$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Et suyunda Pseudomonas aeruginosa bakterisinin bir kültürünü alın.
Kültürü izolasyon agarı üzerine yerleştirin ve bakteri üremesini ve üronik asitlerden oluşan bir ekzopolisakkarit olan aljinat üretimini teşvik etmek için inkübe edin.
Bakteri çimine izotonik salin ekleyin ve bakteri hücrelerini aljinat ile birlikte toplamak için kazıyın.
Süspansiyonu bir tüpe aktarın, içeriği dağıtmak için girdap yapın ve enzimatik bozulmayı önlemek için buzun üzerine yerleştirin.
Bakteri yoğunluğunu belirlemek için optik yoğunluğu veya OD'yi ölçün.
Bakteri süspansiyonunu asit-borat çözeltisine ekleyin ve aljinatı üronik asit monomerlerine hidrolize etmek için karıştırın.
Kromojenik bir reaktif olan karbazol ekleyin ve inkübe edin. Asidik koşullar altında reaktif, renkli kompleksler oluşturmak için üronik asitlerle reaksiyona girer.
Aljinat konsantrasyonunu yansıtan üronik asit seviyelerini ölçmek için absorbansı ölçün.
Standart bir eğri kullanarak aljinat konsantrasyonunu belirleyin, ardından birim biyokütle başına aljinat üretimini hesaplamak için ölçülen bakteri hücre yoğunluğuna bölün.
Üronik asit karbazol tahliline başlamak için, test edilecek istenen suşun saf kültüründen tek bir koloni tanımlayın ve steril bir kürdan kullanarak koloniyi seçin.
Kürdanı beş mililitre PIB içeren bir kültür test tüpüne yerleştirin. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayıcı bir inkübatörde büyütün. İnkübasyonun ardından, önceden ısıtılmış bir PIA plakasına kültürlü PIB suyunun bir kısmını ekleyin.
Steril bir hücre yayıcı kullanarak suyu tabağa yayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Bir pipet kontrolörü ve steril 50 mililitrelik bir pipet kullanarak, yetişkin çimlere %0,85 sodyum klorür ekleyin ve bir hücre yayıcı kullanarak plakayı kazıyarak numuneyi toplayın. Numuneyi 50 mililitrelik yeni bir pipet kullanarak aspire edin ve 50 mililitrelik bir toplama tüpüne aktarın.
Numuneleri karıştırmak ve buz üzerine yerleştirmek için numuneyi yüksek vorteksleyin. Numunelerin OD 600'ünü ölçmek için, önce bir mililitre %0.85 sodyum klorür kullanarak spektrofotometreyi boşaltın. Ardından yeni bir tek kullanımlık küvete bir mililitre numune ekleyin ve OD'yi okuyun. Her numune için üç kopya okuma elde etmek için bu adımı iki kez tekrarlayın.
Şimdi kültür tüplerine üç mililitre sülfürik asit borat çözeltisi ekleyin ve buz üzerinde bekletin. Toplanan numunenin 350 mikrolitresini test tüplerindeki asit karışımına yavaşça ekleyin. Düşük sıcaklıkta kısa bir süre vorteksledikten sonra, asit numunesi karışımına 100 mikrolitre %0.1 karbazol ve etanol çözeltisi ekleyin.
Tüpü kapatın ve beş saniye boyunca orta ayarda vorteks yapın. Daha sonra 55 santigrat derecede 30 dakika kuru bir banyoya koyun. İnkübasyondan sonra, tüpleri kısa bir süre yüksekte vorteksleyin ve beş dakika soğumaya bırakın.
Spektrofotometre için boş olarak %0.85 sodyum klorür içeren tüpü kullanın. Daha sonra karışımın bir mililitresini temiz bir küvete ekleyin ve numunelerin dış çapını bir spektrofotometrede 530 nanometrede okuyun. Bilinen d-mannuronik asit konsantrasyonlarının seri seyreltmelerinin OD 530'unu ölçerek standart bir eğri hazırlayın.
İki kez tekrarlayın ve bu okumalardan doğrusal bir denklem çıkarın. Standart eğriyi kullanarak her numunedeki aljinat konsantrasyonunu hesaplayın ve OD 600 başına toplam aljinat miktarını elde etmek için doğrusal denklemdeki aljinat konsantrasyonunu OD 600'e bölün.