairesel cam lamları hazırlayın. Bu işlemleri biyolojik risk güvenlik kabininde gerçekleştirin.Lamları büyük bir cam Petri kabına yerleştirin ve bir saat boyunca %100 ethanol içinde bekleterek sterilize edin. Alkolü boşaltın ve ıslak cam lamları, ekim yapabilecekleri kadar kuruyana dek veya 24 saat boyunca kabin içerisinde UV altında, steril filtrelenmiş hava akımına maruz bırakın. Hücreler için öncelikle, dört inçlik kavisli tırtıklı paslanmaz çelik bir pens alevle yakılarak sterilize edilir.Ardından, pens kullanarak 24 kuyucuklu düz tabanlı doku kültürü işleminden geçmiş polistiren plağın her bir kuyucuğuna dikkatlice tek bir steril dairesel lam yerleştirin. Beş mililitrelik steril bir pipet kullanarak, yapışkan makrofaj hücrelerinin bulunduğu flasktan DMEM kondisyonlu ortamı çekip alın. Serum içeren ortamı uzaklaştırmak için hücreleri bir kez 1x steril tris tamponlu salin pH 7.4 ile yıkayın.Ardından, pH 7.4 değerinde, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin çözeltisinden 1 mL ekleyin. Hücreleri yaklaşık 10 dakika boyunca veya hücreler flask içerisinde yerinden ayrılmaya başlayana kadar 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin. Hücreler yerinden ayrıldıktan sonra, süspansiyondaki hücrelere 3 mL DMEM kondisyonlu besiyeri ekleyin.Ardından, yaklaşık 0,5 milyon hücre içeren süspansiyondan 0,5 mililitreyi 24 kuyucuklu plaka içindeki her bir 12 milimetrelik dairesel cam lamın üzerine aktarın; hücrelerin dairesel cam lamlara yapışmasını sağlamak için makrofaj hücrelerini içeren doku kültürü plağını 37 °C'de %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca inkübe edin. Sase aktivitesi için yapılacak analiz, üç ayrı mikroskop lamı üzerinde üç farklı koşul altında gerçekleştirilecektir. Negatif kontrol olarak kullanılan ilk lamda,Kontrol hücreleri; mountlama medyuma, ANA için nöraminidaz substratına ve tris tamponlu saline maruz bırakılır, ancak toll benzeri reseptör ligandı LPS'ye maruz bırakılmaz. İkinci lamda ise hücreler mountlama medyuma, ANA'ya, toll benzeri reseptör ligandı LPS'ye ve tris tamponlu saline maruz bırakılır.Üçüncü lamda hücreler; ANA, LPS Tris, tamponlu salin ve nöraminidaz inhibitörü Tamiflu'dan oluşan montaj mediumuna maruz bırakılır. Üç deney arasındaki tek fark mikroskop lamı üzerindeki bileşiklerin karışımı olduğundan, yalnızca ikinci deneyin prosedürünü göstereceğiz. Mikroskop lamını laboratuvar tezgahına yerleştirin ve aşağıdaki bileşikleri sırasıyla ekleyin.Bir mikrolitre montaj ortamı, ardından iki mikrolitre LPS içeren bir mikrolitre form ve son olarak, pH 7.4 tris tamponlu salin ekleyin. Ardından, hücreleri içeren 24 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğundaki ortamı uzaklaştırın. Bir sonraki adım, bu prosedürün en zor kısmıdır; çünkü dörtyüzünç pens ile doku kültürü plakasının kuyucuğundaki dairesel cam lameli kırmadan pensle çıkarmanız gerekir.Dairesel lamı nazikçe kuyucuğun köşesine kaldırın, ardından dikkatlice çıkararak hücreler aşağı bakacak şekilde solüsyon karışımının içine yerleştirin. Lamı vakit kaybetmeden, UV filtresi ayarlanmış ve floresan görüntüleri yakalamak için dijital kamerayla donatılmış bir epi-floresan mikroskoba götürün. Hücreleri görene kadar faz kontrast modunda odaklama yapın ve ardından floresan moda geçin.Birinci, ikinci ve üçüncü dakikalarda hücrelerin floresan modunda görüntülerini alın. Ayrıca, hücrelerin faz kontrast temsilinde tek bir görüntüsünü alın. Bir sase assay deneyinin sonuçları burada gösterilmiştir.İlk olarak, negatif kontrol olarak, bir lam üzerine yapışmış canlı hücreler, montaj ortamı ve form substrat karışımının bir noktasıyla doğrudan temas ettirildi; IP sase aktivitesinin mevcut olduğu durumlarda substrat, 365 nanometrede eksitasyon sonrası 450 nanometrede floresan emisyona sahip olan serbest etil lumbion üretmek üzere hidroliz edilecekti; ölçümler substrat eklendikten iki dakika sonra alındı.Bu floresan görüntü, hücrelerin çevresinde herhangi bir sase aktivitesi göstermemektedir. Bir sonraki görüntü, cam lam üzerine yapışmış canlı hücrelerin; montaj medyumu, substrat ve TLR 4 ligandı LPS'den oluşan bir nokta karışımı ile doğrudan temas ettirildiği pozitif bir SASE deneyi sonucunu göstermektedir. Substrat, serbest etil lum beone üretmek için sase enzimi tarafından hidrolize edilmiştir ve substrat ile LPS eklendikten iki dakika sonra çekilen floresan görüntü, hücrelerin çevresinde yüksek seviyelerde sase aktivitesi olduğunu göstermektedir.Bununla birlikte, canlı hücreler; nano substrat TLR four ligandı LPS, montaj medyumundan oluşan bir spot karışımı ve nöraminidaz inhibitörü Tamiflu ile doğrudan temas ettirildiğinde, sase aktivitesi inhibitör konsantrasyonuna bağlı olarak büyük ölçüde azalmış veya artık tespit edilememiştir. Son olarak bu grafik, sase aktivitesindeki azalmanın ajan konsantrasyonunun logaritmasına karşı çizilmesiyle belirlenen Tamiflu ve Oseltamivir karboksilatın %50 inhibitör konsantrasyonunu göstermektedir; her grup için hücrelerin çevresindeki ortalama floresans Image J yazılımı kullanılarak ölçülmüştür. Bu prosedür uygulanırken, Sade analizine başlamadan 24 saat önce hücrelerin 24 kuyucuklu doku kültürü plakalarındaki dairesel cam lameller üzerinde kültüre edilmesi gerektiği unutulmamalıdır.Ek olarak, bu analizde kullanılan tüm reaktifler analiz başlatılmadan önce hazırlanmalıdır.

