Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, hücresel kasılmayı modüle etmek ve nicelleştirmek için uygun matrisler oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle matrisin tutunmasını sağlamak amacıyla bir lamelin aktive edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise, aktive edilmiş lamel üzerine bir poliakrilamid jel polimerize etmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, hücrelerin jel üzerine ekilmesi ve yapışmalarının sağlanmasıdır. Prosedürün son adımı ise, traksiyon kuvvet mikroskobisi protokolleri ile analiz edilecek verileri üretmek için jelin görüntülenmesidir. Sonuç olarak, traksiyon kuvvet mikroskobisi aracılığıyla hücrelerin matrislerine traksiyon kuvvetleri uyguladığını gösteren bulgular elde edilebilir.

Merhaba, ben Chicago Üniversitesi Fizik Bölümü ve Biyofiziksel Dinamik Enstitüsü'ndeki Margaret ELL laboratuvarından Yvonne Eons. Ben de yine Guard laboratuvarından Steven Winter. Bugün sizlere, hücresel kontraksiyon ölçümleri için uyumlu matrislerin hazırlanma prosedürünü göstermek istiyoruz.

Kontraktil aktin miyozin ağlarını incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürleri kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Lamel aktivasyonundan önce, daha önceden birkaç adet 22 by 40 milimetre 1,5 numara lamel yerleştirilmiştir.

Lamellerin birbirine değmeyecek şekilde aralıklı yerleştirildiği paslanmaz çelik bir rakta %70 etanol ile durulayın. Kimyasal çeker ocakta çalışarak, kare bir cam kap içinde izopropanol içerisinde %2 three or minor profile trimeth çözeltisi hazırlayın. Three or minoro profile eklemek için cam pastör pipeti kullanın.

Trimethoksi bileşiğinin plastikle reaktif olması nedeniyle, lamel camları tamamen bu solüsyona dökün ve çeker ocaktaki bir manyetik karıştırıcı üzerinde karıştırarak 10 dakika boyunca inkübe edin. Lamel camları beklettiğiniz işlemden sonra, çift distile su içine daldırarak yıkayın. Son değişimden sonra suyu dört kez yenileyin.

Karıştırarak 10 dakika boyunca bekletin. Ardından lamelleri yaklaşık 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatörde 10 dakika boyunca kurutun. Kuruduktan sonra oda sıcaklığına gelene kadar bekletin.

Kapak camlarını, çift distile su içinde hazırlanmış %1'lik Glutaraldehit çözeltisine daldırın. Bu işlemi, bir manyetik karıştırıcı üzerindeki cam kare kapta 30 dakika boyunca gerçekleştirin. Kabın temiz olduğundan emin olun.

Aksi takdirde, çözelti sonrasında bulanık görünebilir. Lamel camlarını, her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez çift distile su ile değiştirerek karıştırma işlemiyle yıkayın. Ardından, tozlanmayı önlemek için lamel camlarını alüminyum folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında kurutun.

Kuruduktan sonra lamelleri tozdan uzak, kuru bir yerde iki aya kadar saklayın. Poliakrilamid veya PAA jeli hazırlamak için, önce RI protokolünde açıklandığı şekilde %40 akrilamid ve %2 bisakrilamidden Acrylamide bis stok çözeltileri hazırlayın.

Sıvı akrilamid çözeltisi vakum odasında 20 dakika boyunca gazdan arındırılır (DGA). Bu işlem, polimerizasyonu önleyen jel içindeki oksijeni azaltır. Bu sırada, %10'luk amonyum per sülfat veya bir PS çözeltisi hazırlayın.

Ardından, cam lam yüzeyini hidrofobik hale getirmek için birle üç inç boyutundaki mikroskop lamlarını Rain X mendillerle silin. Pürüzsüz bir jel yüzeyi sağlamak için tüm tozları bir Kim wipe ile temizleyin. Lamı alüminyum folyo ile kapatıp kenara ayırın.

Ardından akrilamid çözeltisini vakum odasından çıkarın ve floresan boncuklar ekleyin. Jel polimerizasyonunu başlatmak için 0.75 µL TM E ve 2.5 µL %10'luk PS ekleyin. Çözeltiyi pipetleme yaparak kısa süreli karıştırın. Sonra, önceden hazırlanmış hidrofobik mikroskop lamı üzerine 10 ila 12 µL akrilamid çözeltisi uygulayın.

Aktifleşmiş 22 by 40 milimetre boyutunda bir lamеl düşünce damlasının üzerine yerleştirin. Jel solüsyonu lamеlin tamamını kaplamalıdır. Solüsyon içerisinde oluşabilecek hava kabarcıklarını düzeltin.

Jel solüsyonunun oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Polimerizasyon gerçekleştiğinde, jel lamelin kenarından ayrılacaktır. Bir cımbızın ince ucuyla, jeliyle birlikte lameli mikroskop lamı yüzeyinden dikkatlice kaldırın.

Ekstra hücresel matrisi veya ECM proteinini jele çapraz bağlamak için jel yüzeyini nemli tutmak amacıyla, jeli çift distile su içeren bir Petri kabına daldırın. İlk olarak, SULF san par tozunu susuz dimetil sülfoksit veya DMSO içinde çözerek 40 µL'lik çalışma alikotları hazırlayın. Ardından, lamel döndürücüsünü kısa süreliğine kullanarak jel yüzeyindeki çift distile suyu uzaklaştırın.

