Name: iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Öğrenin, iCLIP yöntemiyle RNA bağlayıcı proteinlerin bağlanma bölgelerini tek nükleotid çözünürlüğünde transkriptom genişinde haritalamayı. UV çapraz bağlama ve immünopresipitasyon kullanarak post-transkripsiyonel düzenlemeyi inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, tartışma ve deney yardım için ULE Luscombe ve Zupan laboratuarlarında tüm üyelerine teşekkür ediyorum. James Hadfield ve Nik Matthews, yüksek verimlilik sıralaması için teşekkür ederim. Biz hisselerinin iCLIP yöntemi burada Kirk Jensen ve JU Robert Darnell laboratuar tarafından geliştirilen orijinal CLIP protokolü ile birkaç adımda açıklanan işaret etmek istiyorum. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi hibe 206.726-JU ve JK Uzun vadeli İnsan Frontiers Lisans Programı burs CLIP tarafından desteklenen

1. UV çapraz bağlayarak hücreleri, doku kültürü <ol><li> Ortamı çıkarın ve 10 cm plaka (üç deneyler için yeterli) yetiştirilen hücreler 6 ml buz gibi soğuk PBS ekleyin. </li><li> Kapak ve buz üzerinde yer çıkarın. 150 254 nm'de mJ / cm 2 ile bir kere ışın tedavisi. </li><li> Bir hücre kaldırıcı kazıma hücreleri tarafından Hasat. </li><li> 2 ml hücre süspansiyonu, her üç mikrotüpler aktarın. 10 saniye boyunca en yüksek hızda Spin 4 ° C pelet hücrelerine, daha sonra süpernatant kaldırmak. </li><li> Snap-, donma -80, kuru buz ve mağaza hücre pelet ° C kullanana kadar. </li></ol> 2. Boncuk hazırlık <ol><li> 100 protein ul taze bir mikrotüp Deneme başına Dynabeads (Dynal 100,02) (fare veya keçi antikorları için protein G Dynabeads kullanın). </li><li> 2x boncuk lizis tamponu (100 mM NaCl,% 1 NP-40,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolatın; 1 / 100 proteaz inhibitörü kokteyl III Calbiochem 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) ile yıkayın </li><li> 2-10 mg antikor ile 100 ul lizis tamponu boncuk tekrar </li><li> Oda sıcaklığında 30-60 dk tüpler döndürün. </li><li> 900 ul lizis tamponu ile 3x yıkayın ve son yıkama 4.1 adım ilerlemek için hazır olana kadar bekletin. </li></ol> 3. Hücre parçalama ve kısmi RNA sindirim <ol><li> 1 ml lizis tamponu ve 1.5 ml mikrotüp transfer hücre pelletini tekrar. </li><li> RNaz (Ambion, AM2295) 1 / 500 dilüsyon hazırlayın. [10 ul RNaz I seyreltme yanı sıra hücre lizat 2 ul Turbo DNaz ekle (1 / 500 RNaz I dilüsyonları düşük RNaz] kütüphane hazırlanması için kullanılır; 1 / 50 dilüsyonları [yüksek RNaz] antikor özgüllüğü kontrol etmek için gerekli) . </li><li> Tam 3 dakika 37 ° ° C, 1.100 rpm'de sallayarak örnekleri inkübe edin. Hemen buz transfer. </li><li> 4 Spin ° C ve lizat temizlemek için 20 dakika süreyle 22.000 gr. Dikkatle (pelet ile yaklaşık 50 ul lizat bırakın) süpernatantı toplamak. </li></ol> 4. Immunoprecipitation <ol><li> Boncuk (2.5 adım) yıkama tamponu çıkarın, daha sonra hücre lizat (3.4 adım) ekleyin. </li><li> 2 saat için 4 örnekleri Döndür ° C </li><li> Süpernatantı atın ve 900 ul yüksek tuz tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1 M NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolatın) 2x boncuk yıkayın. </li><li> 900 ul yıkama tamponu (10 mM MgCl 2;% 0.2 Tween-20 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) ile yıkayın 2x </li></ol> 5. RNA 3'ends, Defosforilasyon <ol><li> Süpernatant atın ve 20 ul PNK karışımı boncuklar tekrar süspansiyon (15 ul su; 4 ul 5x PNK pH 6.5 tamponu [350mMTris-HCl, pH 6.5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0.5 ul PNK enzim; 0.5 ul RNasin [Promega]). </li><li> 37 20 dakika boyunca inkübe ° C. </li><li> 500 ul yıkama tamponu ekleyin ve 1x yüksek tuz tamponu ile yıkayın. </li><li> Yıkama tamponu ile 2x yıkayın. </li></ol> 6. 