Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon
22 Ağustos 2007
Bu video kültür nöronlar için mikroakışkan bir cihaz farbricate için kullanabileceğiniz Polidimetil siloksan (PDMS) ile yumuşak litografi tekniği göstermektedir.
Dr.Newly John'un laboratuvarına hoş geldiniz. John Lab, biyolojik uygulamalar için mikroakışkan platformların mühendisliğinde uzmanlaşmıştır. Bu videoda, birincil nöronların bölümlere ayrılması ve kültürlenmesi için tasarlanmış bir mikroakışkan cihazın üretimini ve kullanımını göstereceğiz.
Nöron cihazı ilk olarak 2005 yılının Ağustos ayında Nature Methods'da yayınlandı. Piyasaya sürülmesinden bu yana, nöron cihazı tüm dünyadaki işbirlikçiler tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. Nöron cihazı, daha önce fotolitografi ile oluşturulan, cihazın bir SUA modelini içeren bir silikon gofret üzerine dökülmüş bir PDMS parçasından oluşur.
Cihazın üç ana özelliği, dört rezervuarı, sekiz milimetre çapında, her biri 1,5 milimetre genişliğinde, yedi milimetre uzunluğunda ve yüz mikron yüksekliğinde iki ana kanal ve iki ana kanalı birleştiren 10 mikrometre genişliğinde ve üç mikrometre yüksekliğinde mikro oluklar bulunmaktadır. Mikro olukların uzunluğu 150 mikron ila 900 mikron arasında değişebilir, ancak tercih edilen standart uzunluk 450 mikrondur. Cihazı ana kanallar ve mikro oluklar dikey olacak şekilde gözlemleyerek, olukların solundaki rezervuarların ve sağdaki rezervuarların ana kanallar üzerinden bağlandığını görebiliriz.
Bu özellik, sıvının ana kanaldan akmasına izin verir, bu da önemli bir özelliktir ve hücrelerin yüklenmesini ve medyanın değiştirilmesini mümkün kılar. Nöron cihazı, geleneksel doku kültürü platformlarına göre üç büyük avantaja sahiptir. Birincisi, hücre gövdelerinin veya soma ve aksonların kompartmanalizasyonuna izin verir Nöron cihazı ile saf aksonal fraksiyonlar elde etmek mümkündür.
Mikro olukların boyutu ve uzunluğu, aksonların diğer ana kanaldan geçmesine izin verirken, testere gövdelerinin geçmesini de engeller. İkincisi, cihazın tasarımı ve hidrostatik basınçtan yararlanılması nedeniyle, cihazın hücre tarafını ve/veya akson tarafını, cihazın bir tarafındaki hacmi ve rezervuarları diğer tarafa göre daha yüksek tutarak ayrı işlemlere tabi tutmak mümkündür. Ve üç numara, cihazın saf aksonal fraksiyonu, araştırmacının aksonal rejenerasyonu incelemesine ve gözlemlemesine izin veren vakum emme ile kesilebilir.
Araştırmacı Hina Lee şimdi mikroakışkan nöron cihazını hazırlamayı gösterecek. Poli dimetil Sloane PDMS mikroakışkan kalıbını dökmek için bir fotolitografi ile SU sekizden yapılmış bir desene sahip üç Ang silikon gofret kullanılır. SUA desenli silikon gofretlere ana kalıplar veya basitçe ustalar diyoruz.
PDMS, 10'a bir ağırlık oranı için bir ağırlıkta kürleme maddesi ile karıştırılır. Bu, örneğin, 1.5 gram kürleme maddesi başına 15 gram PDMS'dir. PDMS daha sonra iyice karıştırılır ve silikon gofret üzerine dökülür.
Silikon gofret, 10 santimetrelik bir polistiren Petri kabı içinde bulunur. Yaklaşık dört milimetre kalınlığındaki MA'ları kaplamak için yaklaşık 12 gram ila 15 gram PDMS gerekir. PDMS'li master daha sonra Petri kabının kapağı kapalı olacak şekilde bir vakumlu kurutucuya yerleştirilir ve vakum uygulanır.
Bu, kürleme maddesinin karıştırılması sırasında ortaya çıkan PDMS'den hava kabarcıklarının giderilmesine yardımcı olmak için yapılır. Hava kabarcıklarının giderilmesi yaklaşık 15 dakika sürer. PDMS'li master, vakumlu kurutucuda 15 dakika sonra kurutucudan çıkarılır.
PDMS master'da hala birkaç baloncuk kaldı. Kalan kabarcıkları gidermek için 0,45 mikron filtreli bir hava tabancası kullanılır. Master daha sonra kürlenmesi için bir saat boyunca 80 derecelik bir sıcak plakaya yerleştirilir.
Vakumlu kurutucu mevcut değilse, master birkaç saat oda sıcaklığında bırakılabilir. Hava kabarcıkları sonunda kendi kendine dağılacaktır. Sıcak plaka yoksa, PDMS 24 saat sonra oda sıcaklığında kürlenecektir.