detection-neu1-sialidase-activity-regulating-toll-like-receptor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, makrofajlardaki transkripsiyon faktörleri nükleer faktör-kappa-B (NF-κB) ve aktivatör protein-1'in (AP-1) toll benzeri reseptöre (TLR) bağlı aktivitesini incelemek için bir testi göstermektedir. TLR'ler, NF-κB ve AP-1'i aktive ederek, hasarla ilişkili moleküler modelleri (DAMP'ler) tanıdıktan sonra bir pro-inflamatuar sinyal kaskadını tetikler. Tasarlanmış raportör makrofajlar, NF-κB ve AP-1 aktivasyonu üzerine salgılanan embriyonik alkalin fosfataz (SEAP) enzimi üretir ve bu...

Makrofajlarda TLR'ye Bağımlı NF-&kcy;B/AP-1 Transkripsiyon Faktörü Sinyalizasyonu için Bir Test

Bu video, Toll benzeri reseptör (TLR) sinyalini inhibe eden potansiyel biyoaktif nanopartikülleri taramak için bir raportör hücre tabanlı testi göstermektedir. Test, raportör proteinleri - salgılanan embriyonik alkalin fosfataz (SEAP) ve lusiferaz - eksprese eden raportör makrofajlara peptit-altın nanopartikül hibritleri ile karıştırılmış lipopolisakkaritlerin (LPS) eklenmesini içerir. Hibritlerin aracılık ettiği LPS kaynaklı TLR sinyalinin azalması, raportör sinyallerinin ölçülmesiyle...

