Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA virüsleri, genomlarını replike etmek için viral olarak kodlanmış RNA polimerazları kullanırlar. Bu polimerazların doğası gereği daha yüksek olan hata oranı, virüsün hızla adapte olmasını ve evrimleşmesini sağlar. Bu video, RNA polimerazlarında replikasyon sırasında hata oranını veya sadakati etkileyen mutasyonlara sahip virüsleri taramak ve tanımlamak için optimize edilmiş bir yöntemi sunmaktadır.

Öncelikle, hücreleri öldürmeden veya virüsü inhibe etmeden kullanılabilecek maksimum mutajen seviyesini belirlemek için viral konak hücrelere mutajenler uygulanır. Optimal koşullar belirlendikten sonra, virüs RNA mutajenlerinin seçici baskısı altında pasajlanır. Daha sonra, mutajene dirençli popülasyon, sorumlu mutasyonu tanımlamak için dizilenir.

Ardından, mutajen dirençli mutant izole edilir. Replikasyon kinetiği izlenir ve sonuçlar polimeraz sadakatinde artış veya azalışlar gösterir. Bu durum, RNA mutajenlerine karşı geniş spektrumlu direnç ve virüs popülasyonu mutasyon frekansındaki değişikliklerle eş zamanlıdır.

Bu tekniğin, saflaştırılmış polimerazlar kullanılarak gerçekleştirilen biyokimyasal sadakat analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kullanılan bu tekniklerin doku kültüründe yetiştirilebilen her türlü RNA virüsü için geçerli olmasıdır. Bu yöntem, polimeraz hata hızının virüs adaptasyonu ve evrimindeki rolü gibi viroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, kullandıkları seçici baskıların ya çok güçlü ya da çok zayıf olması veya bölge dizileme örnekleminin analiz boyutunun ve klon sayısının istatistiksel güç için optimize edilmemiş olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Bu deneye, sonraki deneylerde hücre ölümüne yol açmadan kullanılabilecek mutajen konsantrasyon aralığının belirlenmesiyle başlayın. Hilar hücrelerinin subkonflüen monokatmanlarını içeren altı kuyucuklu plaklardaki medyumu aspire edin. Ardından, buraya mutajen katkılı iki mililitre medyum ekleyin; mutajen olarak ribovirin, 5-florürasil, 5-azasitidin, magnezyum klorür ve manganez klorür kullanılır.

Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksitte inkübe edin. Ardından, sonraki iki ila yedi gün boyunca her 24 saatte bir, tripan mavisi dışlama yöntemiyle canlılığı kontrol etmek için bir hücre plakası kullanın. Bir hemositometre kullanarak, enfeksiyon bitiş noktasında %50'den daha az hücre ölümüne yol açan işlem görmemiş kontrol koşulları da dahil olmak üzere, her mutagen konsantrasyonu için canlı hücre yüzdesini hesaplayın.

Maksimum titre değerlerine ulaşıldığında, prosedürün bir sonraki adımı, popülasyona aşırı mutajen yüklemesi yapmadan, uygun konsantrasyonlarda optimal seçici baskı uygulayacak mutajen konsantrasyonunu belirlemektir. Her genom en az bir veya iki pozisyondan mutasyona uğratılır. Böylece mutajen, pasajlar boyunca seçilecek olan direnç mutasyonunu oluşturacaktır.

Çok fazla mutasyon meydana gelirse, direnç mutasyonunu taşıyan mutantlar kendileri için ölümcül düzeyde etkilenirler. Mutajen, altı kuyucuklu plaklarda ekili hücrelerin izolasyonunu engeller. İki mililitre mutajen takviyeli besiyeri kullanan hücrelerimiz için, %50'den fazla hücre ölümüne yol açan konsantrasyonlar hariç tutularak, daha önce kullanılan konsantrasyon aralıkları uygulanır.