3 'uçları RNA Linker ligasyonu <ol><li> Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve (9 ul su 20 ul ligasyon karışımı boncuklar tekrar süspansiyon; 4 ul 4x ligasyonu tampon [200 mMTris-HCl, 40 MM GCL 2; 40 mM dithiothreitol]; 1 ul RNA ligaz [NEB]; 0.5 ul RNasin [Promega]; 1.5 ul-adenylated öncesi linker L3 [20 mcM]; 4 ul PEG400 [81.170, Sigma]). </li><li> 16 yaşında bir gece inkübe ° C </li><li> 500 ul yıkama tamponu ekleyin ve sonra 1 ml yüksek tuz tamponu ile 2x yıkayın. </li><li> Ikinci yıkama 1 ml 1 ml yıkama tamponu ile 2x ve terk yıkayın. </li></ol> 7. RNA 5 'sonuna etiketleme <ol><li> Süpernatantı ve 8 ul PNK sıcak karışımı boncuklar tekrar süspansiyon (0.4 ul PNK [NEB]; 0.8 ul 32 P-γ-ATP; 0.8 ul 10x PNK tampon [NEB]; 6 ul su). </li><li> 37 5 dakika boyunca inkübe ° C. </li><li> Sıcak PNK karışımı çıkarın ve 20 ul 1x Nupage yükleme tamponu (Invitrogen) boncuk tekrar süspansiyon. </li><li> 70 ° C'de 10 dakika süreyle bir Thermomixer inkübe edin. </li><li> Hemen boş boncuklar (bkz. adım 8) hızlandırabilir ve jel süpernatantı yüklemek için bir mıknatıs yer. </li></ol> 8. SDS-PAGE ve membran transferi <ol><li> % 4-12 NuPAGE üreticinin talimatlarına göre Bis-Tris jel (Invitrogen) numuneleri yükleyin. Tamponu (Invitrogen) 1x MOPS 0,5 l kullanın. Ayrıca bir ön-lekeli protein boyutu işaretleyici (örneğin SAYFA hükümdarı artı Fermentas, SM1811) 5 ul yük. </li><li> 50 dakika için 180 jel çalıştırın V. </li><li> Jel ön çıkarın ve katı atık (ücretsiz radyoaktif ATP içerir) olarak atın. </li><li> Jel (Invitrogen, transferi 1 saat 30 V), üreticinin talimatlarına göre Novex ıslak transfer aparatları kullanarak bir nitroselüloz membran protein-RNA kompleksleri aktarın. </li><li> Aktarımdan sonra, PBS membran durulama, Saran wrap sonra sarın ve -80 ° C (yerinde daha sonra t hizalamak için membran yanında bir floresan etiket Fuji film maruzo film ve membran) 30 dakika, 1 saat ve gece boyunca maruz kalma gerçekleştirmek. </li></ol> 9 - RNA izolasyonu <ol><li> , Bir maske olarak 8.5 adım autoradiograph kullanarak düşük RNaz deney protein-RNA kompleksleri izole edin. Bu parça membran birkaç küçük dilimler halinde kesin ve 1.5 ml mikrotüp içine yerleştirin. </li><li> Ve 10 ul proteinaz K (Roche, 03115828001) 200 ul PK tamponu (10 mM EDTA; 50 mM NaCl 100 mM Tris-HCl pH: 7.4), membran parçaları ekleyin. 1.100 rpm'de 20 dakika süreyle 37 ° sallayarak inkübe ° C </li><li> PKurea tamponu (50 mM NaCl; 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH: 7.4 7 M üre) 200 ul ekleyin ve 37 ° 20 dakika boyunca inkübe ° C. </li><li> Çözüm toplayın ve 2 ml Phase Lock Gel Ağır tüp (713-2536, VWR) kloroform (Ambion 9722) / fenol RNA 400 ul ile birlikte ekleyin. </li><li> 1,100 rpm hızında titreme, 5 dakika 30 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında 13.000 rpm'de 5 dakika boyunca iplik aşamaları ayırın. </li><li> (Jel pipet ile dokunmamaya dikkat), yeni bir tüp içine sulu aktarın. 0.5 ul glycoblue (Ambion 9510) ve 40 ul 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ve karışımı ekleyin. Daha sonra 1 ml% 100 etanol, -20 ° C'de gece boyunca tekrar karıştırın ve çökelti </li></ol> 10 Ters transkripsiyon <ol><li> Spin 20 dakika için 15,000 rpm ve 4 ° C Süpernatantı ve pelet 0.5 ml% 80 etanol ile yıkayın. </li><li> 7.25 ul RNA / astar karışımı (0.5 ul Rclip astar [0.5pmol/μl]; 0.5 ul dNTP mix [10mM] 6.25 ul su) pelletini tekrar Her deney ya da çoğaltmak için, ayrı ayrı barkod dizileri (14) içeren farklı bir Rclip astar kullanın. </li><li> 5 dakika 70 ° C'de 25 ° C'ye kadar soğutma önce </li><li> 2.75 ul RT karışımı (0.5 ul 0.1M DTT; 0.25 ul Üstsimge III ters transkriptaz [Invitrogen] 2 ul 5x RT tampon) ekleyin. </li><li> 5 dakika 25 ° C'de 20 dakika, 42 ° C, 40 dakika 50 ° C ve 5 dakika 80 ° C 4 soğutma ° C. </li><li> 90 ul TE tampon, 0.5 ul glycoblue ve 10 ul sodyum asetat, pH 5.5 ve karışımı ekleyin. Sonra 250 ul% 100 etanol, -20 ° C'de gece boyunca tekrar karıştırın ve