Toll Benzeri Reseptör Sinyal İnhibisyonu için Biyoaktif Nanopartikülleri Taramak İçin Bir Test

Dendritik hücreler (DC'ler) ile nigerisin ile birlikte NLRP3 inflammasome aktivasyonu takiben, sentetik purin, R848 ve TLR8 tanınması, tepki olarak IL-1β salgılar, bu nedenle, IL-1β NLRP3 inflammasome aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Hücre içi sitokin boyama, immunoblotting ve ELISA doğru IL-1β ekspresyonu üzerinden NLRP3 emişli inflammasome ve aktivasyonunu ölçmek için kullanılır.

Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Fare karaciğeri ve sütündeki N-asetilnöraminik asit ve N-glikolenüraminik asitin tayini için HPLC temelli bir yöntem açıklanmaktadır.

Karaciğer ve Süt örneklerinde vahşi tipli ve sialik asitler tayini ve<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Fare.

Toll benzeri reseptör (TLR) sinyali birçok insan iltihaplı hastalığın patofizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır ve biyoaktif nanoparçacıklar ile TLR yanıtlarının düzenlenmesinin pek çok iltihaplanma koşulunda faydalı olacağı öngörülmektedir. THP-1 hücre bazlı raportör hücreleri, TLR sinyallemesinin yeni inhibitörlerini tanımlamak için çok yönlü ve sağlam bir tarama platformu sağlar.

Toll benzeri Reseptör Sinyali Önleyicileri İçin Fagositik Bağışıklık Hücrelerinde Biyoaktif Nanopartiküllerin Taranması

Doğuştan gelen bağışıklık MALT1 düzenleyen ama nasıl oluşur kötü tanımlanmış kalır. Biz doğuştan gelen sinyal MALT1 myeloid sitokinler, üretimini düzenler gösteren Toll benzeri veya C tipi lektin-benzeri reseptörler aşağı ve aşağı akım için MALT1 katkısını çözülmeye selektif MALT1 paracaspase inhibitörü MLT-827 kullanılan C tipi lektin benzeri reseptörlerinin seçerek.

Myeloid doğuştan gelen sinyal yolu düzenleme MALT1 Paracaspase etkinlik tarafından

Bu protokol, araştırmacılara, biyomateryal implant mikroçevresini modelleyen çeşitli polimerik yüzeylere ve adsordi protein katmanlarına yanıt olarak bir murine makrofaj hücre hattında TLR bağımlı NF-кB/AP-1 transkripsiyon faktörü aktivitesini ölçmenin hızlı ve dolaylı bir yöntemini sağlar.

Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik

Bu protokol, farklı sinyal yollarından gelen fonksiyonları kapsamak için bir tarama yöntemi olarak kullanılacak bir dizi nötrofil fonksiyonel tahlil içerir. Protokol, hücre canlılığının, saflığının, reaktif oksijen türlerinin üretiminin, gerçek zamanlı göçün, fagositozun ve nötrofil hücre dışı tuzakların bir ön önerisinin ilk ve basit bir değerlendirmesini içerir.

Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Burada, rutin mikroskopi ekipmanı kullanarak hücre içi sialillenmiş N-glikoproteinlerin biyogörüntülemesine izin veren metabolik oligosakkarit mühendisliği, tıklama kimyası ve genleşme mikroskobunu birleştiren basit bir protokol öneriyoruz.

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Öğrenin, canlı makrofaj hücrelerinde Neu1 sialidaz aktivitesini floresan mikroskopi ile nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, TLR reseptör etkileşimlerini ve iltihaplı hastalıklardaki hücresel yanıtları gerçek zamanlı izlemeyi sağlar.

Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama

Daha fazla video keşfet