Mutajen alımının gerçekleşmesi için inkübasyon sonrası iki saat boyunca inkübe edin. Besiyerini aspire edin ve 200 µL hacminde düşük enfeksiyon multiplicitiesi ile virüsle enfekte edin; virüsün hücreleri enfekte etmesine izin vermek için 15 ila 60 dakika inkübe edin ve inokülumun hücre monotabakasını tamamen kapladığından emin olmak için plakayı düzenli aralıklarla sallayın. İnoküle edilen virüsü aspire edin ve inokülumu mümkün olduğunca uzaklaştırmak için iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından, her kuyucuğa mutajen içeren besiyeri ekleyin ve hücreleri genellikle iki ila yedi güne tekabül eden üç ila altı replikasyon döngüsü boyunca inkübe edin. Her kuyucuktan virüsleri toplayın ve hesaplanan titrelere dayanarak virüs titresi üzerindeki antiviral etkiyi belirlemek için standart bir plak deneyi veya sınırlayıcı dilüsyon uygulayın. İşlem görmemiş kontrol enfeksiyonuna kıyasla virüs titrelerini 0,5 ila iki log azaltan ve aynı zamanda hücreler için yüksek düzeyde toksik olmayan mutajen konsantrasyonunu belirleyin.

Mutajen dirençli varyantları izole etmek için ideal olarak %50'den düşük toksisiteyle başlanmalı ve virüs, her bir mutajenin optimal konsantrasyonu ile healer hücrelerinde pasajlanmalıdır; virüsün her pasajda 30 defaya kadar pasajlanması gerekebilir, burada gösterildiği gibi virüs titresi belirlenmeli ve mutajenle enfeksiyon ve inkübasyon işlemleri tekrarlanmalıdır. Mutajenle işlem görmüş örneklerin virüs titreleri, orijinal virüs titresi ve işlem görmemiş kontrol virüs titreleriyle karşılaştırıldığında ilk birkaç pasaj boyunca düşmelidir. Belirli bir serideki virüs titreleri, işlem görmemiş kontrol titreleriyle aynı büyüklüğe ulaştığında bu durum direnci gösterir.

İlgilenilen virüsün polimeraz veya replikaz genlerini çoğaltan primerler kullanarak, sekanslama için viral RNA'yı ekstrakte edin. R-T-P-C-R ile viral genomun cDNA'sını sentezleyin ve ardından DNA'yı sekanslayın. Sekans bilgisi elde edildiğinde.

Elde edilen sekansları referans konsensüs ile hizalamak ve yeni nokta mutasyonlarını belirlemek için hizalama yazılımı kullanın. Ayrıca, hizalama yazılımı tarafından gözden kaçmış olabilecek azınlık pikleri için kromatogramları kontrol edin. Toplam popülasyonun %20 ila %30'unu temsil eden bir mutant hala bir pik olarak görünecektir, ancak standart sekans analiziyle karışık bir nükleotid olarak tanımlanamayacak kadar küçüktür; ilgilenilen mutasyonu belirlemek için, burada gösterildiği gibi, aynı pasajdan gelen işlem görmemiş kontrolle karşılaştırıldığında yalnızca mutajenle işlem görmüş popülasyonda ortaya çıkan tek nükleotid polimorfizmlerini arayın. Bir mutasyon tanımlandıktan sonra, dirençli varyant enfeksiyöz cDNA'dan yeniden üretilmeli veya doku kültüründe izole edilmeli ve direnç fenotipi doğrulanmalıdır.

Burada, tanımlanan mutantları izole etmek için plak assay yöntemi kullanıyoruz. Azot dirençli örneğin seri dilüsyonlarını hazırlayın ve bunları altı kuyucuklu plaklardaki hücre monokatmanlarına ekleyerek, 37 °C'de ve %5 CO₂ altında bir saatlik inkübasyonun ardından bir plak assay gerçekleştirin. Enfeksiyondan iki ila beş gün sonra agaroz overlay ekleyin.

