Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ligandın spesifik reseptörüne bağlanmasına yanıt olarak hücresel yeni on sase aktivitesinin indüklenmesini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağındaki 12 milimetrelik dairesel cam lamlar üzerinde 24 saat boyunca kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, cam lama yapışmış canlı hücreler, mikroskop lamı üzerinde önceden hazırlanmış sase substratı ve reseptör ligandı karışımıyla, spesifik inhibitörlerin varlığında veya yokluğunda, doğrudan temas ettirilir.

Floresan görüntüleri görselleştirmek ve dijital olarak kaydetmek amacıyla mikroskop lamı derhal bir floresan mikroskobunun altına yerleştirilir. Zamanla sonuçlar elde edilir. Bu sonuçlar, epi-floresan mikroskobu altında hücreleri çevreleyen mavi floresans yoğunluğuna dayanarak, ligand ile işlem görmüş canlı hücrelerle ilişkili olarak hücre yüzeyindeki yeni nase aktivitesindeki değişiklikleri göstermektedir.

Bu tekniği spektrofotometrik analiz gibi mevcut yöntemlere tercih etmenin temel avantajı, daha az reaktif kullanılmasıdır. Ayrıca canlı hücrelerdeki sase aktivitesini gözlemleyebilir ve görüntülerini kaydedebilirsiniz. Bu yöntem, potansiyel olarak yeni ligand reseptör etkileşimlerinin incelenmesi ve belirli enzim veya protein inhibitörlerinin reseptör aktivasyonu üzerindeki etkilerinin gözlemlenmesi gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanması için kullanılabilir.

Prosedürü, dondurulmuş makrofaj hücrelerini canlandırmadan önce araştırmalarında bu analizi kullanan laboratuvarımın eski doktora öğrencileri Dr. Ray Amit ve Dr. PT Gath uygulamalı olarak gösterecektir. Steril filtrelenmiş DECS, %10 fetal sığır serumu ve mililitre başına beş mikrogram plazmin antibiyotiği ile desteklenmiş modifiye eagles besiyeri kullanarak kültür ortamını hazırlayın. Ardından, her bir dondurulmuş hücre flakonu için 25 santimetrekarelik bir hücre kültür flakonuna dört mililitre kültür ortamı ekleyin; dondurulmuş hücre flakonunu -80 °C dondurucudan çıkarın ve steril biyo-tehlike koruma kabininde el ile ısıtarak hızlıca çözdürün.

Bu işlem yaklaşık iki ila üç dakika sürecektir. Hücreler çözünür çözünmez, bunları kondisyonlu besiyeri içeren hücre kültürü flaskına hızlıca aktarmak için bir mililitrelik steril bir pipet kullanın. Hücreleri içeren flaskı, evirtilmiş bir mikroskop kullanarak 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Hücrelerin SASE analizi için ekilmesinden birkaç gün önce, %75 ila %90 konfluens seviyesine ulaşana kadar büyüme ve adezyon durumlarını günlük olarak kontrol edin. Hücrelerin ekileceği 12 milimetrelik dairesel cam lamları hazırlayın. Bu işlemleri biyolojik risk güvenlik kabininde gerçekleştirin.

Lamları büyük bir cam Petri kabına yerleştirin ve bir saat boyunca %100 ethanol içinde bekleterek sterilize edin. Alkolü boşaltın ve ıslak cam lamları, ekim yapabilecekleri kadar kuruyana dek veya 24 saat boyunca kabin içerisinde UV altında, steril filtrelenmiş hava akımına maruz bırakın. Hücreler için öncelikle, dört inçlik kavisli tırtıklı paslanmaz çelik bir pens alevle yakılarak sterilize edilir.

Ardından, pens kullanarak 24 kuyucuklu düz tabanlı doku kültürü işleminden geçmiş polistiren plağın her bir kuyucuğuna dikkatlice tek bir steril dairesel lam yerleştirin. Beş mililitrelik steril bir pipet kullanarak, yapışkan makrofaj hücrelerinin bulunduğu flasktan DMEM kondisyonlu ortamı çekip alın. Serum içeren ortamı uzaklaştırmak için hücreleri bir kez 1x steril tris tamponlu salin pH 7.4 ile yıkayın.

Ardından, pH 7.4 değerinde, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin çözeltisinden 1 mL ekleyin. Hücreleri yaklaşık 10 dakika boyunca veya hücreler flask içerisinde yerinden ayrılmaya başlayana kadar 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin. Hücreler yerinden ayrıldıktan sonra, süspansiyondaki hücrelere 3 mL DMEM kondisyonlu besiyeri ekleyin.

