Name: Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Öğrenin fare gözünden vitreus, retina ve lens izolasyonu için diseksiyon tekniğini. Santrifügasyon ve protein analizleriyle dokuları ayırarak proteomik çalışmalarda kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansman Görüş ve Körlük Önlemek için Araştırma için mücadele sağlanmıştır.

1. Ön segment diseksiyonu. <ol><li> Limbus posterior skleral doku 0.22 forsepsle ve dünya (göz topu) stabilize ile kavradı. </li><li> Mikrocerrahi bıçak limbustan limbus kornea doğrusal bir kesi yapmak için kullanılır. </li><li> A 0.12 Colibri forsepsle sonra kornea kesi kavramak için kullanılır. </li><li> Ön kamara sıvısı sonra Weck-Cel cerrahi mızrak ile emilir. </li></ol> 2. Lens eviserasyon. <ol><li> Kornea açgözlü bir 0.12 Colibri forsepsle dünya stabilize etmek için kullanılır. </li><li> Dünyanın arka yönüyle doğru objektif arkasında ince kavisli bir iğne tutucu (ya da eğri soyunma forseps) eklenir. Iğne tutucu kısmen kapalı ve öne çekti. Basınç göz duvarında olduğu gibi bırakarak korneal kesiden lens ileri iter sklera, dış yüzeyinde forseps kullanılarak uygulanır. Vitreus saydam bir jel gibi görünür ve objektif kısmen yapışık. </li><li> Lens vitreus dokusu daha sonra PBS içinde çözünmüş proteaz inhibitörü kokteyl (Roche) 20 mikrolitre içeren filtrelenmiş bir santrifüj tüpü içine yerleştirilir. </li></ol> 3. Retina eviserasyon. <ol><li> Korneal kesi açgözlü 0.12 Colibri forseps ile dünya stabilize etmek için devam edin. </li><li> Ince kavisli bir iğne tutucu (ya da eğri soyunma forseps), optik sinir yakınında, mümkün olduğu kadar dünya arka yerleştirilir. Iğne tutucu kısmen kapalı ve öne çekti. Basınç, sklera, retina korneal kesiden ileri iter dış yüzeyinde forseps kullanılarak uygulanır. Vitreus retina yapışık yarı saydam bir jel gibi görünür. Retinada sarı, damarlı bir doku olarak görünür. Herhangi bir pigmentli doku şeritler forseps ile soyulmuş olabilir. </li><li> Retina-vitreus dokusu daha sonra lens vitreus dokusu içeren filtrelenmiş bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. </li></ol> 4. Santrifüj Filtreli. <ol><li> Benchtop santrifüj süzülmüş santrifüj tüp yerleştirilir. 12 dakika 14.000 x G Spin. </li><li> Vitreus alt odası, eluant aspire. Retinanın üst odasında kalır. Bu örnekler, protein çalışmaları için kullanılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Vitreus örnekleri, SDS-PAGE (Şekil 2) ile analiz edildi. Örnekleri de bir enzimatik aktivite assay (Şekil 3) için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Fare göz diyagramı. Insan ve fare göz kesit şematik büyük lens nedeniyle fare göz göreceli küçük vitreus hacmi gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Bir boyutlu SDS-PAGE fare vitreus ve retina. Protein fare vitreus profilleri, 13.6 mg / ml (şerit 1), ve retina, 11.35 mg / ml (2 şeritli). Jel elektroforezi Flamingo floresan jel boyası ile boyanmış, 45 dakika için 150 kV ve VersaDoc Görüntüleme sistemi (BioRad, Hercules, CA) kullanılarak görüntülendi. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Fare ve insan vitreus Süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitesi. Toplam SOD aktivitesi ölçümü (SOD aktivitesi kolorimetrik aasay kiti, # AB65354 Abcam, Inc, Cambridge, MA), DBA ve albino fareler eviserasyon tarafından toplanan vitreus ve retina üzerinde yapıldı. Bu insan vitreus çekirdek ve göreceli etkinliğini belirlemek için post-mortem insan donör gözleri toplanan insan retina SOD aktivitesi ile karşılaştırıldı. Sulandırılmamış vitreus karot numuneleri elle, 23 gauge iğne, 11 ve retina göz çiçekli ve RPE / koroid kompleksi uzak doku kesim tarafından toplanan ile aspire edildi . Tahlil SOD izoformları arasında ayrım yapmaz rağmen sadece ekstraselüler izoformu olduğundan, vitreus SOD aktivitesi, SOD3 yansıtmak için büyük olasılıkla 12 retinanın SOD aktivitesi üç SOD izoformları yansıtması muhtemeldir. Intrasellüler SOD1, mitokondriyal SOD2 ve ekstrasellüler SOD3. (12), bu SOD tahlil da dahil olmak üzere son derece hassas enzimatik Testler için, proteinlerin çapraz bulaşma olasılığı mümkündür ve daha fazla çalışma gerektirir. Hata çubukları SEM temsil eder.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &amp, Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Ophthalmol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+RS+%22Systematic+evaluation+of+the+mouse+eye%3A+Anatomy%2C+pathology%2C+and+biomethods%22">Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods</a>. , CRC Press. 161-195 (2002).</li>
<li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li>
<li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+Stickler%27s+syndrome%3A+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+%28pro%29collagen+gene+%28Col2a1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li>
<li>Marneros, A. G. &amp, Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII%2Fendostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li>
<li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li>
<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li>
<li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li>
</ol>

Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanları Kullanım için Oftalmoloji açıklamada Araştırma ve Vizyon Derneği uyarınca hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Transgenik farelerde retinal ve vitreoretinal hastalığın araştırılması için önemli bir model. 6-10 fare vitreus, ancak, büyük fare göz lens nedeniyle insan vitreus ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az oranda göz oluşmaktadır. 5 Bu yapar zor fare vitreus izole etmek ve arındırmak için. Onlardır ki, ilerleme, proliferatif diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, üveit, retina dekolmanı ve gibi hastalıklar sırasında vitreus ile ilişkili protein değişiklikleri anlamak mekanizmalarına fikir verecektir. Bu görüntülenmiştir deney protokolünde, enzimatik ve proteomik analizleri için protein verimi en üst düzeye çıkarırken, fare vitreus elde etmek ve arındırmak için bir araç sağlar.

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver Mikrocerrahi Blade </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 İnce Castroviejo Sütür atmak Forseps </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0.12 Colibri forseps </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon Santrifüj Filtre Ultracel YM-100 YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42.412, 42.415 </td><td></td></tr><tr><td> SOD Aktivitesi Kolorimetrik Assay Kit </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel cerrahi spears </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo floresan jel leke </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

proteomik analizleri fare vitreus ve retina eviserasyon

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Fare retina kalıtsal retina hastalıkları için önemli bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır, fare vitreus keşfedilmeyi beklemektedir. Vitreus hastalık sırasında göz içi yanı sıra ekstraoküler proteinler birikir retina üzerinde oldukça sulu bir ekstrasellüler matriks vitreus ve retina arasında 1-3 Anormal etkileşimleri, retina dekolmanı, proliferatif diyabetik retinopati, üveit ve proliferatif vitreoretinopati gibi çeşitli hastalıkların altında yatan 1 4 bağıl fare vitreus hacmi, fare objektif gözü yaklaşık% 75 işgal insan vitreus (Şekil 1) göre anlamlı derecede küçük. 5. Bu zorlu fare vitreus biyokimyasal çalışmalar yaptı. Bu video makalede, retina, transgenik fare modelleri bu ekstraselüler matriks vitreoretinal hastalıkların gelişiminde rolü daha net bir şekilde tanımlamak için izin fare vitreus incelemek ve izole etmek için bir teknik mevcut.

Diseksiyon tekniği vitreus, retina ve lens gelen fare göz, santrifüj yoluyla ayrılması ve protein deneyleri ile karakterizasyonu eviserasyon göstermektedir.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

Fare retinası, kalıtsal retina hastalıkları için önemli bir genetik model olarak ortaya çıkmış olsa da, fare vitreusu henüz keşfedilmemiş durumdadır. Vitreus...

