Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, hücresel kasılmayı modüle etmek ve nicelleştirmek için uygun matrisler oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle matrisin tutunmasını sağlamak amacıyla bir lamelin aktive edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, aktive edilmiş lamel üzerine bir poliakrilamid jel polimerize etmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, hücrelerin jel üzerine ekilmesi ve yapışmalarının sağlanmasıdır. Prosedürün son adımı ise, traksiyon kuvveti mikroskopi protokolleri ile analiz edilecek verileri üretmek amacıyla jelin görüntülenmesidir. Nihayetinde, traksiyon kuvveti mikroskopisi aracılığıyla hücrelerin matrislerine traksiyon kuvvetleri uyguladığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Chicago Üniversitesi Fizik Bölümü ve Biyofiziksel Dinamikler Enstitüsü'ndeki Margaret ELL laboratuvarından Yvonne Eons. Ben de yine Guard laboratuvarından Steven Winter. Bugün size, hücresel kontraksiyonu ölçmek için uyumlu matrislerin hazırlanma prosedürünü göstermek istiyoruz.

Laboratuvarımızda kasılabilen aktin miyozin ağlarını incelemek için bu prosedürleri kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Lamel aktivasyonu öncesinde, daha önceden birkaç adet 22 by 40 mm numara 1.5 lamel yerleştirilmişti.

Lamellerin aralıklı olması ve birbirine değmemesi için paslanmaz çelik bir rack içinde %70 etanol ile durulayın. Kimyasal çeker ocakta çalışarak, kare bir cam kap içerisinde izopropanol ile %2 three or minor profile trimeth çözeltisi hazırlayın. Three or minoro profile eklemek için cam pastör pipeti kullanın.

Plastik ile reaksiyona girme özelliği nedeniyle Trimeth oxy çözeltisi içerisinde, çeker ocaktaki bir manyetik karıştırıcı üzerinde karıştırarak lamelleri tamamen daldırın ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Lamelleri ıslattıktan sonra, çift distile su içerisine daldırarak yıkayın. Son değişimden sonra suyu dört kez yenileyin.

Karıştırma işlemiyle birlikte 10 dakika boyunca bekletin. Ardından lamelleri yaklaşık 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatörde 10 dakika boyunca kurutun. Kuruduktan sonra oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin.

Lamelleri, çift distile su içerisinde hazırlanmış %1'lik Glutaraldehit çözeltisine daldırın. Bu işlemi, manyetik karıştırıcı üzerindeki kare cam bir kapta 30 dakika boyunca gerçekleştirin. Temiz bir kap kullandığınızdan emin olun.

Aksi takdirde, çözelti sonrasında bulanık görünebilir. Lamelcikleri, her biri 10 dakika süren ve karıştırma işlemi uygulanan üç kez çift distile su değişimi ile yıkayın. Ardından, tozdan kaçınmak için lamelcikleri alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında kurutun.

Kuruduktan sonra lamelleri, tozdan uzak ve kuru bir yerde iki aya kadar saklayın. Poliakrilamid veya PAA jelini hazırlamak için öncelikle, RI protokolünde açıklandığı şekilde %40 akrilamid ve %2 bis akrilamidden oluşan Akrilamid bis stok çözeltilerini hazırlayın.

DGAs, akrilamid çözeltisini bir vakum odasında 20 dakika boyunca bekletir. Bu işlem, polimerizasyonu engelleyen jel içindeki oksijeni azaltır. Bu sırada, %10'luk amonyum persülfat veya bir PS çözeltisi hazırlayın.

Ardından, cam lam yüzeyini hidrofobik hale getirmek için bir inç çarpı üç inç boyutundaki mikroskop lamlarını Rain X mendillerle silin. Pürüzsüz bir jel yüzeyi sağlamak için herhangi bir tozu Kim wipe ile temizleyin. Lamı alüminyum folyo ile kapatın ve kenara ayırın.

Ardından akrilamid çözeltisini vakum odasından çıkarın ve floresan boncuklar ekleyin. Jel polimerizasyonunu başlatmak için 0.75 µL TM E ve 2.5 µL %10a PS ekleyin. Çözeltiyi pipetleme yöntemiyle kısa süreli karıştırın. Sonra, 10 ila 12 µL akrilamid çözeltisini daha önce hazırlanmış olan hidrofobik mikroskop lamına uygulayın.

Aktive edilmiş 22 by 40 milimetrelik bir lamelini damlanın üzerine yerleştirin. Jel çözeltisi tüm lameli kaplamalıdır. Çözelti içerisinde oluşabilecek hava kabarcıklarını düzeltin.

Jel solüsyonunun oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Polimerizasyon gerçekleştiğinde, jel lamelin kenarından ayrılacaktır. Bir cımbızın ince ucuyla, jelin yapışık olduğu lameli mikroskop lamı yüzeyinden dikkatlice kaldırın.

Ekstraselüler matriks veya ECM proteinini jele çapraz bağlamak için jel yüzeyinin hidrate kalmasını sağlamak amacıyla, jeli çift distile su içeren bir Petri kabına daldırın. İlk olarak, SULF san par tozunu susuz dimetil sülfoksit veya DMSO içinde çözerek 40 µL'lik çalışma alikotları hazırlayın. Ardından, lamel döndürücümüzü kısa bir süre kullanarak jel yüzeyindeki çift distile suyu uzaklaştırın.

Kullanımdan hemen önce jelin kurumamasına dikkat edilmelidir. Sülfür sampa DMSO alikotları çift distile su ile seyreltilir ve jel yüzeyinin merkezi yaklaşık 200 µL ile kaplanır. Ardından, jel yüzeyi bir UV çapraz bağlayıcı fırında UV ışığına maruz bırakılır.

