Name: Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 10 s
Description: Öğrenin RNA virüslerinde polimeraz sadakat varyantlarını izole etme ve karakterize etme yöntemini. Bu teknik, mutasyon frekansı verilerini kullanarak viral replikasyon sırasında sadakat değişikliklerini doğrulamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Paris Şehir, hiçbir Fransız Ulusal hibe ANR-09-JCJC-0118-1 ve ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Proje Tıp ve Sağlık Araştırma hibe fon tarafından desteklenmiştir. 242.719.

<ol><li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+%28in%29fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li>
<li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li>
<li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%3A+fidelity%2C+replication+speed%2C+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li>
<li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li>
<li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li>
<li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%27s+antiviral+mechanism+of+action%3A+lethal+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li>
<li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li>
<li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li>
<li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li>
<li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect%2C+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li>
<li>Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis%3A+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li>
<li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li>
<li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin%3A+implications+for+error+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li>
</ol>

Hücre hattı seçimi. RNA mutajenler olarak baz analogları etkinliği farklı hücre tipleri tarafından 11 bağıl alımı ile ilişkilidir. Normal virüs geçişi için kullanılan hücre hattı alımı ya da çok hassas (yüksek hücre toksisite) mutajen dirençli bulunduğu kanıtlanırsa, bu gereksinimleri karşılar ve hala viral replikasyon için izin veren başka bir hücre hattı kullanmak için gerekli olabilir. Mutajen direnç varyantı izole sonra, karakterizasyonu kalan orijinal, tercih edilen bir hücre hattı yapılabilir. Deneyimlerimize göre, HeLa hücrelerinde kolaylıkla mutajen kadar sürebilir; BHK hücreleri mutajen alımı refrakter 10 kat daha yüksek konsantrasyonlarda ve Vero hücreleri gerektirir. Mutajen fazla bir tür kullanılır mutajen. Seçimi mutajen tedavi, başarı olasılığını sadakat varyantları izole etmeye çalışan artar. Yanlışlıkla çoğaltma sırasında genomların dahil farklı yapısı, Temel analog mutajenler mutasyonların sonraki çoğaltma döngüsü içinde belirli bir alt grubunda ağırlıklı olarak sonuçlara sebep: ribavirin tedavisi GtoA ve CtoU geçiş mutasyonlar 12 yanadır; 5-azacytidine benzer bir önyargı vardır, CtoG ve GtoC transversions 13 Ayrıca; 5-fluorourasil tercihen Atog ve UtoC geçişler (14) neden olur. Alternatif olarak, daha yüksek konsantrasyonlarda Mg 2 + veya Mn 2 + 12 yukarıda açıklanan önyargısız RNA virüsleri genel mutasyon sıklığını artırmak için orta takviye olabilir. Virüs kodon dizileri bağlı olarak, ve bir vefa varyant üretmek için gerekli kodon değişiklikleri, bu şartlar bazı diğerleri üzerinde bu varyantın ortaya çıkması tercih edecektir. Kodon yerinde gerekli Atog geçiş ağırlıklı olarak bu ribavirin tarafından oluşturulan mutasyonlar denk çünkü yüksek sadakat poliovirus G64S ve Coxsackie virüsü A372V için, ribavirin tedavisi en kolay varyantları için seçilir. İçişleri Bakanlığı vs nüfus büyüklüğü viroloji, doku kültürü enfeksiyon için protokoller, arızalı müdahale parçacıklar (düşük İçişleri Bakanlığı) (yüksek İçişleri Bakanlığı) birikmesi veya virüsler arasında rekombinasyon teşvik etmek, enfeksiyon (İçişleri Bakanlığı) çokluğu özellikle dikkat örnek. Pasajlanması seri üzerinde ortaya çıkması olayları seçmek için, virüs nüfus büyüklüğü dikkate almak da önemlidir. Dirençli