İnsan gözü, fare gözünde vitreus adı verilen sıvı bir hücre dışı matris ile doludur. Bu alan büyük oranda lens tarafından doldurulur. Vitreus ve retinayı izole etmek için önce anterior segmenti diseke etmeli, gözü pensle sabitlemeli ve kornea boyunca tek bir insizyon yapmak için çok keskin bir bıçak kullanmalıyız.Kör bir bıçak korneayı yırtabilir ve birkaç darbe gerektirebilir. Ön kamaradaki sıvıyı absorbe etmek için bir WEX hücre süngeri kullanılır. Oklar, lensi ve vitreusu pensle nereden sıkıştıracağımızı, pensi kısmen kapatıp öne doğru çekeceğimizi göstermektedir.Lens, şeffaf bir küre gibi görünür ve arkasında vitreus jeli yer alır. Bu örnekte vitreus, lensin arkasına yapışık kalır; retinayı izole etmek için retina pensleri optik sinire yakın daha geriye yerleştirilir, nazikçe sıkılır ve öne doğru çekilir. Retina, sarı jelatinimsi bir materyal şeklinde görünür.Bazı durumlarda retina, vitreus ve lens tek bir doku şeklinde çıkacaktır. Bir sonraki adım, bir filtre santrifüj cihazı kullanarak bu üç dokuyu izole etmek ve birbirinden ayırmaktır. Filtre parçası bir einor tüpünün üst kısmına yerleştirilir ve üzerine bir miktar fosfat tamponlu salin eklenir.Dokular izole edildikçe, filtre içeren üstteki kuyuya yerleştirilirler. Lensler sol üst köşeye, retina vitreusu ise sağ alt kısma konur. Tüpler bir mikro santrifüje yerleştirilir ve 12 dakika boyunca 14,000 G'de döndürülür.Vitreus, eppendorf tüpünün dibine çökecek ve retina üst kısımda kalacaktır. Lensle retinayı ayırmak için pens kullanacağız, ardından retinayı üst kısımdan izole edeceğiz. Tüm bu dokular eppendorf tüplerine yerleştirilebilir ve daha sonra proteomik analizler için işleme alınabilir.

evisceration-of-mouse-vitreous-and-retina-for-proteomic-analyses

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video post-mortem gözünde, insan vitreus vücudunun çeşitli yarı saydam yapıların ayrılması ve diseksiyon için etkili bir teknik gösterir.

Proteomik Analizi İnsan Vitreus Gövde Elemanları diseksiyonu

Tripsin sindirmek retina damar analiz etmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yazının gemilerin genel mimarisi korurken teknik optimize etmek ve olmayan vasküler doku kaldırmak için önemli değişiklikler de dahil olmak üzere, ayrıntılı olarak yöntem açıklanır.

Tripsin Digest Protokolü Fare Modeli Retina damarları Analiz

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

Bu protokol, hücre verimi, saflığı ve canlılığı için optimize edilmiş murin doğum sonrası retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntemi açıklar. Bu hücreler yeni nesil dizileme yaklaşımları için uygundur.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Retina damar sisteminin oksidatif stres ve sitokinler gibi diyabet/diyabetik retinopati ile ilişkili hakaretlerden ölüme karşı direncini izlemek için bir koruma testi geliştirilmiştir.

Farelerde Retina Damar Sisteminin Diyabete Bağlı Ölümden Korunmasını Saptamak İçin Bir Test

Bu protokol, retinal fotoreseptör terminallerinin yapısal özelliklerine odaklanarak, hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması için ayrıntılı adımları açıklar.

Hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Öğrenin fare gözünden vitreus, retina ve lens izolasyonu için diseksiyon tekniğini. Santrifügasyon ve protein analizleriyle dokuları ayırarak proteomik çalışmalarda kullanın.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

Daha fazla video keşfet