Kürleme işlemi sırasında ustanın düz olduğundan emin olmak önemlidir. PDMS master üzerinde sertleştirildikten sonra, cerrahi bir bıçak kullanılarak temiz bir başlığa alınır. Cihazların çevresi etrafında bir daire kesilir.
Silikon gofret ile temas etmek için bıçağı PDMS'ye soktuğunda, ancak gofret üzerine çok fazla baskı uygulamamak önemlidir, aksi takdirde master, cihazların etrafını tamamen kesen bir daire ile çatlar. Her üç inçlik silikon ustası için dört cihaz vardır. PDMS, master'dan dikkatlice kaldırılır.
Bu, cerrahi bıçağın önceki kesime yerleştirilirken hafifçe döndürülmesiyle başlatılabilir. Kalıp üzerindeki PDMS cihazları ile gerçekten incedir. Yüz yukarı rezervuarlar, sekiz milimetrelik bir doku biyopsisi zımbası kullanılarak cihaza delinir.
Zımbada kalan kalıntılar bir çubukla dışarı itilir. Cihazlar daha sonra dörde bölünür ve fazla PDMS, cihazın bir Corning kapağına düzgün bir şekilde oturması için kesilir. Bir numaralı cam boyutu 24 milimetreye 40 milimetre nitrojen havası, fazla kalıntıları üflemek için kullanılır.
İnatçı kalıntılar 3M Scotch Marka 4 7 1 vinil bant kullanılarak da çıkarılabilir. Temiz cihazlar artık plazma yapıştırma için hazırdır. Nöron cihazlarını kısa bir süre kapak kızaklarına bağlamak için bir herrick plazma temizleyici kullanılır.
Cihazlar ve kapak kızakları bir tepsiye yerleştirilir ve tepsi daha sonra plazma temizleyiciye ve haznedeki havayı boşaltmak için kullanılan bir vakum pompasına yerleştirilir. PDMS cihazlarının yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğine dikkat etmek önemlidir. Yani, plazma gazına maruz kalacakları şekilde tasarım yukarı bakacak şekilde.
Vakum basıncı 300'e ulaştıktan sonra, militorr gücü elektrik bobinine çevrilir ve yükseğe ayarlanır. Odaya biraz hava girmesine izin vermek için her şey kapıda çatlar, bu da plazmanın üretilmesine yardımcı olur. Cihazlar ve kapak camı iki dakika boyunca plazma işlemine tabi tutulur.
Odadaki mor renge dikkat edin. İşte gerçek plazma budur. Elektrik bobini, elektronlar, iyonlar ve nötr atos veya moleküllerden oluşan kısmen iyonize bir gaz olan plazmayı oluşturur.
Plazma, camın ve cihazın yüzeyinde, bir araya getirildiğinde kalıcı bir bağ oluşturacak olan reaktif türler oluşturur. Plazma ayrıca yüzeyin hidrofilik hale gelir ve bu da sıvıların eklenmesini kolaylaştırmaya yardımcı olur. Plazma temizleyici ayrıca cihazları sterilize eder.
İki dakika boyunca plazma işleminden sonra, vakumdaki güç kapatılır ve hava hazneye yönlendirilir. Camın ve mikroakışkan cihazın plazma ile muamele edilmiş servisleri, temiz bir tezgahta birbirleriyle temas edecek şekilde monte edilir. Cihazlar daha sonra 60 milimetrelik steril bir tabağa yerleştirilir.
Camın ve cihazın plazma ile işlenmiş yüzeyleri sıkı, geri dönüşü olmayan bir bağ oluşturur. Plazma bağlanmasından 10 dakika sonra, cihaz cama poliol lizin eklenir. 10 dakika sonra, cihazın hidrofilikliği azalacaktır.
PLL'nin cihaza girmesini zorlaştırır. PLL eklendikten sonra cihazda hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Mevcut hava kabarcıklarını çıkarmanın kolay bir yöntemi, 100 mikrolitre sıvı ile doldurulmuş bir P 200 pipet kullanmaktır.
Bu durumda, PLL ucu doğrudan ana kanalın açıklığına yerleştirin, ardından P 200'e kuvvetlice basın. Bunun birkaç kez tekrarlanması gerekebilir, ancak sonunda pipetten gelen kuvvet baloncukları dışarı çıkaracaktır. PLL içeren cihazların gece boyunca inkübe etmesine izin verilir ve standart bir doku kültürü inkübatörü 37 derecede %5 CO2 ile inkübe edilir.
PLL ile 24 saatlik inkübasyondan sonra, cihazlar otoklav deiyonize su ile iki kez hızlı bir şekilde durulanır. Bu işlem sırasında sıvı hiçbir zaman ana kanallardan tamamen uzaklaştırılmaz, sadece rezervuarlardan uzaklaştırılır. Sıvının ana kanallardan çıkarılması kabarcıklara neden olacaktır.