mutant başlangıçta düşük frekans var, her geçişte ortaya çıkan bu değişik kaybetmemek için bir sonraki (10 5 -10 6 virüsler, gibi) bir geçit gibi büyük bir nüfus büyüklüğü mümkün olduğunca aktarmak en iyisidir. Ölçekleme kadar iyi veya balonun büyüklüğü (enfekte olan hücreleri sayısı), İçişleri Bakanlığı olarak bu endişe ise artışını en aza indirmek için yardımcı olabilir. Öte yandan, deneyler, mutajen bir virüs duyarlılığı test olduğu için, düşük İçişleri Bakanlığı enfeksiyonu ile daha yüksek bir fitness genomların Deneyde ortaya çıkan çoğaltma döngülerinin sayısını artırmak ve mutagenized genomların kurtarma önlemek için yapılır ko-enfekte olan hücreleri tamamlama. Çoğaltma ilk turda döl genomları üzerinde oluşturulan mutasyonlar hemen tespit edilemez çünkü bu önemlidir. Bu mutagenized RNA&#39;lar çoğu hala virion içine paketlenmiş olacak. Bu enfeksiyon sonraki turda iptal çoğaltma döngüsü bu genomlarındaki ölümcül mutasyonlar sonucu, ve virüs titresi azalma olacağını. Bu ölümcül mutagenez önemli bir etkisi gözlenen mutasyonların birikimi birkaç tur için önce izin için gerekli olabilir. Son olarak, mutajen varlığı geçiş serisi üzerinde virüs titreleri nesli kadar düşmesi devam ederse, daha sonra araştırmacı, mutajen (çok düşük konsantrasyonda başlayarak) giderek artan miktarlarda virüs Pasajlanması denemelisiniz. İzolasyon ve RNA mutajen dayanıklı nüfus RNA mutajen dirençli klon nesil. RNA mutajenler her genom birden fazla rastlantısal mutasyonlar tanıtmak, ancak direnç için seçim direnci mutasyon sadece zenginleştirmek (ve düzeltmek için konsensüs dizisi) . Bu mutasyon belirlemek için, sırası mutajen dayanıklı nüfus (nüfusun uzlaşma) ve bireysel virüsler değil. Bu nedenle, mutajen tarafından oluşturulan tek, rastlantısal mutasyonlar sırayla tespit değildir, sadece seçimi aşağıdaki fikir birliği değişiklikler sonucu bulundu mutasyonlar. Deneyimlerimiz bize, sadece bir ya da iki Böyle bir fikir birliğine dizisi değişiklikleri belirlemek. Mutajen dayanıklı nüfus elde edilir ve direnci mutasyon tespit edildikten sonra, bu varyant daha saf bir stok oluşturmak için gereklidir. Yukarıda, bir plaket arıtma prosedürü nitelendirdi. Alternatif olarak, faiz virüs kolayca tanımlanabilir plaklar vermezse, istediğiniz şekli purif olabilirseyreltme sınırlayarak IED. Bu yaklaşım, aslında bir virüs stokunun% 50 daha az kuyu enfekte olduğu gibi seyreltilmiş 96-kuyu biçiminde TCID 50 . Bu seyreltme yukarıdaki gibi aynı yaklaşımı kullanarak, 10 özel türevleri kadar tecrit ve dizileri teyit alınır. Belirtildiği gibi, en iyi durumlarda, bulaşıcı bir virüs suşu cDNA klonu kullanılabilir. Varyant izolasyonu böylece gerekli olmayacaktır. Deneyimlerimize göre, sadakat varyantları tek bir amino asit değiştirmelerin sonucudur ve böylece Quikchange (Agilent) gibi basit, ticarileştirilmiş mutagenez kitleri kullanılarak oluşturulabilir. İkinci seçenek yakından ilgili bir zorlanma cDNA klonu kullanmak. Ancak, ilgili suşu kullanıldığı takdirde, biz yakından ilişkili iki virüsler aynı netlikte değiştiren mutasyon mutlaka aynı etkiye sahip olmayacaktır, çünkü bu yaklaşım ve virüs izolasyonu (örneğin plak arıtma) hem kullanarak öneririz. Sadakat ve RNA mutajen dirençli varyantları çoğaltma Seçim vahşi tip meslektaşları 4,12,15 benzer büyüme özellikleri ile hem daha yüksek ve daha düşük bir sadakat varyantları izolasyonu sonuçlandı . Şu anda, polimeraz aktivitesi oranları ve sadakat arasındaki bağlantı tam olarak anlaşılmış değildir. Düşük sadakat türevleri, daha hızlı işleme 1-3,12 eğiliminde iken, in vitro saflaştırılmış RNA polimeraz kullanarak biyokimyasal çalışmalar, yüksek sadakat varyantları yavaş işleme oranlarına sahip olduğunu göstermiştir . Doku kültürü, bu farklılıklar, hız sınırlayıcı adım, bu kaynakların kullanılabilirliğini ziyade içsel polimeraz aktivitesi kinetiği düşündürmektedir, genellikle belli değildir. Sadakat varyant vahşi tip önemli ölçüde farklı değildir kinetiği çoğaltır, daha sonra kendi mutasyon frekanslarının