Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ligandın spesifik reseptörüne bağlanmasına yanıt olarak hücresel yeni bir saase aktivitesinin indüksiyonunu değerlendirmektir. Bu, önce hücrelerin 12 milimetrelik dairesel cam slaytlarda 24 kuyulu doku kültürü plakasında 24 saat boyunca kültürlenmesi ile elde edilir. İkinci adım olarak, cam slayda yapışan canlı hücreler, mikroskop Slaytında bir önceden hazırlanmış saase substrat ve reseptör ligand karışımına veya spesifik inhibitörler içeren bir karışıma doğrudan temas halinde bırakılır.

Mikroskop slaydı hemen bir floresan mikroskobunun altına yerleştirilir ve floresan görüntüler görselleştirilir ve dijital olarak kaydedilir. Zamanla sonuçlar elde edilir. Bu, epi floresan mikroskobu altında hücreleri çevreleyen mavi floresan yoğunluğuna dayalı olarak ligand ile tedavi edilen canlı hücrelerin hücre yüzeyindeki yeni saase aktivitesindeki değişiklikleri gösterir.

Bu tekniğin mevcut yöntemler gibi spektrofotometrik analiz üzerindeki ana avantajı, daha az reaktif kullanmanızdır. Ayrıca canlı hücrelerde saase aktivitesinin görüntülerini gözlemleyebilir ve kaydedebilirsiniz. Bu yöntem, immünoloji alanındaki kilit sorulara cevap verebilmek için kullanılabilir, örneğin potansiyel olarak yeni ligand reseptör etkileşimlerini ve spesifik enzim veya protein inhibitörlerinin reseptör aktivasyonu üzerindeki etkilerini inceleyebilir.

Prosedürü gösterecek olan Dr. Ray Amit ve Dr. PT Gath, laboratuvarımdan eski doktora öğrencileridir ve bu tahlili araştırma çalışmalarında kullanmaktadırlar. Dondurulmuş makrofaaj hücrelerini canlandırmadan önce. Steril filtrelenmiş delcos kullanılarak kültür ortamı hazırlayın, değiştirilmiş eagles ortamı %10 fetal boğa serumu ve antibiyotik plazminin beş mikrogramı ile birlikte ilave edilir. Ardından, her dondurulmuş hücre şişesi için 25 kareli bir hücre kültürü şişesine dört mililitre kültür ortamı ekleyin, dondurucudan dondurulmuş hücre şişesini çıkarın ve steril biyogüvenlik muhafazası başlığında elle hızlı bir şekilde çözme işlemi gerçekleştirin.

Bu yaklaşık iki ila üç dakika sürer. Hücreler çözüldüğü anda, bir mililitre steril pipet kullanarak hızlı bir şekilde şartlandırılmış ortamı içeren hücre kültürü şişesine aktarın. Hücrelerin olduğu şişeyi, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak 37 derece Celsius ve %5 karbon dioksit ortamında doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Hücreleri günlük olarak büyüme ve yapışma için kontrol edin, hücrelerin SASE tahliline yerleştirilmesinden birkaç gün önce %75 ila %90 konfluansa ulaşana kadar devam edin. Hücrelerin yerleştirileceği 12 milimetrelik dairesel cam slaytları hazırlayın. Biyolojik tehlike muhafazası kabininde.

Slaytları büyük bir cam Petri kabına yerleştirin ve bir saat boyunca %100 etanol içinde sterilize edin. Alkolü çıkarın ve ıslak cam slaytları, kabinin UV'sinin altındaki steril filtrelenmiş hava akımına maruz bırakarak 24 saat boyunca veya kurumaları için bırakın. Hücreler öncelikle tam kavisli dört inçli pürüzlü paslanmaz çelik bir forseps ile ateşlenerek sterilize edilir.

Ardından forseps kullanarak, 24 kuyulu düz tabanlı, doku kültürü ile işlem görmüş polistiren plakanın her kuyusuna tek bir steril dairesel cam slayt yerleştirin. Beş mililitrelik steril bir pipet kullanarak, yapışkan makrofaj hücrelerini içeren şişeden DMEM şartlandırılmış ortamını çıkarın. Hücreleri, herhangi bir serum içeren ortamı çıkarmak için bir kez steril tris tamponlu tuzlu su pH 7,4 ile yıkayın.

Sonra, pH 7,4'te kalsiyum ortamı içermeyen fosfat tamponlu salin ekleyin. Hücreleri, hücreler şişeden ayrılmaya başlayana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca 37 derece Celsius'ta inkübe edin. Hücreler şişeden ayrıldığında, süspansiyondaki hücrelere üç mililitre DMEM şartlandırılmış ortamı ekleyin.

Ardından, 24 kuyulu plakadaki her 12 milimetrelik dairesel cam slayta yaklaşık 0,5 milyon hücre içeren 0,5 mililitre süspansiyonu aktarın. Makrofaj hücrelerini içeren doku kültürü plakasını, hücrelerin dairesel cam slaytlara yapışması için 37 derece Celsius'ta %5 karbon dioksit içinde 24 saat inkübe edin. Saase aktivitesi için tahlili, üç ayrı mikroskop slaytında üç farklı koşul altında gerçekleştirilecektir. İlk slaytta, negatif kontrol olarak hücreler, montaj ortamına maruz kalır. ANA için nöraminitaz substratı ve tris tamponlu tuzlu su, ancak toll-benzeri reseptör ligandı LPS değildir. İkinci slaytta, hücreler, montaj ortamı form ANA ve toll-benzeri reseptör ligandı LPS ve tris tamponlu tuzlu su ile maruz kalır.

Üçüncü slaytta, hücreler, montaj ortamı form ANA, LPS, tris tamponlu tuzlu su ve nöraminitaz inhibitörü Tamiflu ile maruz kalır. Sadece ikinci tahlili göstereceğiz, çünkü üç tahlili yalnızca mikroskop slaytındaki bileşik karışımı ile farklılık gösterir. Mikroskop slaytını laboratuvar tezgahına yerleştirin ve aşağıdaki bileşikleri sırasıyla ekleyin.

Bir mikrolitre montaj ortamı, ardından bir mikrolitre form, iki mikrolitre LPS ve son olarak, üç