çökelti </li></ol> 11. CDNA, Jel arıtma <ol><li> Spin ve örnekleri yıkayın (10.1), daha sonra 6 su ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 6 ul 2x TBE üre yükleme tamponu (Invitrogen) ekleyin. Isı örnekleri 80 ° C doğrudan yüklemeden önce 3 dk. </li><li> Bir prekast% 6 TBE üre jel (Invitrogen) numuneleri yükleyin ve üretici tarafından açıklandığı gibi 180 V 40 dakika çalıştırın. Ayrıca bir sonraki kesim için (aşağıya bakın) düşük molekül ağırlıklı işaretleyici yükleyin. </li><li> 120-200 nt (yüksek), 85-120 nt (orta) ve 70-85 nt (düşük) az üç bantlarını. (Bkz. Şekil 3) eksizyon kılavuzu theupper boya ve plastik jel destek işaretleri kullanın. CLIP dizisi 52 nt Rclip astar ve birlikte L3 dizisi hesabı unutmayın. </li><li> 400 ul TE ekleyin ve 1 ml şırınga pistonu kullanarak küçük parçalar halinde jel dilim ezmek. 37 az 2 saat süreyle 1.100 rpm'de sallayarak inkübe ° C </li><li> Costar SpinX sütun (Corning Incorporated, 8161) içine iki adet 1 cm cam ön filtreler (whatman 1.823.010) yerleştirin. Sütun örnek sıvı kısmı aktarın. 1 dakika için 1.5 ml tüp içine 13.000 devirde dönerler. </li><li> 0.5 ul glycoblue ve 40 ul sodyum asetat pH 5.5, daha sonra örnek karıştırın. 1 ml% 100 etanol, -20 ° C'de gece boyunca tekrar karıştırın ve çökelti </li></ol> 12. CDNA 5'end astar ligasyonu <ol><li> Inkübe aşağı Spin ve örnekleri yıkayın (10.1), daha sonra 8 ul ligasyon karışımı (0.8 ul 10x CircLigase Tampon II; 0.4 ul 50 mM MnCl 2; 0.3 ul Circligase II [Epicentre] 6.5 ul su) pelet tekrar süspansiyon 60 ° C'de 1 saat </li><li> 30 ul oligo tavlama karıştırın (26 ul su; 3 ul FastDigest Tampon [Fermentas]; 1 ul cut_oligo [10 mcM]). 1 dakika boyunca inkübe 95 ° C Sonra her 20 saniyede 1 sıcaklığını azaltmak ° C 25 kadar ° C ulaşılır. </li><li> 37 ° 2 ul BamHI (Hızlı Fermentas) ve 30 dakika boyunca inkübe ° C </li><li> 50 ul TE ve 0.5 ul glycoblue ve karışımı ekleyin. 10 ul sodyum asetat, pH 5.5 ve karışımı ekleyin, daha sonra 250 ul% 100 etanol ekleyin. -20 ° C'de gece boyunca tekrar karıştırın ve çökelti </li></ol> 13. PCR <ol><li> Spin ve örnekleri yıkayın (10.1), daha sonra 19 ul su pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> (; 1 ul astar karışımı P5/P3 solexa, her 10 mcM; 20 ul Accuprime Supermix 1 enzim [Invitrogen] 19 ul cDNA) PCR karışımı hazırlayın. </li><li> Aşağıdaki PCR programı çalıştırın: 25-35 döngüleri, 68 ° C 'de 3 dakika, 4 [30 saniye 15 saniye, 65 ° C - 94 ° C için 30 saniye, 68 ° C] 94 ° C' de 2 dakika süreyle, ° C sonsuza dek. </li><li> 8 ul PCR ürün karması bir prekast% 6 TBE jel 5x TBE yükleme tamponu ve yük 2 ul (Invitstresin). Leke Sybrgreen I (Invitrogen) jel ve jel görüntüleme cihazı ile analiz. </li><li> Rclip primerler barkod yüksek verimlilik sıralaması için göndermeden önce multipleks farklı örnekleri izin verir. Kütüphane sıralaması için 15 ul gönderin ve geri kalanı saklamak. </li></ol> 14. Linker ve astar dizileri Ön adenylated 3 'linker DNA: [20μM hacimde yapabilir sonra IDT gelen DNA bağdaştırıcısı sipariş.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="DNA"> 15. Temsilcisi Sonuçlar: Deneyinin başarısı için, iCLIP kütüphane sıralanması önce iki adım izlenebilir: autoradiograph membran transferinden sonra protein-RNA kompleksi (adım 8.5) ve PCR ürünlerinin jel (adım 13.4). Düşük RNaz örnekleri autoradiograph, diffüz radyoaktivite protein (Şekil 2, örnek 4) moleküler ağırlığı üzerinde görülmelidir. Yüksek RNaz örnekleri için, bu radyoaktivite yakın proteinin moleküler ağırlığı (Şekil 2, Örnek 3) odaklanmıştır. Hiçbir antikor immunoprecipitation kullanıldığında, herhangi bir sinyal (Şekil 2, 1 ve 2 örnekleri) tespit edilmelidir. Immunoprecipitation özgüllüğü için daha önemli kontrol UV ışını veya ilgi 14 protein ifade kullanımı hücrelerin atlarsanız ya. PCR ürünleri (adım 13.4) jel görüntü adım 11.4 (Şekil 4, şerit 4-6) saflaştırılmış cDNA fraksiyonu (yüksek, orta veya düşük) karşılık gelen bir boyut aralığı göstermelidir. PCR primerleri P3Solexa ve P5Solexa cDNA boyutu için ek bir 76 nt tanıtmak olduğunu unutmayın. Hiçbir antikor immunoprecipitation sırasında kullanılması durumunda, hiçbir karşılık gelen PCR ürünleri (Şekil 4, şerit 1-3) tespit edilmelidir. Primer-dimer ürün yaklaşık 140 nt az görünebilir. 