Mikroakışkan Aygıt compartmentalization E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlanması

Merhaba ve Dr.Newly John'un laboratuvarına hoş geldiniz. Önceki bir videoda, araştırmacının nöronların hücre gövdelerini saf bir aksonal fraksiyondan ayırmasına izin veren bir platform olan nöron cihazını nasıl ürettiğimizi gösterdik. Yumuşak litografi, PDMS'nin daha önce fotolitografi kullanılarak üretilmiş cihaz tasarımını içeren bir silikon gofret üzerine dökülmesi ve sertleştirilmesinden oluşan cihazları yapmak için kullanılan tekniktir.

Bu videoda, spro dolly E 18 kortikal sıçan nöronlarının hazırlanışını ve nöronların nöron cihazına nasıl yükleneceğini göstereceğiz. Sizi Kiana Lee ile tanıştırmak istiyorum. Bugün Gösterileri yapacak.

Başlamadan önce, gerekli tüm ortam ve reaktiflerin su banyosunda 37 dereceye kadar ısıtılması önemlidir. %0.25 tripsin içeren nöro bazal media ve %10 FBS içeren DMEM görebilirsiniz. Hücreleri onarmak için kullanılmak üzere davlumbazın içine yerleştirilen her şeyin sterilize edildiğinden ve %70 etanol ile silindiğinden emin olmak önemlidir.

İlk olarak, doku kültürü başlığı %70 etanol ile silinir. Daha sonra, tüpleri tutmak için kullanılan plastik raflara etanol püskürtülür. Daha sonra, tri striasyon işleminde kullanılan kauçuk top etanol ile temizlenir.

Kuruması için yeterli zamana sahip olması için bunu erkenden yapmak önemlidir. Daha sonra, gerekli reaktifler etanol ile silinir ve davlumbaza hareket eder. Daha önce diseke edilmiş bir beyni temsil eden iki Parça E 18 fetal sıçan korteksi, bir ml, buz gibi, kalsiyum içermeyen, magnezyum içermeyen 15 ml'lik bir tüpe yerleştirilir, diseksiyon tamponundaki kortekse bir ml %0.25 tripsin EDTA eklenir, son hacim iki değirmene ve son deneme konsantrasyonu %0.125'e getirilir Şimdi eklenen tripsin ile korteksi içeren 15 ml'lik tüp daha sonra yerleştirilir Sekiz dakika boyunca 37 derecelik bir su banyosunda, fetal korteks tripsin içinde 37 derecede inkübe edilirken.

Üç macun pipeti ateşle parlatılmıştır. Cam pipetin ucu, alevin mavi kısmının yakınına alevle tam temas edecek şekilde yerleştirilir ve sadece açıklık turuncuya dönene kadar yavaşça döndürülür. Turuncuya döndüğü gibi.

Çökmemesi için cam pipeti döndürmeye devam etmek önemlidir. Cam pipetlerin açıklıklarının art arda daha küçük olduğuna dikkat edin. Açıklıkları çok küçük yapmak istemediğinize dikkat etmek de önemlidir, çünkü bu, korteks tripsin ile 37 derecede sekiz dakika inkübe edildikten sonra hücrelerin parçalanmasına neden olabilir, tripsin reaksiyonunu durdurmaya yardımcı olmak için% 10 FBS içeren 10 ml DMEM kortekse eklenir.

Korteks ve DMEM% 10 FBS içeren 15 ml'lik tüp, iki dakika boyunca 2.500 RPM'de santrifüjlenir. Biyogüvenlik kabininde, süpernatanı korteksten çıkarmak için bir cam pipete bağlı vakumlu emme kullanılır. Peleti rahatsız etmemeye veya yerinden çıkarmamaya dikkat edin.