Ardından, yaklaşık 0,5 milyon hücre içeren süspansiyondan 0,5 mililitreyi 24 kuyucuklu plaka içindeki her bir 12 milimetrelik dairesel cam lamın üzerine aktarın; hücrelerin dairesel cam lamlara yapışmasını sağlamak için makrofaj hücrelerini içeren doku kültürü plağını 37 °C'de %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca inkübe edin. Sase aktivitesi için yapılacak analiz, üç ayrı mikroskop lamı üzerinde üç farklı koşul altında gerçekleştirilecektir. Negatif kontrol olarak kullanılan ilk lamda,

Kontrol hücreleri; mountlama medyuma, ANA için nöraminidaz substratına ve tris tamponlu saline maruz bırakılır, ancak toll benzeri reseptör ligandı LPS'ye maruz bırakılmaz. İkinci lamda ise hücreler mountlama medyuma, ANA'ya, toll benzeri reseptör ligandı LPS'ye ve tris tamponlu saline maruz bırakılır.

Üçüncü lamda hücreler; ANA, LPS Tris, tamponlu salin ve nöraminidaz inhibitörü Tamiflu'dan oluşan montaj mediumuna maruz bırakılır. Üç deney arasındaki tek fark mikroskop lamı üzerindeki bileşiklerin karışımı olduğundan, yalnızca ikinci deneyin prosedürünü göstereceğiz. Mikroskop lamını laboratuvar tezgahına yerleştirin ve aşağıdaki bileşikleri sırasıyla ekleyin.

Bir mikrolitre montaj ortamı, ardından iki mikrolitre LPS içeren bir mikrolitre form ve son olarak, pH 7.4 tris tamponlu salin ekleyin. Ardından, hücreleri içeren 24 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğundaki ortamı uzaklaştırın. Bir sonraki adım, bu prosedürün en zor kısmıdır; çünkü dörtyüzünç pens ile doku kültürü plakasının kuyucuğundaki dairesel cam lameli kırmadan pensle çıkarmanız gerekir.

Dairesel lamı nazikçe kuyucuğun köşesine kaldırın, ardından dikkatlice çıkararak hücreler aşağı bakacak şekilde solüsyon karışımının içine yerleştirin. Lamı vakit kaybetmeden, UV filtresi ayarlanmış ve floresan görüntüleri yakalamak için dijital kamerayla donatılmış bir epi-floresan mikroskoba götürün. Hücreleri görene kadar faz kontrast modunda odaklama yapın ve ardından floresan moda geçin.

Birinci, ikinci ve üçüncü dakikalarda hücrelerin floresan modunda görüntülerini alın. Ayrıca, hücrelerin faz kontrast temsilinde tek bir görüntüsünü alın. Bir sase assay deneyinin sonuçları burada gösterilmiştir.

İlk olarak, negatif kontrol olarak, bir lam üzerine yapışmış canlı hücreler, montaj ortamı ve form substrat karışımının bir noktasıyla doğrudan temas ettirildi; IP sase aktivitesinin mevcut olduğu durumlarda substrat, 365 nanometrede eksitasyon sonrası 450 nanometrede floresan emisyona sahip olan serbest etil lumbion üretmek üzere hidroliz edilecekti; ölçümler substrat eklendikten iki dakika sonra alındı.

Bu floresan görüntü, hücrelerin çevresinde herhangi bir sase aktivitesi göstermemektedir. Bir sonraki görüntü, cam lam üzerine yapışmış canlı hücrelerin; montaj medyumu, substrat ve TLR 4 ligandı LPS'den oluşan bir nokta karışımı ile doğrudan temas ettirildiği pozitif bir SASE deneyi sonucunu göstermektedir. Substrat, serbest etil lum beone üretmek için sase enzimi tarafından hidrolize edilmiştir ve substrat ile LPS eklendikten iki dakika sonra çekilen floresan görüntü, hücrelerin çevresinde yüksek seviyelerde sase aktivitesi olduğunu göstermektedir.

Bununla birlikte, canlı hücreler; nano substrat TLR four ligandı LPS, montaj medyumundan oluşan bir spot karışımı ve nöraminidaz inhibitörü Tamiflu ile doğrudan temas ettirildiğinde, sase aktivitesi inhibitör konsantrasyonuna bağlı olarak büyük ölçüde azalmış veya artık tespit edilememiştir. Son olarak bu grafik, sase aktivitesindeki azalmanın ajan konsantrasyonunun logaritmasına karşı çizilmesiyle belirlenen Tamiflu ve Oseltamivir karboksilatın %50 inhibitör konsantrasyonunu göstermektedir; her grup için hücrelerin çevresindeki ortalama floresans Image J yazılımı kullanılarak ölçülmüştür. Bu prosedür uygulanırken, Sade analizine başlamadan 24 saat önce hücrelerin 24 kuyucuklu doku kültürü plakalarındaki dairesel cam lameller üzerinde kültüre edilmesi gerektiği unutulmamalıdır.

Ek olarak, bu analizde kullanılan tüm reaktifler analiz başlatılmadan önce hazırlanmalıdır.