UV maruziyetinin ardından, lamelleri taze çift distile su içeren bir beherin içine daldırın. Bir lamel döndürücü kullanarak jel yüzeyindeki tüm solüsyonu uzaklaştırın. Ardından, paramı bir Petri kabına yerleştirin ve paramın üzerine 50 microliters soğuk fibronektin damlatın.

Lamelin yönünü ters çevirin ve jel tarafını fibronectinin üzerine yerleştirin. Lamellerin oda sıcaklığında bir ila iki saat veya dört derece Celsius'ta gece boyunca reaksiyona girmesini bekleyin. İnkübasyonu steril bir doku kültürü havalandırmalı kabininde gerçekleştirin.

Lamelleri kaplamak için PBS içeren altı santimetrelik doku kültürü kaplarına yerleştirin. Yıkama işleminin ardından, steril koşullar altında birkaç kez PBS değişimi yaparak lamelleri kapsamlı bir şekilde yıkayın. Lamelleri 30 dakika boyunca UV işlemi ile sterilize edin.

Ardından, hücre ekimi öncesinde lamelleri 30 ila 45 dakika boyunca hücre besiyerinde inkübe edin. Sonrasında, lamelin sabit kalmasını sağlamak için vakum gresi kullanarak, 22 x 30 milimetrelik lameli bir Warner Instruments konfokal görüntüleme odasının üst lamel tutucusuna yerleştirin. Hem giriş hem de çıkış polietilen tüplerine erişim sağlayacak şekilde, lamelin üzerine oda oluşturucu bir kauçuk contayı yerleştirin.

Bu işlem, kullanılan contanın boyutuna bağlı olarak, üst lamel ile jel kaplı 22 by 40 milimetrelik lamel arasında 150 ile 1000 mikron arasında bir boşluk oluşmasını sağlayacaktır. Ardından, sıcak hücre besiyeri içeren şırıngaları konnektör kiti aracılığıyla giriş borusuna yerleştirin ve besiyerinin boru boyunca akarak üst lamel üzerine ulaştığını kontrol edin. Oda tabanına vakum gresi uygulayın ve jel kaplı 22 by 40 milimetrelik lamelin hücre yüzeyi yukarı gelecek şekilde yerleştirin.

Ilık medyumu hücrelere uygulayın. Üst lam tutucuyu, oda contalarının onu jel kaplı lamdan ayırmasını sağlayacak şekilde oda tabanına yerleştirin. Oda tabanındaki konumlandırma pimlerinin, üst lamdaki konumlandırma deliklerine oturduğundan emin olun.

Basınç plakasını hazne tabanına yerleştirin ve basınç plakasını vidalayarak sabitlemek için basınç plakası anahtarını kullanın. Hazne içinde herhangi bir sızıntı olup olmadığını izlemek için tüpler ve hazne boyunca medya akışını kontrol edin. Ayrıca, hücre yüzeyinde medyasız bölgeler kalmadığından emin olun.

Konfokal floresan mikroskobunda jel alt tabakasına gömülü floresan işaretli proteinlerin ve floresan boncukların görüntüsünü almak ve jel perfüzyonu içindeki gerilmemiş boncuk konumunun görüntüsünü elde etmek için konfokal görüntüleme odasını, mikroskop tutucu içindeki sahne adaptörüne yerleştirin. Hücresel adezyonları jelden ayırmak için işlem yapın ve hücrelerin bulunduğu aynı görüntüleme alanındaki floresan boncukların görüntüsünü alın. Protokol doğru şekilde uygulandığında, jel yüzeyi nispeten düz ve pürüzsüz olacak ve floresan boncuklar her yere eşit şekilde gömülmüş olacaktır.

ECM ayrıca fibronectin immünofloresansı ile de görselleştirilebilir. Odaksal yapışma bölgelerinde jel kontraksiyonu ölçülüyorsa, jel ve hücrelerin görüntülemesi odaksal yapışmaların konfokal optik düzleminde yapılmalıdır. Burada, GFP pxi ile işaretlenmiş bir insan osteosarkom veya U2 OS hücresindeki çekim kuvveti deneyinde odaksal yapışmalar görselleştirilmiştir.

Bir jelin büzülmesi, gömülü floresan boncukların fokal adezyonların altındaki yer değiştirmesiyle görselleştirilebilir. Yeşil renkteki gerilmiş boncukların, kırmızı renkteki gerilmemiş boncuk konumlarıyla karşılaştırılması, büzülme altındaki jel substrat yer değiştirmesinin nicelleştirilmesine olanak tanır; burada, tripsin ile jel yüzeyinden ayrılan yayılmış bir hücrenin temsilci bir sonucu yer almaktadır. Burada, gerilmiş ve gerilmemiş boncuk konumlarının karşılaştırılmasına ilişkin temsilci bir sonuç yer almaktadır.

Gelişmiş hesaplama algoritmalarının kullanımı, boncuk yer değiştirmesi ve jellerin elastik modülü ile ilişkili çekme streslerini ortaya çıkarabilir. Bu stresler burada, ısı haritasındaki daha sıcak renklerin ve daha büyük okların daha güçlü kuvvetleri belirttiği bir ısı ölçeği haritası ve vektörlerle görselleştirilmiştir. Bu prosedürü uygularken, hücresel kontraksiyonu ölçmek için nasıl uyumlu matrisler hazırlayacağınızı az önce göstermiş olduk.

Zamana duyarlı adımların hızla gerçekleştirilebilmesi için önceden planlama yapmak önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.