B 27 ve glutamat içeren bir ml nöral bazal ortam korteks peletine eklenir ve nazikçe yukarı ve aşağı pipetlenir. Hava kabarcıkları oksidasyon yoluyla hücrelere zarar verebileceğinden, yukarı ve aşağı pipetleme sırasında hava kabarcıkları oluşturmamak çok önemlidir. Daha sonra, pipetin ucuna steril bir kauçuk ampul takarak ve yaklaşık beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek korteksi denemek için kullanılan en geniş açıklığa sahip ateşle parlatılmış arka pipet.

Herhangi bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat edin. Tamam. İşlem, her biri azaltılmış açıklık boyutuna sahip diğer iki cam pipet ile devam etti. Daha önce belirtildiği gibi, tristriasyon işlemi sırasında hiçbir kabarcık oluşmamasını sağlamak önemlidir.

Ayrıca, artık görünür parçalar görmediğinizi de fark etmelisiniz. Medyada korteksin hiçbir parçasını göremeyecek duruma gelene kadar tri derecelendirmesini korumak önemlidir. Asyondan sonra, hücreler iki dakika boyunca 2.500 RPM'de tekrar santrifüjlenir.

Bu, iki parça korteksten beklenebilecek peletin yaklaşık boyutuyla ilgilidir. Santrifüjlemeden sonra, supnatin bir kez daha hücre peletinden çıkarılır. Süper natin çıkarıldıktan sonra, kortekse B 27 ve glutamat içeren bir ml nöro bazal media eklenir ve korteksi yeniden askıya almak için kullanılır.

Hücre peleti, kabarcık eklemekten kaçınmak ve hücre peletinin eşit şekilde dağılmasını ve parçalanmasını sağlamak için bir kez daha dikkatlice yukarı ve aşağı pipetlenir. Hücre süspansiyonuna bir mil daha nöro bazal ortam eklenir ve son hacim iki mil'e getirilir. Daha sonra, yeniden süspanse hücre çözeltisi, hücreleri saymak ve canlılığı değerlendirmek için bir BD biosciences 40 mikron hücre süzgecinden süzülür.

60 mikrolitre taze nöral bazal besiyer, steril bir mikro füj tüpüne yerleştirilir. Daha sonra 60 mikrolitre nöro bazal besiyerine 20 mikrolitre hücre eklenir ve son olarak nöro bazal besiyerdeki hücrelere 20 mikrolitre trian mavisi eklenir. Trian mavisi, hücreler trian mavisi ile boyandıktan sonra artık canlı olmayan hücreleri boyayacaktır.

20 mikrolitreyi bir hemo sitometreye pipetliyoruz ve mikroskop altında inceliyoruz. Canlı hücreler berrak ve yarı saydam görünürken, zarları delinmiş hücreler trian mavisi nedeniyle maviye boyanır. Tipik olarak, korteks başına yaklaşık 2,5 milyon hücre ve 8 milyon hücre elde ederiz.

Normalde bir beyinden iki parça korteks elde ederiz ve hücreler iki millik bir son hacimde yeniden süspanse edilir. Bu nedenle, hücrelerin nihai konsantrasyonu tipik olarak mil başına 2,5 milyon hücre ile mil başına 8 milyon hücre arasındadır. Normalde, cihaz başına yaklaşık 20 mikrolitre hücre yükleriz.

Bu bize cihaz başına 50.000 hücre ile 160.000 hücre arasında bir hücre aralığı verir. Hücre yoğunlukları uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir. Bununla birlikte, birincil nöronların çok düşük bir yoğunlukta tohumlanması tipik olarak hücre ölümüne yol açar Daha önce nöral bazal ortam içeren hazırlanmış cihazlar, steriliteyi korumak için biyogüvenlik kabinine getirilir.

Kuyucuklardan gelen fazla ortam, bir vakum bölümü ile uzaklaştırılır. Ancak, tüm medyayı çıkarmamaya dikkat edilmelidir. Ana kanalda sadece rezervuarlardan aspire eden bazı ortamlar olmalıdır.