İki hızlı durulamadan sonra, cihazlar bir kez daha otoklav deiyonize su ile doldurulur ve en az üç saat veya gece boyunca inkübatöre geri yerleştirilir. Ertesi gün, cihazlar gece boyunca veya en az üç saat su ile inkübe edildikten sonra, bir kez daha biyogüvenlik kabinine getirilir ve deiyonize su ile iki kez durulanır. Daha sonra birincil sıçan nöronlarını kültürlemek için gerekli takviyeleri, B 27 ve glutamat içeren nöral bazal ortam cihazlara eklenir.
Cihazlar daha sonra ileride kullanılmak üzere inkübatöre geri yerleştirilir. Cihazlar artık nöronları oturtmak için hazır. Bu videoda, nöron cihazlarımızı üretmek için kullandığımız yumuşak litografi tekniğini gösterdik.
Bu cihazlar, nöronları ve diğer ilgili hücre türlerini kültürlemek için kullanılabilir. Bu cihazların birincil avantajı, cihazın bir tarafındaki nöron hücre gövdelerinin kültürünü, cihazın diğer tarafındaki saf bir aksonal fraksiyondan ayırma ve bölümlere ayırma yeteneğidir. Bir sonraki videoda sizlere E 18 fetal rack kortikal nöronları nasıl hazırladığımızı ve hücreleri cihaza nasıl yüklediğimizi göstereceğiz.
İşte John Lab'den bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler.
Genel Bakış
Bu video, nöron kültürü için mikroakışkan cihaz üretmek üzere polidimetilsilozan (PDMS) kullanarak yumuşak litografi tekniğini gösterir. Cihaz, nöron hücre gövdelerinin ve aksonlarının bölümlendirilmesine olanak tanır ve nörobiyolojideki ileri çalışmaları kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Mikroakışıkanlar
- Hücre Kültürü Teknikleri
Arka Plan
- Nöron cihazı ilk olarak Ağustos 2005'te Nature Methods'ta yayınlanmıştır.
- Dünya çapında araştırmacılar tarafından yaygın olarak benimsenmiştir.
- Cihaz, silikon yonga üzerine dökülen PDMS'den yapılır.
- Nöron kültürü için tasarlanmış rezervuarlar ve kanallar içerir.
Çalışmanın Amacı
- Nöron kültürü için mikroakışkan cihazın üretimini göstermek.
- Bu cihazın geleneksel doku kültürü platformlarına göre avantajlarını vurgulamak.
- Nöron cihazının hazırlanması için ayrıntılı bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- PDMS'i kürleşme maddesi ile belirli bir oranda karıştırmak.
- PDMS'teki hava kabarcıklarını çıkarmak için vakum kurutucu kullanmak.
- PDMS'i bir ısı tabağı üzerinde veya oda sıcaklığında kürlemek.
- Gelişmiş işlevsellik için PDMS cihazlarını kapak kaydıraklarına plazma yapıştırmak.
Ana Sonuçlar
- Cihaz, hücre gövdelerinin ve aksonların bölümlendirilmesine olanak tanır.
- Farklı bölümlere ayrı tedaviler uygulanmasını sağlar.
- Araştırmacılar, çalışma için saf aksonal fraksiyonlar elde edebilir.
- Tasarım, aksonal rejenerasyonun gözlemlenmesini kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Mikroakışıkan nöron cihazı, nörobilimlerde araştırma için değerli bir araçtır.
- Nöronal davranış ve rejenerasyon çalışmaları için önemli avantajlar sunar.
- Üretim süreci araştırmacılar için ayrıntılı ve tekrarlanabilirdir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Compartmentalized microfluidic platforms enable precise spatial control of neuronal subpopulations, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By isolating soma and axon compartments, these systems facilitate mechanistic de-risking of therapeutic candidates through compartment-specific treatment and readout. This approach enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological noise and improving assay specificity for axonal regeneration and neuroprotection studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal and somal compartments for independent manipulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through compartment-specific treatment and readout of axonal integrity.
- Predictive Value: Increases confidence in lead compounds by reducing confounding signals from cell bodies in axonal assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal systems for downstream compound screening with compartmentalized readouts.
- Operational Value: Standardizes axonal isolation and culture conditions, improving reproducibility across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates platform reuse for multiple targets and therapeutic modalities in neuroscience discovery.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal architecture from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of target engagement and pathway modulation in axons without somatic interference.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on axonal regeneration or degeneration phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic neuron device integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, enabling compartment-specific analysis at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating axonal responses to therapeutic perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative axonal readouts for reliable compound evaluation in neurodegeneration programs.
- Analytics: Generates compartment-specific measurements (e.g., axonal outgrowth, degeneration) that enable objective comparison of treatment conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by preserving neuronal polarity and enabling biomarker-aligned axonal assays.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform across multiple projects, reducing redevelopment costs and ensuring consistent neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in axonal vs. somal responses.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of neuronal compartmentalization assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in neurodegeneration portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on compartment-specific efficacy and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum desiccators, and precision fabrication tools for master mold preparation.
- Necessitates cross-team standardization of fabrication protocols and quality control for device-to-device consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to human iPSC-derived neurons or disease models with altered neurite dynamics.
- Includes practical limitations such as device fouling over long-term culture and the need for media maintenance to prevent channel bubbling.