14, yüksek verimlilik sıralama ve daha sonraki biyoinformatik analizleri temsilcisi sonuçlar için bkz . <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 iCLIP protokolü şematik. Protein-RNA kompleksleri UV ışını (adım 1) kullanarak in vivo kovalent çapraz bağlanır. Ilgi protein bağlı RNA (adım 2-5) ile birlikte arındırılır. Ters transkripsiyon sıra özel astar izin vermek için, sonunda radyoaktif (adım 6 ve 7) etiketli bir RNA adaptörü 5 iken, RNA sonu 3 bağlandı. Çapraz bağlı protein-RNA kompleksleri, SDS-PAGE ve membran transferi (adım 8) kullanarak ücretsiz RNA arınmış. RNA protein sindiren proteinaz K nükleotid çapraz bağ (adım 9) kalan bir polipeptid bırakarak membrandan kurtarıldı. Ters transkripsiyon (RT) kalan polipeptid keser ve iki cleavable adaptör bölgeler ve barkod dizileri (adım 10) tanıttı. Boyutu seçimi circularization önce ücretsiz RT astar kaldırır. Aşağıdaki doğrusallaştırma PCR amplifikasyonu için uygun şablonları (adım 11-15) üretir. Son olarak, yüksek verimli sıralama barkod dizileri hemen (adım 16) cDNA son nükleotid tarafından takip edilmektedir hangi okur üretir. Çapraz bağlı nükleotid upstream bu nükleotid bulur bir konum bu yana, bağlama site, yüksek çözünürlüğe sahip çıkarılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 çapraz bağlantılı hnRNP C-RNA kompleksleri Autoradiograph denatüre jel elektroforezi ve membran transferi kullanarak. hnRNP C-RNA kompleksleri hücre özleri hnRNP C'ye karşı bir antikor kullanarak immüno-saflaştırılmış (α hnRNP C, örnekleri 3 ve 4). RNA kısmen düşük (+) veya yüksek kullanılarak sindirilir (+ +) konsantrasyonu RNaz. Proteinin büyüklüğü (40 kDa) yukarı doğru kayması Kompleksleri (örnek 4) görülebilir. RNaz yüksek konsantrasyonlarda (örnek 3) kullanılan zaman kayması daha az belirgindir. Herhangi bir antikor (örnekler 1 ve 2) immunoprecipitation kullanılan radyoaktif bir sinyal kaybolur. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 şematik% 6 TBE-üre jel (Invitrogen) iCLIP cDNA ürünleri eksizyon kılavuzu. Jel, jel cDNAs ve boyalar (mavi ışık ve karanlık) tekrarlanabilir bir göç desen önde gelen 180 V 40 dakika çalıştırın. (Kırmızı çizgi), yüksek (H), orta (M), ve düşük (L) cDNA kesirler kesmek için jilet kullanın. Ortasında açık mavi boya ve plastik jel kaset işareti hemen üzerinde keserek başlayın. Orta ve düşük kesirler Böl ve yaklaşık 1 cm yukarıda açık mavi boya yüksek bir kısmını düzeltin. Farklı şerit (Bu örnekte 1-4) ayırmak için cepler ve boya tarafından yönlendirilen dikey kesikler kullanın. Işaretleyici şeritli (m) lekeli ve kontrol görüntülü olabilirkestikten sonra boyutları. Fragment boyutları sağ tarafta gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 jel elektroforezi kullanılarak PCR-amplifiye iCLIP cDNA kütüphaneleri analizi. RNA ters transkripsiyonu ve boyut-saflaştırılmış denatüre jel elektroforezi (Şekil 2) kullanarak membran (Şekil 1) kurtarıldı. Üç boyut fraksiyonları cDNA (yüksek [H]: 120-200 nt, orta [M]: 85-120 nt ve düşük [L]: 70-85 nt) ele geçirilmiştir circularized, yeniden lineerleştirilmiş ve PCR-amplifiye. Farklı boyut dağılımı PCR ürünleri giriş fraksiyonları farklı boyutlarda bir sonucu olarak görülebilir. PCR primer cDNA 76 nt bu yana, orta ve küçük boyut fraksiyonları için 146-161 nt boyutları, yüksek, 161-196 nt, 196-276 nt arasında aralık olmalıdır. Hiçbir antikor immunoprecipitation (şerit 1-3) için kullanılan PCR ürünleri bulunmaz.