Kullanımdan hemen önce jelin kurumamasına dikkat edin. Sülfür sampa DMSO alikotlarını çift distile su ile seyreltin ve jel yüzeyinin merkezini yaklaşık 200 µL ile kaplayın. Ardından, jel yüzeyini bir UV çapraz bağlayıcı fırında UV ışığına maruz bırakın.

UV maruziyetinin ardından, lamelleri taze çift distile su içeren bir beherin içine daldırın. Bir lamel döndürücü kullanarak jel yüzeyindeki tüm solüsyonu temizleyin. Ardından paramı bir Petri kabına yerleştirin ve paramın üzerine 50 µL soğuk fibronectin damlatın.

Lamelin yönünü ters çevirin ve jel tarafını fibronektinin üzerine yerleştirin. Lamellerin oda sıcaklığında bir ila iki saat veya 4 °C'de gece boyunca reaksiyona girmesini sağlayın. İnkübasyon işlemini steril bir doku kültürü ventilasyon kabininde gerçekleştirin.

Lamelatları kaplamak için PBS içeren altı santimetrelik doku kültürü kaplarına yerleştirin. Yıkama işleminin ardından, steril koşullar altında birkaç kez PBS değiştirerek lamelatları kapsamlı bir şekilde yıkayın. Lamelatları 30 dakika boyunca UV işlemi ile sterilize edin.

Ardından, hücreleri ekmeden önce lamelleri 30 ila 45 dakika boyunca hücre besiyerinde inkübe edin. Sonra, lameli sabit tutmak için vakum gresi kullanarak 22 x 30 milimetrelik lameli bir Warner Instruments konfokal görüntüleme odasının üst lamel tutucusuna yerleştirin. Hem giriş hem de çıkış polietilen tüplerine erişim sağlayacak şekilde, lamelin üzerine oda oluşturucu kauçuk contayı yerleştirin.

Bu işlem, kullanılan contanın boyutuna bağlı olarak, üst lamel ile jel kaplı 22 by 40 milimetrelik lamel arasında 150 ila 1000 mikronluk bir boşluk oluşmasını sağlayacaktır. Ardından, ılık hücre besiyeri içeren şırıngaları konnektör kiti aracılığıyla giriş borusuna yerleştirin ve besiyerinin borudan geçerek üst lamel üzerine aktığını kontrol edin. Haznenin tabanına vakum gresi sürün ve jel kaplı 22 by 40 milimetrelik lameli hücre yüzeyi yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Sıcak medyumu hücrelerin üzerine uygulayın. Üst lam tutucuyu, onu jel kaplı lamdan ayıran oda contalarıyla birlikte oda tabanına yerleştirin. Oda tabanındaki konumlandırma pimlerinin, üst lamdaki konumlandırma deliklerine oturduğundan emin olun.

Basınç plakasını hazne tabanına yerleştirin ve basınç plakasını vidalayarak sabitlemek için basınç plakası anahtarını kullanın. Hazne içinde herhangi bir sızıntı olup olmadığını izlemek için tüpler ve hazne üzerinden medya akışını kontrol edin. Ayrıca hücre yüzeyinde medyasız bölgelerin oluşmasını engelleyin.

Konfokal floresan mikroskobu üzerinde, jel substratına gömülmüş floresan işaretli proteinlerin ve floresan boncukların görüntüsünü almak için konfokal görüntüleme haznesini, mikroskop tutucu içindeki sahne adaptörüne yerleştirin; böylece jel perforasyonu içindeki gerilmemiş boncuk konumunun görüntüsünü elde edin. Hücresel adezyonları jelden ayırmak için hafifçe vurun ve hücrelerin bulunduğu aynı görüntüleme alanındaki floresan boncukların görüntüsünü alın. Protokole doğru şekilde uyulduğunda, jel yüzeyi nispeten düz ve pürüzsüz olacak ve floresan boncuklar her yere eşit şekilde gömülmüş olacaktır.

ECM, fibronektin immünofloresansı ile de görselleştirilebilir. Jel kontraksiyonu fokal adezyonların bulunduğu konumda ölçülecekse, jel ve hücrelerin görüntülemesi fokal adezyonların konfokal optik düzleminde yapılmalıdır. Burada, GFP pxi ile işaretlenmiş bir insan osteosarkom veya U2 OS hücresindeki çekim kuvveti deneyinde fokal adezyonlar görselleştirilmiştir.

Bir jelin büzülmesi, odak yapışma bölgelerinin altına gömülmüş floresan boncukların yer değiştirmesiyle görselleştirilebilir. Yeşil renkteki gerilimli boncuklar ile kırmızı renkteki gerilmemiş boncuk konumlarının karşılaştırılması, büzülme altındaki jel substrat yer değiştirmesinin miktarının belirlenmesine olanak tanır; burada, tripsin ile jel yüzeyinden ayrılan yayılmış bir hücrenin temsili bir sonucu yer almaktadır. Burada, gerilimli ve gerilmemiş boncuk konumlarının karşılaştırılmasına ait temsili bir sonuç bulunmaktadır.

Gelişmiş hesaplama algoritmalarının kullanımı, boncuk yer değiştirmesi ve jellerin elastik modülü ile ilişkili çekme gerilmelerini sağlayabilir. Bu gerilmeler burada, ısı haritasındaki daha sıcak renklerin ve daha büyük okların daha güçlü kuvvetleri belirttiği bir ısı ölçek haritası ve vektörlerle görselleştirilmiştir. Bu prosedür sırasında hücresel kontraksiyonu ölçmek için uyumlu matrislerin nasıl hazırlanacağını size göstermiş olduk.

Zamana karşı hassas adımların hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilmesi için önceden planlama yapmak önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.