bir karşılaştırma doğrudan yapılabilir. Çoğaltma kinetiği çok önemli bir değişiklik varsa, daha sonra veri çoğaltma döngüleri aynı sayıda geçirmiş virüsler karşılaştırarak örneğin kinetik farklılıklar hesaba normalize edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre bir adım büyüme kinetiği yabani türü ve yüksek sadakat varyantları arasında anlamlı bir fark gözlendi rağmen, (içinde yüksek sadakat türevleri sürekli vahşi tip göre (1 günlüğüne içinde) yüksek titrede gözlenen ama onlar biraz daha az RNA yapmak aynı büyüklük sırası), ayrıca ürettikleri genomların daha az mutasyonlar içeren ve daha bulaşıcı, böylece olduğunu düşündürmektedir. Örnek hazırlama ve sıralama bu protokoller tüm adımlar için, biyolojik ilgili mutasyonlar ayırt edilemez yılından bu yana yüksek sadakat, redaksiyon enzimleri ek mutasyonlar tanıtarak sınırlamak için PCR ve RT-PCR için kullanılan zorunludur. Karşılaştırılan virüs popülasyonları yeterli başlangıç ​​materyal olduğundan emin olmak için de önemlidir (geçit geçmişi, doku kültür ortamı, sıcaklık, RNA ekstraksiyon yöntemi, RT-PCR protokolleri, vb) aynı şartlarda hazırlanmış olması kritik RT-PCR ile güçlü bir grup oluşturulur böyle RNA ekstraksiyonu aldı. 1 / 100 dilüsyon RNA örnek bir örnek yeterli sayıda temsil yanlılığı önlemek için (aynı genomunun tekrar tekrar yükseltme) RNA molekülleri içerdiğini belirten saptanabilir RT-PCR bant vermelidir. Mutasyon sıklığı bir dağıtım olduğundan, bir benzer değerlere nüfus büyüklüğü ne olursa olsun söz konusu önyargı meydana değildir sağlanan elde edilebilir olacağı beklenebilir. Şekil 6&#39;da görüldüğü gibi, bir virüs stokunun 10 5 kat seyreltme ebeveyn stok önemli ölçüde farklı bir mutasyon sıklığı verir. TopoTA klonlama için en uygun koşulları bulununcaya kadar, sıralama önce koloni PCR ile mavi / beyaz tarama sonra ekler varlığını doğrulamak. Mutasyon gürültü (RT-PCR ve sıralama tarafından tanıtılan mutasyonların) için bir kontrol olarak (in vitro transkripsiyonu RNA virüs genomuna ait bir plazmid taşıyan aynı viral dizisi ve / veya klon ve sırası RT-PCR ürünleri PCR ürünü klonu in vitro transkripsiyon enzimler farklı farkında) farklı hata oranlarına sahip ve gerçek arka plan hata yordamı yararlı bilgi vermeyebilir. Bazı virüs dizileri, bakteri için zehirli olabilir, bu yüzden bu mutasyon sıklığı viral genom dizilimini bölgeye karar vermeden önce doğrulamak için önemlidir. TopoTA elde dizileri analiz, her klon sadece bir ekleme / sıralama içermesi gerektiğini unutmayın. Karışık bir nüfus düşündüren bir çift tepe görülürse, bu iki komşu bakteri kolonilerinin olduğunu mümkündür. Mutasyon son derece olası bakteri kültürü plazmid amplifikasyon sırasında olduğunu, bakteri çoğaltma düşük mutasyon frekansları verilen rağmen, aynı zamanda mümkündür. Plak ppopülasyonları urified, bir çift tepe yeni bir mutasyon satın almak ya da plak gelişimi sırasında bir mutasyon dönüyor üst üste plaklar ya da bir virüs temsil edebilir. Tutarlı olun ve saymak veya bu mutasyonlar saymak karar. Son olarak, burada kullanılan mutasyon frekanslar göreli değerleri olduğunu unutmayın. Onlar sadece, aynı koşul altında yetiştirilen virüs popülasyonları karşılaştırarak geçerli ve aynı bölge üzerinde sıralı! Bunlar mutasyon oranı, ya da bir bütün olarak genom mutasyon sıklığı mutlak değer olarak alınmamalıdır. Ancak, şartlar kontrol edilir, onlar mutasyon dağıtım ve frekans farklılıkları tekrarlanabilir, kantitatif karşılaştırmalar izin veren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Ribavirin </td><td> Sigma </td><td> R9644-10mg </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorourasil </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacytidine </td><td> Sigma </td><td> A2385-100mg </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028 = On Olunca-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Tripan mavi </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ml </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA klonlama kiti </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange mutasyon kiti </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> CDNA bulaşıcı bir klon varsa </td></tr><tr><td> 96-iyi miniprep kiti </td><td> Macherey&#39;nin-NAGEL </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gen Kodları Corporation&#39;ın </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Veya diğer hizalama yazılımı </td></tr></tbody></table>