<ol><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+regulation%3A+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> RNA. 14, 802-813 (2008).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1071-1082 (1999).</li>
<li>Brooks, S. A., Rigby, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+mRNA+ligands+bound+by+the+RNA+binding+protein+hnRNP+A2+utilizing+a+novel+in+vivo+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique.</a> Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).</li>
<li>Mili, S., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reassociation+of+RNA-binding+proteins+after+cell+lysis%3A+implications+for+the+interpretation+of+immunoprecipitation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses.</a> RNA. 10, 1692-1694 (2004).</li>
<li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302, 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+A+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37, 376-386 (2005).</li>
<li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456, 464-469 (2008).</li>
<li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).</li>
<li>Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-tracked+approach+to+analyze+RNA-protein+crosslinking+sites+in+native%2C+nonlabeled+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Methods. 26, 170-181 (2002).</li>
<li>König, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).</li>
</ol>

ICLIP protokolü enzimatik reaksiyonları ve saflaştırma adımları çok çeşitli içerdiğinden, bir deney başarısız bir sorun tespit etmek her zaman kolay değildir. Spesifite tespit RNA çapraz bağ siteleri kontrol etmek için, bir veya daha fazla negatif kontroller tam bir deney ve sonraki hesaplama analizleri boyunca muhafaza edilmelidir. Bu kontroller, no-antikor örnek, çapraz bağlantılı olmayan hücreler, ya da nakavt hücre veya doku gelen immunoprecipitation olabilir. İdeal olarak, bu kontrol deneyleri herhangi bir protein-RNA kompleksleri arındırmak gerekir, ve bu nedenle, SDS-PAGE jel üzerinde hiçbir sinyal ve PCR sonra saptanabilir ürün vermelidir. Bu kontrol kütüphaneler Yüksek throughput sıralama çok az benzersiz dizileri dönmelidir. Sonuçlanan dizileri hala, küçük miktarlarda demonte hücrelerden arındırılır aynı protein, çapraz bağ sitelerine karşılık beri demonte hücreleri, bir sıralama kontrolü olarak tavsiye edilmez. Önlemler de önceki deneylerden elde edilen PCR ürünleri ile kirlenmesini önlemek için alınmalıdır. Bu sorunu en aza indirmek için en iyi yolu, pre-ve post-PCR adımları mekansal ayrı. İdeal olarak, PCR ürünleri ve sonraki tüm adımları analizi ayrı bir odada yapılmalıdır. Ayrıca, laboratuvarda her üye, tamponlar ve diğer reaktifler kendi kullanmalıdır. Bu şekilde, kirlenme kaynakları daha kolay tespit edilebilir.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Jel elektroforezi ve membran transferi için biz o XCell SureLock kullanımı tavsiye t ® protokolü boyunca belirtilen farklı prekast minigels kullanımı ile uyumlu olan Mini-Hücre ve XCell II ™ Blot Modülü Kit CE İşareti (Invitrogen, EI0002) . Kullanılan tüm malzemelerin marka ve sipariş numarası, protokol sırasında söz edilmektedir. Protokolde kullanılan enzimlerin listesi aşağıdaki tabloda gösterilmiştir. <table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Proteinler bir Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> fare veya keçi antikor için protein G kullanmak </td></tr><tr><td> RNaz I </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> aktivite, parti toplu değiştirebilirsiniz </td></tr><tr><td> T4 RNA ligaz I </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinaz K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Üstsimge III ters transkriptaz </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II. </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ Supermix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> Bu PCR karışımı elimizde iyi sonuç verir. </td></tr></table>

