Murin Pankreatik Drenaj Lenf Nodlarından Düzenleyici T Hücresi Alt Kümelerinin Belirlenmesi

Düzenleyici T hücreleri veya Treg'ler, bağışıklık sistemi homeostazına aracılık etmek için immünosüpresif etkiler gösteren özel bir T hücresi alt popülasyonudur. Treg'ler, hücre yüzeyi belirteçleri CD4, CD25 ve Neuropilin 1, Nrp1'i ve nükleer transkripsiyon faktörleri çatal başlı kutu P3, Foxp3 ve Helios'u eksprese eder.

Treg'leri fare pankreas drenaj lenf düğümlerinden veya PDLN'lerden izole etmek için konik bir tüpün üzerine metal bir ağ yerleştirin. PDLN'leri ağın üzerine yerleştirin ve dokuyu mekanik olarak ayırmak için öğütün. Kafesin üzerine uygun bir ortam ekleyin, hücreleri tüpe yıkayın.

Santrifüj, ölü hücreleri ve hücresel kalıntıları giderir. Ortamdaki canlı hücreleri yeniden askıya alın. Homojen bir tek hücreli süspansiyon elde etmek için hücreleri yuvarlak tabanlı bir tüpe takılan bir hücre süzgeci kapağından geçirin ve kalan hücre kümelerini ortadan kaldırın.

Florokrom konjuge anti-CD4, anti-CD25 ve anti-Nrp1 antikorları ekleyin. Anti-CD4 ve anti-CD25 antikorları, Treg'ler üzerindeki ilgili hücre yüzeyi antijenlerine bağlanır. Eşzamanlı olarak, anti-Nrp1, Nrp1 reseptörlerine bağlanır.

Hücreleri uygun bir geçirgenlik fiksasyon tamponu ile tedavi edin, hücreleri sabitleyin ve hücresel ve nükleer zarları geçirgen hale getirin. Foxp3 ve Helios'u hedefleyen florokrom konjuge antikorlar ekleyin.

Geçirgenleştirilmiş zarlar, antikorların hücrelere girmesine ve ilgili intranükleer hedeflerine bağlanmasına izin verir. Akış sitometrisi kullanarak hücreleri analiz edin.

Treg'ler, nükleer transkripsiyon faktörleri Foxp3 ve Helios ile birlikte CD4, CD25 ve Nrp1'in pozitif hücre yüzeyi ekspresyonu ile karakterize edilir.

İlk olarak, 15 mililitrelik konik bir tüpü bir rafa yerleştirin. Tüpün üzerine steril bir 250 mikrometre metal ağ yerleştirin. Ağı 1 mililitre RPMI ile durulayın. Daha sonra, lenf düğümlerini metal ağa aktarın ve bunları ağdan öğütmek için bir cımbız kullanın. Hücreleri tüpe akıtmak için ağ üzerine 1 mililitre RPMI uygulayın. Lenf düğümlerinin aktarılması ve öğütülmesi için bu işlemi her numune için üç kez tekrarlayın ve ardından ağı çıkarın.

Tüpleri 433 x g'da ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri yaklaşık 5 mililitre RPM'de yeniden süspanse edin, ardından tüpleri RPMI ile doldurun. Numunelerin santrifüjlenmesinden tüpün RPMI ile doldurulmasına kadar bu işlemi bir kez tekrarlayın.

Tüpleri tekrar 433 x g'da ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 2 mililitre RPM'de yeniden süspanse edin. 2 mililitre hücre süspansiyonunu, hücre süzgeci kapakları olan 5 mililitrelik yuvarlak tabanlı tüplere aktarın.

İlk olarak, PDLN örneklerinden hücre süspansiyonunu 433 x g'da ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücreleri, metin protokolünde belirtildiği gibi yüzey antikorları ile boyayın ve tüpleri 40 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Ardından, her tüpe 200 mikrolitre FACS tamponu ekleyin. 433 x g'da ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bu işlemi tekrarlayın - tamponu ekleyin, santrifüjleyin ve süpernatanı bir kez atın. Hücreleri sabitlemek ve geçirgenleştirmek için hücre peletini 500 mikrolitre geçirgenlik fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Tüpleri gece boyunca 4 santigrat derecede bir buzdolabına aktarın. Ertesi gün, PDLN örneklerinden hücre süspansiyonunu 433 x g'da ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 500 mikrolitre geçirgenlik yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri tekrar 433 x g'da ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Hücreleri, metin protokolünde belirtildiği gibi hücre içi antikorlarla boyayın. Tüpleri 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bundan sonra, her tüpe 500 mikrolitre geçirgenlik yıkama tamponu ekleyin. 433 x g'da ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 500 mikrolitre geçirgenlik yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.

433 x g'da 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca bir kez daha santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 300 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi bir akış sitometresindeki hücreleri analiz edin.