Plaklar net bir şekilde görünür olmalıdır. İdeal olarak, plaklardan biri 10 ile 50 arasında iyi ayrışmış plak üretecektir. Agaroz katmanının konumunu kaydırmamaya ve yerinden oynatmamaya dikkat ederek, bir marker ile plakların konumunu plaka üzerinde nokta ile işaretleyin ve bir P 200 filtreli ucu agaroz katmanından içeri nazikçe batırın.

Plaka ulaşmak için ucu dikkatlice örtü katmanından kaldırın ve aros tıpayı 250 µL besiyeri içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aros tıpa uçtan kurtulmuş olsun veya olmasın, yeterli miktarda virüs aktarılacaktır; tüpü TenX per ute işlemi için vorteksleyin. Canlı virüsü daha sonra çoğaltmak için örneğin bir kısmını saklayın.

Ardından, numunenin geri kalanından RNA'yı ekstrakte edin ve istenen mutasyonu içeren plak örneğini belirlemek için R-T-P-C-R gerçekleştirin. CDNA'yı dizileyin. Ek mutasyon bulunmadığından emin olun.

Ardından, tüm sonraki çalışmalar için bu virüsten daha büyük bir stok hazırlayın. Daha sonra, tanımlanan mutasyonun sağladığı direnci doğrulamak için, çeşitli mutajenik koşullar kullanarak mutajen analizini tekrarlayın.

Eğer varyant birden fazla mutajene karşı dirençliyse, muhtemelen sadakati (fidelity) artmıştır. Sadakati değiştiren mutasyonlar polimerazla eşleştiği için, replikasyon kinetiğinin önemli ölçüde değişmediğinin doğrulanması önemlidir. Mutasyon frekanslarını belirlemeden önce, replikasyonu en az iki tamamlayıcı yaklaşımla inceleyin.

Örneğin, kantitatif R-T-P-C-R veya northern blot gibi RNA sentezini inceleyen bir yaklaşıma ek olarak, plak deneyi veya TCID 50 gibi virüs üretimini inceleyen bir yaklaşım uygulanabilir. Ardından, mutajene karşı direnç sağlayan belirlenmiş polimeraz değişiminin replikasyonu etkilediğini doğrulamak için fidelite mutasyon frekansları ölçülür. Bu işlem, canlı veya toplam virüs popülasyonu üzerinde gerçekleştirilebilir.

Canlı ve canlı olmayan varyantları içeren toplam virüs popülasyonunun mutasyon frekanslarını belirlemek için, RNA'yı ekstrakte edin ve yapısal bir protein kodlayanlar gibi genetik varyantlara sahip olduğu bilinen bir kodlama dizisinden 800 ila 1.200 nükleotitlik bir bölgeyi R-T-P-C-R ile amplifiye edin. Ardından, incelenecek her bir virüs popülasyonu için saflaştırılmış ürünü topo TA klonlayın. XGA kaplı plaklarda mavi-beyaz tarama ile pozitif inserte sahip olduğu belirlenen 96 koloni seçin.

Mavi-beyaz taramanın geçerliliğini doğrulamak için tek koloni PCR yapın. Yukarıdaki fragman boyutu ve koşullar kullanıldığında, kolonilerin yaklaşık %90'ı pozitif olmalıdır. Pozitif olan her beyaz koloni için, bir kürdan kullanarak her koloniyi 96'lı plakalardaki bir mililitre LB ortamına aktarın.

Bakteri kültür plakaları, sabit çalkalamalı olarak 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, 96 kuyucuklu formatta mini prep'ler hazırlayarak DNA izole edilir; klonlanan segmentin maksimum kapsamını elde etmek için her plak yeterli primerle dizilenir.

600 baz kapsama alanına sahip iki primer yeterli olacaktır. Her popülasyon için bir referans veya konsensüs dizi ve tek nükleotid polimorfizmlerini kolayca tanımlayabilen uygun bir hizalama yazılımı kullanarak sekans analizi gerçekleştirin. DNA star laser'dan ilgili yazılımları temin edin.