Cihazın sol üst haznesine sadece 20 mikrolitre hücre uygulanır. Hücreler cihaza akar ve PLL ile muamele edilmiş yüzeye yapışır. Burada hücreleri ana kanaldan aşağı akarken görebilirsiniz ve bazılarının aslında cama bağlı olduğunu görmeye başlayacaksınız.

Yüklemeden sonra, hücreleri içeren cihazlar, hücrelerin yapışmasına izin vermek için yaklaşık 10 dakika boyunca bir inkübatöre geri yerleştirilir. İnkübatörde 10 dakika kaldıktan sonra, cihazlar bir kez daha biyogüvenlik kabinine getirilir ve rezervuarlar medya ile doldurulur ve cihazlar daha sonra inkübatöre geri yerleştirilir. Kuluçka makinesine ve ortamın ihtiyaç duyduğu nem seviyesine bağlı olarak dikkat edilmesi gereken bazı önemli noktaların cihazlarda her iki ila üç günde bir değiştirilmesi gerekebilir.

Tüm rezervuarları doldurmadan önce üst kuyulara taze ortam yerleştirmek ve bir miktar taze ortamın cihazdan ve ana kanallara akmasına izin vermek iyi bir uygulamadır. Nöronlar burada, canlı hücreleri lekeleyen hücre bazlı bir boya olan kalsiyum ile görselleştirilmiştir. Burada, hücre gövdelerini, aksonları ve dendritleri içeren cihazın so bölmesini veya hücre tarafını görebilirsiniz.

Cihaz boyunca pan yaparken, aksonların cihazın diğer tarafına, saf bir aksonal fraksiyon içeren akson tarafına ulaşmak için büyüdüğü mikro olukları görebilirsiniz. Gösteri amaçlı. Bu floresan etiketli hücreler, balta otomi prosedürünü göstermek için kullanılacaktır.

Nöron cihazının özelliklerinden biri, araştırmacının eksotomi, yani aksonları cihazın saf aksonal fraksiyonundan kesmesine izin vermesidir. Aksonal rejenerasyonu incelemek gibi araştırmalar yapmak için. Keano şimdi nöron cihazında ex otomi yapmayı gösterecek, ex otomi bir vakumla gerçekleştiriliyor.

Aksonal taraftaki kuyunun alt açıklığına steril bir cam pipet yerleştirilir, ortam vakumla aspire edilir. Ana kanaldaki medya da dahil olmak üzere tüm medya, cihazın aksonal tarafından tamamen çıkarılır. Ortam çıkarıldıktan sonra işlemi tekrarlamak için, pipetin ucu ana kanalın ağzına yerleştirilerek ve pipete kuvvetle bastırılarak 150 mikrolitre ortam ana kanala zorlanır.

Daha sonra, ana kanalın açıklığına ve cihazın aksonal tarafının üst kuyusuna vakum uygulanır. Vakum, ana kanal da dahil olmak üzere tüm ortamı aksonal taraftan çıkarmak için bir kez daha kullanılır. Bir kez daha, pipetin ucu ana kanalın açıklığına yerleştirilerek ve pipete kuvvetle bastırılarak 150 mikrolitre ortam ana kanala zorlanır.

Bu noktada araştırmacı, akson kesiminin verimliliğini kontrol etmek için cihazı mikroskop altında görüntüleyebilir. Aksonlar yeterince kesilmezse, işlem gerektiği kadar tekrar edilebilir. Bu videomuzda sizlere E 18 fetal rack kortikal nöronları nasıl hazırlayacağınızı ve nöron cihazına nasıl yükleyeceğinizi gösterdik.

Bu cihazların birincil avantajı, cihazın bir tarafındaki nöron hücre gövdelerinin kültürünü, cihazın diğer tarafındaki saf bir aksonal fraksiyondan ayırma ve bölümlere ayırma yeteneğidir. Umarız bu videoyu bilgilendirici ve faydalı bulmuşsunuzdur. İşte John Lab'den bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler.