Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Bu prosedürün genel amacı, treg fonksiyonunu ölçmek ve bu fonksiyonlardaki potansiyel gelecekteki kayıpları öngörmek için in vitro bir insan baskılama deneyi kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle hücre stimülatörleri olarak kullanılacak olan kodlanmış boncukların hazırlanması ve test edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise; saf naif CD4+ CD25- T hücrelerinin, in vivo aktive edilmiş CD4+ CD25low T hücrelerinin ve düzenleyici CD4+ CD25high T hücrelerinin izole edilmesi ve bunların, antijen sunan hücreler veya APC'ler olarak kullanılmak üzere ışınlanmış PP BMC'lerle birleştirilmesidir.

Ardından, yanıtlayıcılar olarak naif veya aktive edilmiş T-hücreleri ve APC'ler olarak P BMC'leri kullanılarak tekli kültürler veya aynı koşullarda ancak 1:10 oranında treg eklenmiş ko-kültürler kurulur. Son adım, hücrelerin hasat edilmesi ve tritiyumla işaretli timidin inkorporasyonu yoluyla proliferasyonlarının ölçülmesidir. Nihai olarak elde edilen sonuçlar, naif ile in vivo aktive edilmiş T-hücresi yanıtlarının baskılanması arasındaki farkları ortaya koyabilir.

Benim adım Jeff Woodcliff. Düzenleyici T hücreleri, kendilerine özgü hücre yüzey markerları eksprese etmezler. Bu nedenle, fonksiyonlarını güvenilir bir şekilde ölçebilmek için, en iyi ayrımı sağlayan teknikler kullanılarak izole edilmeleri gerekir.

Fluorescence aktivasyonlu hücre ayıklamanın (FACS), maksimum izolasyon gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, FACS'in elde edebileceği saf hücre popülasyonlarını sunmasıdır. Hücre fonksiyonu daha sonra, burada gösterildiği gibi in vitro supresyon deneylerinde güvenilir bir şekilde test edilebilir. Bu yöntem, sağlıklı bireylerde ve tip 1 diyabet ile ilişkili deneklerde Treg fonksiyonu hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, insan romatoid artriti, sistemik lupus eritematozus, multipl skleroz ve diğer otoimmün hastalıklara da uygulanabilir. Anti-insan CD3 ile aktive edilmiş boncukların kaplanması için.

Orijinal şişeden 1 mL M four 50 toil aktive edilmiş boncuğu 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin ve tüm boncuklar tüpün kenarına yapışana kadar tüpü bir manyetik standa yerleştirin. Ardından, tüp hâlâ manyetik standayken boncuk tamponunu pipetleyerek uzaklaştırın. Daha sonra tüpü manyetik standdan çıkarın ve 1 mL tampon bir ekleyin.

Tüpü tekrar tekrar manyetik standa yerleştirin. Tüp manyetik standadayken tamponu uzaklaştırın. Boncukları tekrar 1 mL tampon 1 içinde resüsponse edin, süspanse edin.

Bu kez ayrıca 40 µL anti-human CD3 ekleyin. Boncukları ve antikoru 37 °C'de 15 dakika boyunca ajite edin. Ardından %0.1 w/v BSA ekleyin ve sonraki 16 saat boyunca ajitasyona devam edin.

Ardından, boncukları bir mililitre tampon iki içerisinde iki ile sekiz santigrat derece sıcaklıkta beş dakika inkübe ederek ve tüp manyetik standdayken tamponu uzaklaştırarak tampon iki ile iki kez yıkayın. Sonrasında boncukları aynı steril koşullar altında bir kez daha yıkayın.

Bu kez bir mililitre tampon üç kullanarak, optimal oranı belirlemek amacıyla hücre başına değişken sayıda CD3 kaplı boncuk ekleyerek antikor kaplama verimliliğini test edin ve 96 kuyucuklu bir plaka içinde, her kuyucuğa üç tekrarlı olarak 50.000 PBMC ekleyin. 37 °C'de 72 saatlik kültürden sonra, bir mikroküri trityumlanmış timidin ekleyin ve inkübasyona sonraki 16 saat boyunca devam edin. Hücreleri çok kanallı bir hasat plakasına veya benzeri bir kaba toplayın.

Sintilasyon sıvısını ekleyin ve kuyuc başına dakika başına sayım değerini veya CPM'yi okuyun. Bir TopCount NXT sintilasyon sayacı veya benzeri bir cihaz kullanarak, deneyimlerimize göre tutarlı bir şekilde 5.000'in üzerinde ancak 15.000'in altında CPM veren değeri baz alarak boncuk-hücre oranını belirleyin. Hücre başına üç boncuk oranı, test edilen tüm insan deneklerde hem yanıtlayıcı hem de Treg hücreleri için genellikle optimal stimülasyonu sağlar.

50 mililitrelik konik tüpü 15 mililitre fal plus ile doldurun. Ardından, kan tüpüne 250 mililitre PBS ekleyerek 50 mililitre buffy coat'un bir altı oranında seyreltmesini gerçekleştirin. Seyreltilmiş buffy coat'tan 25 mililitreyi, katmanları bozmadan yavaşça fial pack'in üzerine ekleyin.