iclip - bireysel nükleotid Çözünürlük protein-rna etkileşimleri transcriptome geniş haritalama

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Bir transkript RNA bağlayıcı proteinlerin benzersiz kompozisyon ve mekansal düzenleme (RBPs) post-transkripsiyonel yönetmelik 1 farklı yönlerini rehberlik eder. Bu nedenle, moleküler düzeyde transkript yönetmelik anlaşılması yönünde önemli bir adım RBPs 2 bağlanma yerleri konumsal bilgi elde etmektir . Protein-RNA etkileşimleri biyokimyasal yöntemler kullanılarak çalışıldı, ancak bu yaklaşımların kendi doğal hücresel bağlamında bağlayıcı RNA adresi yok. İlk girişimleri kendi hücresel ortamı RNA protein kompleksleri çalışma diferansiyel görüntülemek veya mikroarray analizi (RIP-CHIP) 3-5 ile kombine yakınlık arıtma veya immunoprecipitation çalışmaktadır. Bu yaklaşımlar, dolaylı ya da fizyolojik olmayan etkileşimleri 6 belirlenmesi eğilimli . CLIP (UV çapraz bağlama ve immunoprecipitation) 7,8 tanıtıldı özgüllük ve konumsal çözünürlüğü artırmak için, bir strateji anılacaktır. CLIP UV çapraz bağlama denatüre poliakrilamid jel elektroforez de dahil olmak üzere sıkı arıtma şemaları protein ve RNA molekülleri bir araya getiriyor. Yüksek verim sıralama teknolojileri ile birlikte, CLIP, protein-RNA genom ölçekte etkileşimler (HITS-CLIP veya CLIP-seq olarak anılacaktır) 9,10 çalışmak için güçlü bir araç olarak kanıtlamıştır . Son zamanlarda, PAR-CLIP 11,12 çapraz bağlama photoreactive ribonükleozit analogları kullanan sunuldu. Elde edilen verilerin yüksek özgüllüğü karşın, CLIP deneyler genellikle sınırlı sıra karmaşıklığı cDNA kütüphaneleri oluşturmak. Bu co-saflaştırılmış RNA kısıtlı miktarda ve kütüphane hazırlanması için gerekli olan iki verimsiz RNA ligasyonu reaksiyonlar kısmen. Buna ek olarak, astar uzatma testlerinde birçok cDNAs çapraz nükleotid 13 erken kesmek olduğunu belirtti. Bu kesilmiş cDNAs standart CLIP kütüphane hazırlık protokolü sırasında kaybolur. Biz son zamanlarda daha etkin bir molekül cDNA circularization (Şekil 1) 14 ile verimsiz intermoleküler RNA ligasyonu adımları değiştirerek kesilmiş cDNAs yakalar iCLIP (bireysel nükleotid çözünürlük CLIP) geliştirdi. Önemlisi, kesilmiş cDNAs sıralama nükleotid çözünürlükte çapraz bağ sitenin konumu içgörüler sağlar. Biz iCLIP genom ölçekte hnRNP C parçacık organizasyonun başarılı bir çalışma ve 14 ekleme düzenleme rolünü değerlendirmek için uygulanır .

Transkript RNA bağlayıcı proteinlerin mekansal düzenleme, post-transkripsiyonel regülasyonunda önemli bir belirleyicisidir. Bu nedenle, bir RNA bağlayıcı protein bağlama bölgeleri hassas genom haritalama sağlar bireysel nükleotid çözünürlük UV crosslinking ve immunoprecipitation (iCLIP) geliştirdi.

iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

Bir transkript üzerindeki RNA-bağlayıcı proteinlerin (RBP'ler) kendine özgü kompozisyonu ve uzamsal düzenlemesi, transkripsiyon sonrası sürecin çeşitli yönlerine rehberlik eder...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir RNA bağlayıcı proteinin bağlanma bölgelerinin tek nükleotid çözünürlüğünde transkriptom çapında bir haritasını çıkarmaktır. Bu, ikinci bir adım olarak, proteinlerin ve RNA'nın in vivo olarak kovalent şekilde çapraz bağlanması için canlı hücrelerin UV ışınlamasına tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. Çapraz bağlanmış RNA fragmanlarını geri kazanmak için RNA bağlayıcı protein, katı koşullar altında immünopurifiye edilir.Ardışık ters transkripsiyon, genellikle ekli peptit noktasında kesilen ve böylece RNA içindeki çapraz bağ konumuna dair bilgiyi koruyan cDNA'lar üretir. cDNA kütüphanesinin yüksek verimli sekanslaması sonucunda, transkriptom içindeki tüm bağlanma bölgelerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, farklı RNA bağlayıcı proteinlerin etkileşiminin RNA işlemeyi nasıl düzenlediği gibi RNA biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protein-RNA etkileşimlerinin transkriptom genelindeki haritalarının hem performansını hem de çözünürlüğünü artırmamızdır. Doku kültürü hücrelerinin UV çapraz bağlama prosedürüne başlamak için.10 santimetrelik bir healer hücresi plağından besiyerini uzaklaştırın. Altı mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve plakaları buz üzerine yerleştirin. Bir plak üç deney için yeterlidir.Kapağı çıkarın ve hücreleri ışınlayın. 254 nanometrede, santimetrekare başına 150 milijoule ile işlem tamamlandığında, hücreleri bir hücre kaldırıcı yardımıyla plakalardan sıyırarak toplayın; hücreleri çöktürmek için her bir mikro tüpe iki mililitre hücre süspansiyonu aktarın. Hücreleri 4 °C'de, maksimum hızda 10 saniye boyunca santrifüjleyin.Ardından süpernatan şapı kaldırın, hücre peletlerini kuru buz üzerinde dondurun ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Her deney için yeni bir mikrotüpe 100 µL protein dyna beads ekleyin. Fare veya keçi antikorları ile çalışılıyorsa, protein G dyna beads kullanın.Boncukları, beraberindeki yazılı protokolde belirtilen lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Boncukları, 2 ila 10 µg antikor içeren 100 µL lizis tamponu içinde yeniden süspande edin. Tüpü oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca döndürün.Ardından boncukları üç kez 900 µL lizis tamponu ile yıkayın ve işleme devam etmeye hazır olana kadar son yıkama çözeltisinde bekletin. İmmünopresipitasyon için buz üzerinde Thor hücre pelletini yeniden süspande edin; bir mL lizis tamponu içinde süspande ederek 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.RNA'lardan birini 1/500 oranında seyreltin. Ardından, hücre lizatına 10 µL seyreltilmiş RNA ile birlikte 2 µL turbo DNA ekleyin. Örnekleri 37 °C'de, dakikada 1.100 devirle çalkalayarak tam olarak üç dakika boyunca inkübe edin ve hemen buza aktarın.Ardından, lizatı berraklaştırmak için örnekleri 4 °C'de ve 22,000 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin; boncukları immünopresipite etmek için pelet ile birlikte yaklaşık 50 µL lizat bırakarak süpernatanı dikkatlice toplayın. Yıkama tamponunu uzaklaştırın, ardından hazırlanan hücre lizatlarını ekleyin. Örnekleri 4 °C'de iki saat boyunca rotasyona bırakın.SUP ajanını atın ve boncukları, ekteki yazılı protokolde bulunan 900 mikrolitre yüksek tuz tamponu ile iki kez yıkayın. Son olarak, boncukları 900 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, RNA'nın üç prime uçlarını defosforile etme ve bir bağlayıcı ekleme işlemine geçin.RNA beş prime uçlarını etiketlemek için işlemi bir pleksiglas kalkan arkasında gerçekleştirin. Linker ligasyon reaksiyonunun son yıkamasındaki süpernatantı uzaklaştırın ve boncukları sekiz µL sıcak PNK karışımı içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de beş dakika inkübe edin.Sıcak PNK karışımını uzaklaştırın ve yeniden kullanın. Boncukları 20 µL bir kat yeni sayfa yükleme tamponu içerisinde süspande edin. Ardından örneği bir termo mikserde 70 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.Boş boncukları çöktürmek için örneği hemen bir mıknatıs üzerine yerleştirin. Üretici talimatlarına göre, örnekleri %4 ila %12'lik yeni bir SDS-PAGE jeline yükleyin.Ayrıca, beş µL ön boyamalı protein boyut belirteci yükleyin. Jeli 180 voltajda 50 dakika boyunca çalıştırın. Protein RNA komplekslerini, üretici talimatlarına uygun olarak NOVA ıslak transfer cihazını kullanarak jelden nitroselüloz membrana aktarın.Transfer işleminden sonra, membranı PBS tamponu ile durulayın. Ardından Saran wrap ile sarın ve eksi 80 °C'de filme pozlayın. Pozlama işlemlerini 30 dakika, bir saat ve gece boyunca gerçekleştirin.Ardından, düşük RNA miktarlarına göre protein RNA komplekslerinden membran bölgesini izole edin. Maske olarak autoradyogramı kullanarak deney yapın. Proteinaz K sindirimi ve fenol kloroform ekstraksiyonu ile RNA'yı membrandan geri kazanın.cDNA'yı jel ile saflaştırmak için AYP primerlerinden birini kullanarak RNA'yı ters transkribe edin. Altı mikrolitre cDNA örneğini altı mikrolitre 2x TBE üre yükleme tamponu ile karıştırın. Örnekleri jele yüklemeden hemen önce.Numuneleri üç dakika boyunca 80 °C'ye ısıtın. Ardından, numuneleri düşük moleküler ağırlıklı bir marker ile birlikte önceden hazırlanmış %6 TBE üre jeline yükleyin. Üst boyayı ve plastik jel desteği üzerindeki işaretleri kesim işlemi için kılavuz olarak kullanarak, jelin üretici tarafından belirtildiği şekilde 180 volt değerinde 40 dakika boyunca çalışmasına izin verin.120 ila 200 nükleotid, 85 ila 120 nükleotid ve 70 ila 85 nükleotid boyutunda üç bant kesin. Arc lip primer'ının ve L üç dizisinin birlikte klip dizisinin 52 nükleotidini oluşturduğunu unutmayın. 400 µL TE ekleyin ve jel dilimini küçük parçalara ayırın.Bir mililitrelik şırınga pistonu kullanarak gel parçalarını 37 °C'de, dakikada 1.100 devirle çalkalayarak iki saat boyunca inkübe edin. Bir CoStar spinx kolonuna iki adet bir santimetrelik cam ön filtre yerleştirin. Numunenin sıvı kısmını kolona aktarın ve dakikada 13.000 devirle bir dakika boyunca 1,5 mililitrelik bir tüpe santrifüjleyin.0.5 µL glyco blue ve pH 5.5 sodyum asetatın 40 µL'sini ekleyin. Ardından numuneyi karıştırın. 1 mL %100 etanol ekleyin.Tekrar karıştırın ve örneği -20 °C'de gece boyunca çöktürün. Son olarak, adaptör bölgesini 5' ucuna eklemek için CD NA moleküllerini daireselleştirin. Ardından, eye clip kütüphanesinin dizilenmesinden önce beraberindeki yazılı protokole uygun olarak yeniden lineerize edin ve PCR ile amplifiye edin; deneyin başarısı iki aşamada izlenebilir.Membran transferi sonrası protein RNA kompleksinin autoradyografında ve düşük RNA örneklerinin autoradyografındaki PCR ürünlerinin jel görüntüsünde, yüksek RNA örnekleri için proteinin moleküler ağırlığının üzerinde yaygın radyoaktivite görülmelidir. Bu radyoaktivite, proteinin moleküler ağırlığına daha yakın bir noktada yoğunlaşmıştır. İmmünopresipitasyonda antikor kullanılmadığında ise herhangi bir sinyal tespit edilmemelidir.İmmünopresipitasyonun özgünlüğü için gereken diğer önemli kontroller, ya UV ışınlaması yapmayı ya da ilgilenilen proteini eksprese etmeyen hücrelerin kullanılmasını içerir. PCR ürünlerinin jel görüntüsü, cDNA fraksiyonuna karşılık gelen bir boyut aralığı göstermelidir. PCR primerleri P3 Celexa ve P5 Celexa'nın, cDNA boyutuna ek olarak 76 nükleotid eklediğine dikkat edin. İmmünopresipitasyon sırasında herhangi bir antikor kullanılmazsa, buna karşılık gelen herhangi bir PCR ürünü tespit edilmemelidir.Bu prosedür uygulanırken, 64 adımın her birinin kritik olduğu ve yüzde yüz doğrulukla gerçekleştirilmesi gerektiği unutulmamalıdır. ICL verileri, transkriptom çapındaki fonksiyonel analizlerle hesaplamalı olarak entegre edilebilir. Bu durum, örneğin RNA işlemenin konuma bağlı düzenlenmesi hakkında içgörüler sağlayabilir.Hesaplamalı veri analizi için, Nicholas KA European Bioinformatics Institute ve Liana Üniversitesi'nden bla zupan ile gerçekleştirdiğimiz güncel yayınlarımıza başvurmanızı öneririz. Artık kendi deneylerinize başlama zamanı. İyi çalışmalar.

iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

Burada, intramoleküler ve molekül içi RNA-RNA etkileşimlerinin in vivo genom geneli haritalamasını mümkün kılan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin yöntemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. SPLASH maya, bakteri ve insanlar dahil olmak üzere organizmaların RNA etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Memeli hücre HeLa hücreleri kullanarak döngüsü sırasında eğitim RNA-interactors için çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek ve deneysel yaklaşımlar mevcut. Formaldehit crosslink RNA-PKR kompleksleri ve immunoprecipitation PKR bağımlı RNA'ların zenginleştirmek için bu yöntemi kullanır. Bu RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama veya qRT-PCR ile çözümlenebilir.

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Burada, testis 'teki RBP adaylarının büyük RNA hedeflerini belirlemek için bir eCLIP Protokolü sunuyoruz.

Gelişmiş Crosslinking Immünoprecipitation (eCLIP) fare testis protein bağlı RNA verimli tanımlaması için yöntem

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Öğrenin, iCLIP yöntemiyle RNA bağlayıcı proteinlerin bağlanma bölgelerini tek nükleotid çözünürlüğünde transkriptom genişinde haritalamayı. UV çapraz bağlama ve immünopresipitasyon kullanarak post-transkripsiyonel düzenlemeyi inceleyin.

iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

Daha fazla video keşfet