İlk olarak, hatalı baz çağırma içeren veya uzunlukları çok kısa olanlar gibi düşük kaliteli dizileri ayıklamak için Gene kullanılır. Kalan diziler hizalanır. Analizdeki tüm diziler tarafından kapsanan nükleotid aralığı belirlenir.

Bu bölge boyunca tamamen kapsanmayan klonları atın. Karşılaştırma nedenleriyle, aynı bölgenin tamamen kapsanması esastır. Referans suşundan farklı olan tek nükleotid polimorfizmlerini tanımlayın ve sayın.

Toplam tek nükleotid polimorfizmleri sayısını, dizilen toplam nükleotid sayısına bölerek mutasyon frekansını hesaplayın. Bu sayıyı, dizilen her 10, 000 nükleotid başına düşen ortalama mutasyon sayısı olarak sunun. Eğer aynı tek nükleotid polimorfizmi çok sayıda klonda görülüyorsa, bu tekrarlayan mutasyonların dahil edildiği ve hariç tutulduğu iki ayrı değer sunun.

Mutasyon dağılımını belirleyin. Her popülasyonda 0, 1, 2, 3 ve benzeri sayıda mutasyon sunan klonların sayısından oluşan sıralı bir liste yapın. Opsiyonel olarak dizilen bölgedeki mutasyonları belirleyin.

Bir örnekteki popülasyon çeşitliliğinin ortalama değerlerini elde etmek için, düzenlenmiş dizileri kullanarak tüm olası ikili karşılaştırmaları hesaplayın. Burada çeşitli hizalama programları mevcuttur. Mega olarak da adlandırılan moleküler evrimsel genetik analiz programı, RNA mutajen direnci iyileştirmesi için seçilecek optimal koşulların belirlenmesinde kullanılır.

Hücrelerimiz, artan konsantrasyonlarda ribovirin ile işleme tabi tutulmuş ve enfeksiyondan 48 saat sonra 0,01'lik bir enfeksiyon çokluğu ile vahşi tip Cox AKI B virüsü ile enfekte edilmiştir. Progenit virüs hasat edilmiş ve titler TCID₅₀ ile belirlenmiştir. Bu şekil, enfeksiyondan 48 saat sonra tripan mavisi boyaması ile belirlenen, x ekseninin altında kalan tedaviye karşı hayatta kalan hücrelerin yüzdesini göstermektedir.

Sonuçlar, 100 ve 200 mikromolar konsantrasyonların, hücre canlılığını etkilemeden virüs titresini bir ila iki log azaltdığını göstermektedir. Mutajene dirençli popülasyonlar seçmek için, her pasajdan sonra CHI ganga virüsü, 50 mikromolar ribovirin varlığında (gri çubuklar) veya yokluğunda (siyah çubuklar) hilar hücrelerinde çoğaltılmış ve virüs progenileri, burada görüldüğü üzere BHK hücreleri üzerinde klasik plak deneyi ile quantify edilmiştir. Mutajenik etki, işlem görmüş virüs titresinin iki log düştüğü ilk pasajlar sırasında belirgindir.

Titus kademeli olarak tedavi edilmemiş normal seviyelere döndü. Beş mutajenle tedavi edilen popülasyonlar ile tedavi edilmemiş popülasyonlar arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir; bu durum, dirençli varyantların seçildiğini göstermektedir. Nitekim, ribovirin tedavisine tabi tutulan virüs popülasyonunda yapılan sekanslama, farklı yapılardaki RNA mutajenlerine karşı geniş kapsamlı direnci doğrulamak için benzersiz mutasyonlar tanımlamıştır; tarama sırasında başlangıçta izole edilen COA virüs B üç'ün yüksek sadakatli A 3 72 V varyantı, farklı konsantrasyonlardaki RIBOVIRIN, beş florourasil ve beş azasitidin RNA mutajenlerine karşı azalmış hassasiyet açısından test edilmiştir.

