iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tek tek nükleotid çözünürlüğünde bir RNA bağlayıcı proteinin bağlanma bölgelerinin transkriptom genişliğinde bir haritasını elde etmektir. Bu, canlı hücrelerin ikinci bir adım olarak in vivo olarak kovalent çapraz bağlı proteinlere ve RNA'ya UV ışınlaması ile elde edilir. RNA bağlayıcı protein, çapraz bağlı RNA fragmanlarını geri kazanmak için sıkı koşullar altında immüno-saflaştırılır.

Sonraki ters transkripsiyon, RNA içindeki çapraz bağ konumu hakkındaki bilgileri koruyan, genellikle bağlı peptitte kesilen CDNA'lar üretir cDNA kütüphanesinin yüksek verimli dizilimine dayalı olarak transkriptom içindeki tüm bağlanma bölgelerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, farklı RNA onik proteinlerinin etkileşiminin RNA işlemeyi nasıl düzenlediği gibi RNA biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, transkriptomumuzun hem performansını hem de çözünürlüğünü artırmamızdır: protein RNA etkileşimlerinin geniş haritaları UV çapraz bağlama doku kültürü hücrelerinin prosedürüne başlamak için.

Ortamı 10 santimetrelik bir şifacı hücre plakasından çıkarın. Altı mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve plakaları buzun üzerine yerleştirin. Üç deney için bir plaka yeterlidir.

Kapağı çıkarın ve hücreleri ışınlayın. Santimetre kare başına 150 milijoule ile 254 nanometrede bir kez, hücreleri bir hücre kaldırıcı ile plakalardan kazıyarak hasat edin, hücreleri pelet yapmak için üç mikro tüpün her birine iki mililitre hücre süspansiyonu aktarın. Onları dört santigrat derecede 10 saniye boyunca en yüksek hızda döndürün.

Daha sonra supinat çıtçıtını çıkarın, hücre peletlerini kuru buz üzerinde dondurun ve kullanana kadar eksi 80 santigrat dereceye kadar saklayın. Taze bir mikro tüpe deney başına bir dyna boncuk olan 100 mikrolitre protein ekleyin. Fare veya keçi antikorları ile çalışıyorsanız, protein G dyna boncukları kullanın.

Boncukları, ekteki yazılı protokolde bulunan lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Boncukları iki ila 10 mikrogram antikor ile 100 mikrolitre lizis Tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpü oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika döndürün.

Daha sonra boncukları 900 mikrolitre lizis tamponu ile üç kez yıkayın ve devam etmeye hazır olana kadar son yıkamada bırakın. Buz üzerinde immünopresipitasyon Thor hücre sarayı. Resus, bir mililitre lizis tamponunda süspanse edilir ve 1.5 mililitrelik bir mikro tüpe aktarılır.

Bir ila 500 RNA seyreltmesi hazırlayın. Daha sonra hücreye iki mikrolitre turbo DNA ile birlikte 10 mikrolitre ekleyin. Lizat. Numuneleri 37 santigrat derecede tam olarak üç dakika inkübe edin, dakikada 1.100 dönüşte sallayın, hemen buza aktarın.

Daha sonra, lizatı temizlemek için numuneleri dört santigrat derecede ve 22.000 kez yerçekiminde 20 dakika döndürün, SUP natantını dikkatlice toplayın ve boncukları immüno-çökeltmek için pelet ile yaklaşık 50 mikrolitre lizat bırakın. Yıkama tamponunu çıkarın, ardından hazırlanan hücre lizatlarını ekleyin. Numuneleri dört santigrat derecede iki saat döndürün.

SUP ajanını atın ve boncukları, ekteki yazılı protokolde bulunan 900 mikrolitre yüksek tuz tamponu ile iki kez yıkayın. Son olarak, boncukları 900 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Daha sonra fosforile etmeye devam edin ve RNA'nın üç asal ucuna bir bağlayıcı ekleyin.

RNA'yı etiketlemek için, bir pleksiglas kalkanın arkasında çalışan beş asal uç. Bağlayıcı ligasyon reaksiyonunun son yıkamasından supinatı çıkarın ve boncukları sekiz mikrolitre sıcak PNK karışımında yeniden süspanse edin. 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Sıcak PNK karışımını çıkarın ve yeniden kullanın. Boncukları 20 mikrolitrelik bir kez yeni sayfa yükleme tamponunda askıya alın. Daha sonra numuneyi bir termo karıştırıcı üzerinde 70 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Boş boncukları çökeltmek için numuneyi hemen bir mıknatısın üzerine yerleştirin. Örnekleri dört ila %12 arasında yeni bir sayfaya yükleyin. Biss jeli üreticinin talimatlarına göre.