4 °C'de, 800 ×g hızında 30 dakika boyunca santrifüj edin. Fren kapatılmış haldeyken, fial ile tampon çözelti arasındaki beyaz ara faz olan PBMC tabakasını dikkatlice toplayın. Gerekirse, hücreleri tüpün duvarından sıyırarak alın.

Birkaç dakika bekleyin ve hücreleri ara fazdan tekrar toplayın. Hücreleri taze 50 mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri PBS ile doldurup santrifüj ederek pellet haline getirip yıkayın. PBM cs.

Yıkama adımını her seferinde ikişer kez tekrarlayın. İki hücre peletini tek bir tüpte birleştirerek, nihayetinde tüm hücre peletlerini tek bir 50 milliliter tüpte toplayın. Ardından, tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücre canlılığını belirlemek için süspande edilmiş hücrelerden 20 microliter kullanın.

Canlı PBMC'lerin bir mililitresini yeni bir tüpe aktararak test amaçlı APC'ler oluşturun. Ardından dört mililitre besiyeri ekleyin ve hücreleri 5,000 rad ile ışınlayın; geri kalan PBMC'leri içeren tübi PBS tamponu ile tamamlayın. Daha sonra hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 250 ×g'de santrifüj ettikten sonra süpernatanı dökün ve hücreleri aynı karışımın dört mililitresi içinde yeniden süspande edin.

Ardından, PBMC'lere 200 µL max anti CD4 mikroboncuk ekleyin ve hücre-boncuk karışımını 4 °C'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücreleri 40 mL PBS tamponu ile yıkayın ve ardından hücreleri pelletleyin. Sonra süpernatanı dökün ve hücreleri oda sıcaklığında 8 mL degaze PBS tamponu içinde yeniden süspande edin.

Ardından, hücre süspansiyonunu ayırmak için ön ayırma filtrelerini kullanın. Daha sonra PBM CS'yi iki adet 15 mililitrelik tüpe bölün. Her tüpe dört mililitre P BMC ekleyin.

Bir minimax ayırıcıya iki s kolonu sıkıca sabitleyin ve her kolonun altına toplama tüpleri yerleştirin. Ardından, her kolona üç mililitre DGAs PBS tamponu ekleyin; tampon kalmadığında, her tüpteki dört mililitrelik hücre solüsyonunun tamamını, hücre süspansiyonu tamamen tükenmeden önce kolonların üzerine katmanlar halinde ekleyin. Her kolona üç mililitre oda sıcaklığında DGAs PBS tamponu ekleyin ve tamponun toplama tüplerine akmasını bekleyin.

Berrak bir sıvı gelene kadar daha fazla tampon ekleyin. LS kolonlarının üzerine beş mililitre daha DGA tamponu pipetleyin ve ardından LS kolonlarını minimax separatörden çıkarın. Kolonları yeni steril 50 mililitrelik toplama tüplerine yerleştirin.

Yarım mililitre sıvının akmasına izin verin ve ardından yaklaşık dört mililitre olan geri kalan hacmi yavaşça boşaltın. Şimdi, iki CD4 pozitif fraksiyonu birleştirin. Ardından tüpe 50 mililitreye kadar PBS ekleyin ve hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 ×g'de santrifüj ettikten sonra hücreleri sayın.

Hücreleri iki mililitre PBS tamponunda yeniden süspande edin. Fakt boyama için kullanılacak antikorları tek bir tüpte birleştirin: anti CD 14, CD 32, CD 16 ve isteğe bağlı olarak anti CD 4. FLUOROCHROME eksi bir tüpünü boyamak için karışımdan bir alikot alın.

Hücre süspansiyonundan beş µL'yi bir fax tüpüne aktararak FMO tüpünü hazırlayın ve hücreleri önceden hazırlanmış antikor kokteylinden iki µL ile boyayın. Ardından, hücre ayıklama için kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılmak üzere, tek bir florokromla boyanacak olan boyanmamış hücreleri ve fare IgG kaplı boncukları yeni ve ayrı fax tüplerine ekleyin. Daha sonra kokteyle 50 µL anti-human CD 25 PE ekleyin ve bu kokteyli hücre süspansiyonunun geri kalanına ilave edin.

Tüpleri 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri antikor kokteyli ile inkübe ettikten sonra, hücrelere PBS tamponu ekleyin ve ardından onları pellete edin. Peleti, mililitre başına 10⁷ hücre konsantrasyonunda PBS tamponu içinde süspande edin.

CD 25 pozitif T hücrelerinin ayıklanması için eşik değerini belirlemek amacıyla FMO tüpünü kullanın. Bu kapılama stratejisini kullanarak, önce, bu şekilde gösterildiği üzere monositleri, makrofajları ve diğer tüm CD 4 pozitif T hücresi olmayan hücreleri içeren fitz pozitif hücreleri dışlamak için fitz negatif hücrelerin etrafına bir kapı belirleyin. Ayrı bir grafikte, bu şekilde olduğu gibi CD 25 negatif ve CD 25 düşük T hücreleri ile CD 25 yüksek treg hücreleri için kapılar çizin.