Hücrelerimiz, belirtilen ribovirin konsantrasyonları ilele tedavi edilmiş ve enfeksiyondan 48 saat sonra 0,01'lik bir enfeksiyon çokluğu ile yabanı tip Cox AKI virüsü B ile enfekte edilmiştir. Progeni virüs toplanmış ve titreler TCID₅₀ ile belirlenmiştir; burada yabanı tip ve A372 varyantının titreleri, mutajen konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak gösterilmektedir. A372V, tutarlı bir şekilde yabanı tipten daha yüksek titreler göstermiştir.

Virüs üretiminin tek basamaklı büyüme kinetiğini belirlemek için test edilen tüm koşullar altında, hücrelerimiz Cox AKI virüsü B3'ün ya vahşi tip, yüksek sadakatli varyant A372V ya da replikasyon defektli varyant CX64 ile 10'luk bir enfeksiyon çokluğu ile enfekte edilmiştir; belirtilen zaman noktalarında virüs progeny'leri, dondurma-çözme yöntemiyle hücrelerden ve süpernatanlardan hasat edilmiş ve TCID₅₀ ile titre edilmiştir. A372V'nin sadakat artışı, doku kültüründe gözlemlenebilir bir replikasyon defekti ile örtüşmemektedir. CX64 varyantı, replikasyon kinetiğinde anlamlı bir gecikme sergilemekte ve vahşi tip virüsten 1000 kat daha düşük maksimum titrelere ulaşmaktadır.

Bu videoda açıklanan yaklaşım kullanılarak, dizilenen her bir klon, toplam virüs popülasyonu içindeki benzersiz bir genomdan köken alır ve dolayısıyla benzersiz mutasyonlar taşır. Bu şekil, düşük kaliteli dizilerin temizlenmesinin ve tek nükleotid polimorfizmlerinin görselleştirilmesinin ardından elde edilen tipik bir hizalamayı göstermektedir. Bir popülasyondaki toplam tek nükleotid polimorfizmleri hesaplanmış ve her bir klonda görülen tek nükleotid polimorfizmleri sayısı not edilmiştir.

Örneğin, bir çubukla altı çizili olan klon iki adet benzersiz mutasyon içerirken, diğer sekiz klon tek bir benzersiz mutasyon içermektedir. Bu veriler, burada gösterilen tabloya benzer bir tablo oluşturmak için kullanılır. Tablo, dizilenmiş klonların mutasyon sayısına göre sıralanmış dağılımını göstermektedir.

Sıralanmış değerlerin istatistiksel karşılaştırması, bir dağılımın diğerinden anlamlı derecede farklı olup olmadığını belirleyebilir. Daha kolay yorumlama için, sekans ve istatistiksel analizlerden elde edilen sayısal veriler bir grafik veya histogram şeklinde temsil edilebilir. Burada gösterildiği gibi, A 3 72 V virüsü vahşi tipe göre daha az mutasyon üretmekte ve 0,01'den küçük bir P değeri ile anlamlı derecede daha düşük bir mutasyon frekansı sergilemektedir.

Aynı tavuk ganga virüsü popülasyonu, RNA ekstraksiyonu için virüs stokunun veya 10⁵ kat dilüasyonun kullanılmasına bakılmaksızın benzer mutasyon frekansları verir. Bu prosedürün ardından, bu polimeraz varyantındaki sadakatin mekanistik ve yapısal temelini daha iyi anlamak için in vitro biyokimyasal deneyler veya kristalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek isteyebilirsiniz.

Bu gelişmenin ardından, bu teknik biyoloji alanındaki araştırmacıların, genetik çeşitlilik ile virüs uygunluğu (fitness) arasındaki korelasyonu in vivo ortamda keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, RNA virüslerinin fidelite varyantlarını izole etme şansınızı nasıl artıracağınız ve bu fidelite farklarını belirlemek için mutasyon frekanslarını nasıl kullanacağınız konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmanız gerekir.