JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:17 dk • August 31st, 2026
Çoğu hücrenin genomuna entegre edilmiş uyuyan faj DNA'sı taşıdığı lizojenik bir bakterinin gece boyu kültürü alınır.
Taze besiyerine ekleyin ve inkübe edin.
Bazı bakteriler spontan indüksiyona uğrayarak, faj DNA'sının kesilip çıkarıldığı, replike edildiği ve viral proteinlerin üretildiği litik döngüye girerler.
Yeni birleştirilmiş enfektif fajlar, hücre lizisi yoluyla salınır.
Kültür örneklerini belirlenen aralıklarla toplayın.
Canlı, indüklenmemiş lizojenleri saymak için, her örneğin seri dilüsyonlarını bir agar plak üzerine damlatın ve inkübe edin.
Koloni oluşturan birimlerin (CFU) hesaplanması için kolonileri sayın.
İnfektif fajları saymak için, aynı dilüsyonları antibiyotikle önceden ekim yapılmış, antibiyotiğe dirençli indikatör konak hücrelerin bulunduğu bir antibiyotik agar plağına damlatın. Lizojenler antibiyotiğe duyarlı olduğundan, sadece dirençli konaklar büyüyebilir.
Fajlar hücreleri enfekte ederek lizize eder ve net plaklar oluşturur.
Plak oluşum birimlerini (PFU) hesaplamak için plakları sayın. Daha düşük PFU değerleri, daha az spontan indüksiyon olayını gösterir.
CFU ve PFU değerlerini zamana karşı grafiğe aktarın. Bakteriyel büyümenin erken eksponansiyel fazında, PFU değerleri CFU'lara oranla en düşük seviyededir; bu durum, minimal spontan faj indüksiyonuna işaret eder.
Başlamak için, gece boyu büyütülen kültürleri 1:100 oranında 100 mL LB içerisine inoküle ederek taze lizojen ve indikatör konak kültürleri hazırlayın. 37 °C'de, 180 rpm hızında çalkalayarak inkübe edin.
Lizojen büyümesini izlemek için, inokülasyon anından itibaren sekiz saat boyunca her saat başı bir mililitre örnek toplayın. Kültürü, 100 mikrolitreyi 900 mikrolitre LB besiyerine ekleyerek seri olarak seyreltin. Maksimum hızda vorteksleyin ve seyreltme serisini 10⁻¹'den 10⁻⁹'a kadar devam ettirin.
Gerekli seyreltmeden 10 µL'yi bir LB agar plakasına damlatın. Kurumasını bekleyin ve 30 °C'de 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra koloni sayısını sayın ve verilen formülü kullanarak canlı bakteri hücre sayısını hesaplayın.
Ardından, zamansal örnekteki enfektif faj partiküllerini saymak için, eritilmiş üst agara rifampisin ile birlikte 100 mikrolitre log fazı rifampisin dirençli indikatör konak hücre ekleyin. Seri dilüsyon uygulanmış lizojen kültüründen 10 mikrolitreyi, ekili üst agar tabakasına damlatın. Kurumaya bırakın ve 37 santigrat derecede 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin.
İnkübasyon sonrası plak sayısını sayın ve verilen formülü kullanarak enfektif faj partiküllerini hesaplayın.