Ayrıca, önceden boyanmış bir protein boyutu işaretleyicisinden beş mikrolitre yükleyin. Jeli 180 voltta 50 dakika çalıştırın. Protein RNA komplekslerini, üreticinin talimatlarına göre NOVA ıslak transfer aparatını kullanarak jelden bir nitroselüloz membrana aktarın.

Transferden sonra, zarı PBS tamponunda durulayın. Daha sonra Saran sargısına sarın ve eksi 80 santigrat derecede filme maruz bırakın. 30 dakika, bir saat ve gece boyunca pozlama yapın.

Daha sonra, zar bölgesini düşük RNA'lardan protein RNA komplekslerine göre izole edin. Oto radyografı maske olarak kullanarak deney yapın. Proteinaz K sindirimi ve fenol kloroform ekstraksiyonu ile RNA'yı zardan geri kazanın.

CDNA'yı jelleştirmek için AYP primerlerinden birini kullanarak RNA'yı ters çevirin. Altı mikrolitre CDNA örneğini altı mikrolitre iki kez TBE üre yükleme tamponu ile karıştırın. Numuneleri bir jel üzerine yüklemeden hemen önce.

Numuneleri üç dakika boyunca 80 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra numuneleri, düşük moleküler ağırlıklı bir işaretleyici ile birlikte prekast %6 TBE üre jeli üzerine yükleyin. Eksizyonu yönlendirmek için üst boyayı ve plastik jel desteği üzerindeki işaretleri kullanarak, üretici tarafından tarif edildiği gibi jelin 180 voltta 40 dakika çalışmasına izin verin.

120 ila 200 nükleotid, 85 ila 120 nükleotid ve 70 ila 85 nükleotidde üç bant kesin. Ark dudağı astarı ve L üç dizisinin birlikte klip dizisinin 52 nükleotidini oluşturduğuna dikkat edin. 400 mikrolitre te ekleyin ve jel dilimini küçük parçalar halinde ezin.

Bir mililitrelik şırınga pistonu kullanarak, jel parçalarını 37 santigrat derecede iki saat boyunca dakikada 1.100 dönüşte çalkalayarak inkübe edin. İki adet bir santimetrelik cam ön filtreyi bir CoStar spinx sütununa yerleştirin. Numunenin sıvı kısmını, dakikada 13.000 dönüşte bir dakika boyunca 1.5 mililitrelik bir tüpe kolon dönüşüne aktarın.

0.5 mikrolitre gliko mavisi ve 40 mikrolitre sodyum asetat pH 5.5 ekleyin. Ardından numuneyi karıştırın. Bir mililitre% 100 etanol ekleyin.

Tekrar karıştırın ve numuneyi gece boyunca eksi 20 santigrat derecede çökeltin. Son olarak, adaptör bölgesini beş asal uca bağlamak için CD NA moleküllerini dairesel hale getirin. Daha sonra, göz klipsi kütüphanesinin dizilenmesinden önce eşlik eden yazılı protokole göre yeniden doğrusallaştırın ve PCR amplifiye edin, deneyin başarısı iki adımda izlenebilir.

Membran transferinden sonra protein RNA kompleksinin otoradyo grafisi ve düşük RNA örneklerinin oto radyografisinde PCR ürünlerinin jel görüntüsü, yüksek RNA örnekleri için proteinin moleküler ağırlığının üzerinde yaygın radyoaktivite görülmelidir. Bu radyoaktivite, proteinin moleküler ağırlığına daha yakın odaklanır. İmmünopresipitasyonda antikor kullanılmadığında, hiçbir sinyal tespit edilmemelidir.

İmmünopresipitasyonun özgüllüğü için diğer önemli kontroller ya UVE ışınlaması yayar ya da ilgilenilen proteini ifade etmeyen hücreleri kullanır. PCR ürünlerinin jel görüntüsü, CD NA fraksiyonuna karşılık gelen bir boyut aralığı göstermelidir. PCR primerleri, P üç Celexa ve P beş Celexa'nın, CD NA'nın boyutuna ek bir 76 nükleotid eklediğine dikkat edin. İmmünopresipitasyon sırasında herhangi bir antikor kullanılmazsa, karşılık gelen bir PCR ürünü tespit edilmemelidir.

Bu prosedürü denerken, 64 adımın her birinin kritik olduğunu ve yüzde yüz doğrulukla gerçekleştirilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. ICL verileri, transkriptum çapında fonksiyonel testlerle hesaplamalı olarak entegre edilebilir. Bu, örneğin, RNA işlemenin konuma bağlı düzenlemesi hakkında bilgi edinebilir.

Hesaplamalı veri analizi için, Nicholas KA Avrupa Biyoinformatik Enstitüsü ve Liana Üniversitesi'nden bla zupan ile işbirliği içinde yaptığımız son yayınlarımıza başvurmak istiyoruz. Ve şimdi kendi deneylerinize başlamanın zamanı geldi. İyi eğlenceler.