virüs mutasyon frekans rna virüsler ve karakterizasyonu fidelity varyantlar izolasyonu

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA virüsleri RNA bağımlı RNA polimeraz genomların çoğaltmak için kullanın. Bu enzimlerin özünde yüksek hata oranı virüs adaptasyon ve evrim kolaylaştıran aşırı nüfus çeşitliliğinin nesil için büyük bir katkıda bulunuyor. Giderek artan kanıtlar, içsel bir hata oranları ve RNA virüsleri ortaya çıkan mutasyon frekansları, viral polimeraz ince amino asit değişiklikleri modüle olabileceğini göstermektedir. Biyokimyasal testleri dahil kantitatif ölçmek sadakat izin veren bazı viral RNA polimeraz için mevcut olmasına rağmen, biz burada sadakat değiştirerek mutasyonları tespit biyokimyasal yaklaşımlar kadar doğru olduğunu kanıtlamıştır RNA virüslerinin mutasyon frekansları ölçmek için basit bir yöntem tarif. Bu yaklaşım, en biyoloji laboratuarları yapılabilir geleneksel virolojik ve sıralama teknikleri kullanır. Bir dizi farklı virüsler ile tecrübemize dayanarak, sadakat varyantları tecrit ve istatistiksel olarak anlamlı veri üreten olasılığını artırmak için optimize edilmesi gereken önemli adımları belirledik. Sadakat değiştiren mutasyonlar izolasyonu ve karakterizasyonu polimeraz yapısı ve fonksiyonu 1-3 yeni anlayışlar sağlayabilir. Ayrıca, bu sadakat varyantları virüs adaptasyon ve evrim mekanizmaları 4-7 karakterize faydalı bir araç olabilir.

Bu makale, RNA virüsleri ve doku kültürü aslına Değişiklikleri onaylamak için mutasyon sıklığı verileri kullanmak RNA polimeraz sadakat varyantları izole ve karakterize etmek için gerekli adımları açıklamaktadır.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA virüsleri, genomlarını replike etmek için RNA bağımlı RNA polimerazları kullanırlar. Bu enzimlerin doğası gereği yüksek olan hata oranı, ...'nın önemli bir belirleyicisidir.

RNA virüsleri, genomlarını replike etmek için viral olarak kodlanmış RNA polimerazları kullanırlar. Bu polimerazların doğası gereği daha yüksek olan hata oranı, virüsün hızla adapte olmasını ve evrimleşmesini sağlar. Bu video, RNA polimerazlarında replikasyon sırasında hata oranını veya sadakati etkileyen mutasyonlara sahip virüsleri taramak ve tanımlamak için optimize edilmiş bir yöntemi sunmaktadır.Öncelikle, hücreleri öldürmeden veya virüsü inhibe etmeden kullanılabilecek maksimum mutajen seviyesini belirlemek için viral konak hücrelere mutajenler uygulanır. Optimal koşullar belirlendikten sonra, virüs RNA mutajenlerinin seçici baskısı altında pasajlanır. Daha sonra, mutajene dirençli popülasyon, sorumlu mutasyonu tanımlamak için dizilenir.Ardından, mutajen dirençli mutant izole edilir. Replikasyon kinetiği izlenir ve sonuçlar polimeraz sadakatinde artış veya azalışlar gösterir. Bu durum, RNA mutajenlerine karşı geniş spektrumlu direnç ve virüs popülasyonu mutasyon frekansındaki değişikliklerle eş zamanlıdır.Bu tekniğin, saflaştırılmış polimerazlar kullanılarak gerçekleştirilen biyokimyasal sadakat analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kullanılan bu tekniklerin doku kültüründe yetiştirilebilen her türlü RNA virüsü için geçerli olmasıdır. Bu yöntem, polimeraz hata hızının virüs adaptasyonu ve evrimindeki rolü gibi viroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, kullandıkları seçici baskıların ya çok güçlü ya da çok zayıf olması veya bölge dizileme örnekleminin analiz boyutunun ve klon sayısının istatistiksel güç için optimize edilmemiş olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Bu deneye, sonraki deneylerde hücre ölümüne yol açmadan kullanılabilecek mutajen konsantrasyon aralığının belirlenmesiyle başlayın. Hilar hücrelerinin subkonflüen monokatmanlarını içeren altı kuyucuklu plaklardaki medyumu aspire edin. Ardından, buraya mutajen katkılı iki mililitre medyum ekleyin; mutajen olarak ribovirin, 5-florürasil, 5-azasitidin, magnezyum klorür ve manganez klorür kullanılır.Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksitte inkübe edin. Ardından, sonraki iki ila yedi gün boyunca her 24 saatte bir, tripan mavisi dışlama yöntemiyle canlılığı kontrol etmek için bir hücre plakası kullanın. Bir hemositometre kullanarak, enfeksiyon bitiş noktasında %50'den daha az hücre ölümüne yol açan işlem görmemiş kontrol koşulları da dahil olmak üzere, her mutagen konsantrasyonu için canlı hücre yüzdesini hesaplayın.Maksimum titre değerlerine ulaşıldığında, prosedürün bir sonraki adımı, popülasyona aşırı mutajen yüklemesi yapmadan, uygun konsantrasyonlarda optimal seçici baskı uygulayacak mutajen konsantrasyonunu belirlemektir. Her genom en az bir veya iki pozisyondan mutasyona uğratılır. Böylece mutajen, pasajlar boyunca seçilecek olan direnç mutasyonunu oluşturacaktır.Çok fazla mutasyon meydana gelirse, direnç mutasyonunu taşıyan mutantlar kendileri için ölümcül düzeyde etkilenirler. Mutajen, altı kuyucuklu plaklarda ekili hücrelerin izolasyonunu engeller. İki mililitre mutajen takviyeli besiyeri kullanan hücrelerimiz için, %50'den fazla hücre ölümüne yol açan konsantrasyonlar hariç tutularak, daha önce kullanılan konsantrasyon aralıkları uygulanır.Mutajen alımının gerçekleşmesi için inkübasyon sonrası iki saat boyunca inkübe edin. Besiyerini aspire edin ve 200 µL hacminde düşük enfeksiyon multiplicitiesi ile virüsle enfekte edin; virüsün hücreleri enfekte etmesine izin vermek için 15 ila 60 dakika inkübe edin ve inokülumun hücre monotabakasını tamamen kapladığından emin olmak için plakayı düzenli aralıklarla sallayın. İnoküle edilen virüsü aspire edin ve inokülumu mümkün olduğunca uzaklaştırmak için iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, her kuyucuğa mutajen içeren besiyeri ekleyin ve hücreleri genellikle iki ila yedi güne tekabül eden üç ila altı replikasyon döngüsü boyunca inkübe edin. Her kuyucuktan virüsleri toplayın ve hesaplanan titrelere dayanarak virüs titresi üzerindeki antiviral etkiyi belirlemek için standart bir plak deneyi veya sınırlayıcı dilüsyon uygulayın. İşlem görmemiş kontrol enfeksiyonuna kıyasla virüs titrelerini 0,5 ila iki log azaltan ve aynı zamanda hücreler için yüksek düzeyde toksik olmayan mutajen konsantrasyonunu belirleyin.Mutajen dirençli varyantları izole etmek için ideal olarak %50'den düşük toksisiteyle başlanmalı ve virüs, her bir mutajenin optimal konsantrasyonu ile healer hücrelerinde pasajlanmalıdır; virüsün her pasajda 30 defaya kadar pasajlanması gerekebilir, burada gösterildiği gibi virüs titresi belirlenmeli ve mutajenle enfeksiyon ve inkübasyon işlemleri tekrarlanmalıdır. Mutajenle işlem görmüş örneklerin virüs titreleri, orijinal virüs titresi ve işlem görmemiş kontrol virüs titreleriyle karşılaştırıldığında ilk birkaç pasaj boyunca düşmelidir. Belirli bir serideki virüs titreleri, işlem görmemiş kontrol titreleriyle aynı büyüklüğe ulaştığında bu durum direnci gösterir.İlgilenilen virüsün polimeraz veya replikaz genlerini çoğaltan primerler kullanarak, sekanslama için viral RNA'yı ekstrakte edin. R-T-P-C-R ile viral genomun cDNA'sını sentezleyin ve ardından DNA'yı sekanslayın. Sekans bilgisi elde edildiğinde.Elde edilen sekansları referans konsensüs ile hizalamak ve yeni nokta mutasyonlarını belirlemek için hizalama yazılımı kullanın. Ayrıca, hizalama yazılımı tarafından gözden kaçmış olabilecek azınlık pikleri için kromatogramları kontrol edin. Toplam popülasyonun %20 ila %30'unu temsil eden bir mutant hala bir pik olarak görünecektir, ancak standart sekans analiziyle karışık bir nükleotid olarak tanımlanamayacak kadar küçüktür; ilgilenilen mutasyonu belirlemek için, burada gösterildiği gibi, aynı pasajdan gelen