Akış sitometrisi sonrası hücre alt kümelerini sıraladığınızda, toplama tüplerini santrifüj ederek çöktürün ve T hücrelerini ekim aşamasına kadar buz üzerinde tutun. U tabanlı 96 kuyucuklu bir plakayı tablodaki gibi etiketleyin. %10 havuzlanmış insan AB serumu içeren tam besiyeri içerisinde, kuyucuk başına yanıt veren hücre başına üç boncuk konsantrasyonuna göre hesaplanmış 50 µL CD3 kaplı boncuk alikotunu 96 kuyucuklu plakaya ekleyin; ardından önceden ışınlanmış APC'leri besiyerinde 5 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyonuna gelecek şekilde dilüe edin.

96 kuyucuklu plakaya 50 µL hücre ekleyin ve ardından her kuyucuğa üç tekrar şeklinde 2,5 × 10⁴ CD4 pozitif CD25 negatif veya CD4 pozitif CD25 düşük T hücresi ekleyin; Treg'leri B sırasına ve ko-kültürdeki Tregs only olarak etiketlenmiş kuyucuklara burada gösterildiği gibi 1:10 oranında ekleyin. Ardından plakayı 37 °C'de, %5 CO2 içeren ve doygun nemli bir inkübatörde 72 saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, hücreleri 1 µCi trityumlanmış timidinv ile pulse edin ve timidinin ko-kültürün son birkaç saatinde hücrelere dahil olmasının ardından 37 °C'deki inkübasyona sonraki 16 saat boyunca devam edin.

Çok ekranlı hasat plakası üzerindeki hücreleri toplamak için bir filtre mate hasat cihazı kullanın. Ardından, hasat plakasını daha önceden sintilasyon sıvısı ile doldurulmuş şeffaf bir plastik kapakla kapatın. Son olarak, kuyu başına CPM değerini okuyun.

Sintilasyon sayacı kullanılarak, aşağıdaki nokta grafikleri serisinde görüldüğü üzere, bu sistemle T hücresi alt kümeleri yüksek saflıkta izole edilebilir; burada alt kapıda CD four pozitif CD 25 negatif T hücreleri gösterilmektedir. Bir sonraki şekilde, yüksek derecede saflaştırılmış CD four pozitif CD 25 düşük T hücreleri görülebilir. Akışla sıralanmış CD four pozitif hücrelerden oluşan saf bir popülasyon.

Üst kapı kontrolünde CD 25 yüksek treg hücreleri gösterilmiştir. Sağlıklı deneklerden alınan APC'lerin ve treg'lerin tek hücre tipi kültürlerinde, timidine inklüzyonu ile ölçüldüğünde arka plan değerine kıyasla çok az proliferasyon veya hiç proliferasyon gözlemlenmemiştir; buna karşın, naif CD 25 negatif ve in vivo aktive edilmiş CD 25 düşük T hücreleri belirgin bir proliferasyon sergilemiş ve bu yanıtlayıcı hücre tipleri treg hücreleri ile ko-kültüre edildiğinde bu proliferasyon baskılanmıştır. Bununla birlikte, treg'lerin yanıtlayıcı naif CD 25 negatif ve in vivo aktive edilmiş CD 25 düşük T hücrelerini baskılama kapasitelerinde hafif farklılıklar gözlemlenmiştir.

Kontrol anlamlı değildi. Risk altındaki bireylerden elde edilen APC ve Treg'lerin tek hücre tipi kültürleri, timidini inklüzyonu ile ölçüldüğünde arka plan düzeyinin üzerinde çok az proliferasyon göstermiş veya hiç göstermemiştir. Buna karşılık, naive CD 25 negatif ve InVivo aktive edilmiş CD 25 düşük T hücreleri, sağlıklı kontrollere kıyasla daha düşük proliferasyon seviyeleri sergilemiştir.

Analiz güvenilir sonuçlar verdiği için, yanıt veren T hücreleri treg'ler ve ko-kültürler tarafından daha da baskılanmıştır. Ek olarak, düşük CPM değerlerinin sinyal iletiminde potansiyel kusurlara işaret ettiği ve bunun farklı bir çalışma türünde daha ayrıntılı incelenmesi gerektiği sonucuna varabiliriz. Ancak, risk altındaki deneklerde treg'lerin CD 25 negatif ile CD 25 düşük yanıt veren T hücrelerini baskılama kapasiteleri arasındaki fark anlamlıydı.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlıklı bireylerde ve bağışıklık sistemi baskılanmış (örneğin, tip 1 diyabetli) bireylerde Treg varlığına yönelik başarılı ve güvenilir bir fonksiyonel test için gerekli tüm adımların nasıl sorunsuz bir şekilde birbirine bağlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.