işlem görmemiş kontrolle karşılaştırıldığında yalnızca mutajenle işlem görmüş popülasyonda ortaya çıkan tek nükleotid polimorfizmlerini arayın. Bir mutasyon tanımlandıktan sonra, dirençli varyant enfeksiyöz cDNA'dan yeniden üretilmeli veya doku kültüründe izole edilmeli ve direnç fenotipi doğrulanmalıdır.Burada, tanımlanan mutantları izole etmek için plak assay yöntemi kullanıyoruz. Azot dirençli örneğin seri dilüsyonlarını hazırlayın ve bunları altı kuyucuklu plaklardaki hücre monokatmanlarına ekleyerek, 37 °C'de ve %5 CO₂ altında bir saatlik inkübasyonun ardından bir plak assay gerçekleştirin. Enfeksiyondan iki ila beş gün sonra agaroz overlay ekleyin.Plaklar net bir şekilde görünür olmalıdır. İdeal olarak, plaklardan biri 10 ile 50 arasında iyi ayrışmış plak üretecektir. Agaroz katmanının konumunu kaydırmamaya ve yerinden oynatmamaya dikkat ederek, bir marker ile plakların konumunu plaka üzerinde nokta ile işaretleyin ve bir P 200 filtreli ucu agaroz katmanından içeri nazikçe batırın.Plaka ulaşmak için ucu dikkatlice örtü katmanından kaldırın ve aros tıpayı 250 µL besiyeri içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aros tıpa uçtan kurtulmuş olsun veya olmasın, yeterli miktarda virüs aktarılacaktır; tüpü TenX per ute işlemi için vorteksleyin. Canlı virüsü daha sonra çoğaltmak için örneğin bir kısmını saklayın.Ardından, numunenin geri kalanından RNA'yı ekstrakte edin ve istenen mutasyonu içeren plak örneğini belirlemek için R-T-P-C-R gerçekleştirin. CDNA'yı dizileyin. Ek mutasyon bulunmadığından emin olun.Ardından, tüm sonraki çalışmalar için bu virüsten daha büyük bir stok hazırlayın. Daha sonra, tanımlanan mutasyonun sağladığı direnci doğrulamak için, çeşitli mutajenik koşullar kullanarak mutajen analizini tekrarlayın.Eğer varyant birden fazla mutajene karşı dirençliyse, muhtemelen sadakati (fidelity) artmıştır. Sadakati değiştiren mutasyonlar polimerazla eşleştiği için, replikasyon kinetiğinin önemli ölçüde değişmediğinin doğrulanması önemlidir. Mutasyon frekanslarını belirlemeden önce, replikasyonu en az iki tamamlayıcı yaklaşımla inceleyin.Örneğin, kantitatif R-T-P-C-R veya northern blot gibi RNA sentezini inceleyen bir yaklaşıma ek olarak, plak deneyi veya TCID 50 gibi virüs üretimini inceleyen bir yaklaşım uygulanabilir. Ardından, mutajene karşı direnç sağlayan belirlenmiş polimeraz değişiminin replikasyonu etkilediğini doğrulamak için fidelite mutasyon frekansları ölçülür. Bu işlem, canlı veya toplam virüs popülasyonu üzerinde gerçekleştirilebilir.Canlı ve canlı olmayan varyantları içeren toplam virüs popülasyonunun mutasyon frekanslarını belirlemek için, RNA'yı ekstrakte edin ve yapısal bir protein kodlayanlar gibi genetik varyantlara sahip olduğu bilinen bir kodlama dizisinden 800 ila 1.200 nükleotitlik bir bölgeyi R-T-P-C-R ile amplifiye edin. Ardından, incelenecek her bir virüs popülasyonu için saflaştırılmış ürünü topo TA klonlayın. XGA kaplı plaklarda mavi-beyaz tarama ile pozitif inserte sahip olduğu belirlenen 96 koloni seçin.Mavi-beyaz taramanın geçerliliğini doğrulamak için tek koloni PCR yapın. Yukarıdaki fragman boyutu ve koşullar kullanıldığında, kolonilerin yaklaşık %90'ı pozitif olmalıdır. Pozitif olan her beyaz koloni için, bir kürdan kullanarak her koloniyi 96'lı plakalardaki bir mililitre LB ortamına aktarın.Bakteri kültür plakaları, sabit çalkalamalı olarak 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, 96 kuyucuklu formatta mini prep'ler hazırlayarak DNA izole edilir; klonlanan segmentin maksimum kapsamını elde etmek için her plak yeterli primerle dizilenir.600 baz kapsama alanına sahip iki primer yeterli olacaktır. Her popülasyon için bir referans veya konsensüs dizi ve tek nükleotid polimorfizmlerini kolayca tanımlayabilen uygun bir hizalama yazılımı kullanarak sekans analizi gerçekleştirin. DNA star laser'dan ilgili yazılımları temin edin.İlk olarak, hatalı baz çağırma içeren veya uzunlukları çok kısa olanlar gibi düşük kaliteli dizileri ayıklamak için Gene kullanılır. Kalan diziler hizalanır. Analizdeki tüm diziler tarafından kapsanan nükleotid aralığı belirlenir.Bu bölge boyunca tamamen kapsanmayan klonları atın. Karşılaştırma nedenleriyle, aynı bölgenin tamamen kapsanması esastır. Referans suşundan farklı olan tek nükleotid polimorfizmlerini tanımlayın ve sayın.Toplam tek nükleotid polimorfizmleri sayısını, dizilen toplam nükleotid sayısına bölerek mutasyon frekansını hesaplayın. Bu sayıyı, dizilen her 10, 000 nükleotid başına düşen ortalama mutasyon sayısı olarak sunun. Eğer aynı tek nükleotid polimorfizmi çok sayıda klonda görülüyorsa, bu tekrarlayan mutasyonların dahil edildiği ve hariç tutulduğu iki ayrı değer sunun.Mutasyon dağılımını belirleyin. Her popülasyonda 0, 1, 2, 3 ve benzeri sayıda mutasyon sunan klonların sayısından oluşan sıralı bir liste yapın. Opsiyonel olarak dizilen bölgedeki mutasyonları belirleyin.Bir örnekteki popülasyon çeşitliliğinin ortalama değerlerini elde etmek için, düzenlenmiş dizileri kullanarak tüm olası ikili karşılaştırmaları hesaplayın. Burada çeşitli hizalama programları mevcuttur. Mega olarak da adlandırılan moleküler evrimsel genetik analiz programı, RNA mutajen direnci iyileştirmesi için seçilecek optimal koşulların belirlenmesinde kullanılır.Hücrelerimiz, artan konsantrasyonlarda ribovirin ile işleme tabi tutulmuş ve enfeksiyondan 48 saat sonra 0,01'lik bir enfeksiyon çokluğu ile vahşi tip Cox AKI B virüsü ile enfekte edilmiştir. Progenit virüs hasat edilmiş ve titler TCID₅₀ ile belirlenmiştir. Bu şekil, enfeksiyondan 48 saat sonra tripan mavisi boyaması ile belirlenen, x ekseninin altında kalan tedaviye karşı hayatta kalan hücrelerin yüzdesini göstermektedir.Sonuçlar, 100 ve 200 mikromolar konsantrasyonların, hücre canlılığını etkilemeden virüs titresini bir ila iki log azaltdığını göstermektedir. Mutajene dirençli popülasyonlar seçmek için, her pasajdan sonra CHI ganga virüsü, 50 mikromolar ribovirin varlığında (gri çubuklar) veya yokluğunda (siyah çubuklar) hilar hücrelerinde çoğaltılmış ve virüs progenileri, burada görüldüğü üzere BHK hücreleri üzerinde klasik plak deneyi ile quantify edilmiştir. Mutajenik etki, işlem görmüş virüs titresinin iki log düştüğü ilk pasajlar sırasında belirgindir.Titus kademeli olarak tedavi edilmemiş normal seviyelere döndü. Beş mutajenle tedavi edilen popülasyonlar ile tedavi edilmemiş popülasyonlar arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir; bu durum, dirençli varyantların seçildiğini göstermektedir. Nitekim, ribovirin tedavisine tabi tutulan virüs popülasyonunda yapılan sekanslama, farklı yapılardaki RNA mutajenlerine karşı geniş kapsamlı direnci doğrulamak için benzersiz mutasyonlar tanımlamıştır; tarama sırasında başlangıçta izole edilen COA virüs B üç'ün yüksek sadakatli A 3 72 V varyantı, farklı konsantrasyonlardaki RIBOVIRIN, beş florourasil ve beş azasitidin RNA mutajenlerine karşı azalmış hassasiyet açısından test edilmiştir.Hücrelerimiz, belirtilen ribovirin konsantrasyonları ilele tedavi edilmiş ve enfeksiyondan 48 saat sonra 0,01'lik bir enfeksiyon çokluğu ile yabanı tip Cox AKI virüsü B ile enfekte edilmiştir. Progeni virüs toplanmış ve titreler TCID₅₀ ile belirlenmiştir; burada yabanı tip ve A372 varyantının titreleri, mutajen konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak gösterilmektedir. A372V, tutarlı bir şekilde yabanı tipten daha yüksek titreler göstermiştir.Virüs üretiminin tek basamaklı büyüme kinetiğini belirlemek için test edilen tüm koşullar altında, hücrelerimiz Cox AKI virüsü B3'ün ya vahşi tip, yüksek sadakatli varyant A372V ya da replikasyon defektli varyant CX64 ile 10'luk bir enfeksiyon çokluğu ile enfekte edilmiştir; belirtilen zaman noktalarında virüs progeny'leri, dondurma-çözme yöntemiyle hücrelerden ve süpernatanlardan hasat edilmiş ve TCID₅₀ ile titre edilmiştir. A372V'nin sadakat artışı, doku kültüründe gözlemlenebilir bir replikasyon defekti ile örtüşmemektedir. CX64 varyantı, replikasyon kinetiğinde anlamlı bir gecikme sergilemekte ve vahşi tip virüsten 1000 kat daha düşük maksimum titrelere ulaşmaktadır.Bu videoda açıklanan yaklaşım kullanılarak, dizilenen her bir klon, toplam virüs popülasyonu içindeki benzersiz bir genomdan köken alır ve dolayısıyla benzersiz mutasyonlar taşır. Bu şekil, düşük kaliteli dizilerin temizlenmesinin ve tek nükleotid polimorfizmlerinin görselleştirilmesinin ardından elde edilen tipik bir hizalamayı göstermektedir. Bir popülasyondaki toplam tek nükleotid polimorfizmleri hesaplanmış ve her bir klonda görülen tek nükleotid polimorfizmleri sayısı not edilmiştir.Örneğin, bir çubukla altı çizili olan klon iki adet benzersiz mutasyon içerirken, diğer sekiz klon tek bir benzersiz mutasyon içermektedir. Bu veriler, burada gösterilen tabloya benzer bir tablo oluşturmak için kullanılır. Tablo, dizilenmiş klonların mutasyon sayısına göre sıralanmış dağılımını göstermektedir.Sıralanmış değerlerin istatistiksel karşılaştırması, bir dağılımın diğerinden anlamlı derecede farklı olup olmadığını belirleyebilir. Daha kolay yorumlama için, sekans ve istatistiksel analizlerden elde edilen sayısal veriler bir grafik veya histogram şeklinde temsil edilebilir. Burada gösterildiği gibi, A 3 72 V virüsü vahşi tipe göre daha az mutasyon üretmekte ve 0,01'den küçük bir P değeri ile anlamlı derecede daha düşük bir mutasyon frekansı sergilemektedir.Aynı tavuk ganga virüsü popülasyonu, RNA ekstraksiyonu için virüs stokunun veya 10⁵ kat dilüasyonun kullanılmasına bakılmaksızın benzer mutasyon frekansları verir. Bu prosedürün ardından, bu polimeraz varyantındaki sadakatin mekanistik ve yapısal temelini daha iyi anlamak için in vitro biyokimyasal deneyler veya kristalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek isteyebilirsiniz.Bu gelişmenin ardından, bu teknik biyoloji alanındaki araştırmacıların, genetik çeşitlilik ile virüs uygunluğu (fitness) arasındaki korelasyonu in vivo ortamda keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, RNA virüslerinin fidelite varyantlarını izole etme şansınızı nasıl artıracağınız ve bu fidelite farklarını belirlemek için mutasyon frekanslarını nasıl kullanacağınız konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmanız gerekir.

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Neredeyse izojenik virüsler arasındaki büyüme rekabeti, göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemek için hassas bir ölçüm sağlar. Burada açıklanan protokoller, rekombinant HIV-1 klonlarının oluşturulmasını, virüs yayılımını ve büyüme rekabetini ve hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için optimize edilmiş analiz yöntemlerini içerir.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Bu protokol, insan klinik izolatlarından alınan viral örneklerin tarafsız RNA dizilimi için hızlı ve geniş çapta uygulanabilir bir yöntemi tanımlar.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Burada belirli büyüme oranı ve diğer Rotavirüs plak tahlil ve RT-qPCR kullanarak hücre bağlama yeteneği ölçmek için iki protokol mevcut. Bu protokoller fenotipleri farklılıkları Rotavirüs suşları arasında teyit için kullanılabilir.

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

RNA virüsü çoğaltma sırasında üretilen çift iplikçikli RNA desen tanıma reseptörleri tarafından doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ikna etmek için kabul edilebilir. Negatif anlamda RNA virüsleri için alt düzey dsRNA ve PRRs arasındaki etkileşimi belirsizdir. Arenavirus dsRNA ve tek tek hücreleri içinde PRR görselleştirmek için confocal mikroskopi yöntemi geliştirdik.

Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.

Pozitif Anlamlı RNA Virüsü Varyantlarını Tasarlamak için Tersine Genetik

Öğrenin RNA virüslerinde polimeraz sadakat varyantlarını izole etme ve karakterize etme yöntemini. Bu teknik, mutasyon frekansı verilerini kullanarak viral replikasyon sırasında sadakat değişikliklerini doğrulamaya yardımcı olur.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

Daha fazla video keşfet