Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Bu prosedürün genel amacı, treg fonksiyonunu ölçmek ve işlevlerinde gelecekteki kayıpları potansiyel olarak tahmin etmek için in vitro bir insan baskılama testi kullanmaktır. Bu, önce hücre uyarıcısı olarak kullanılacak olan kodlanmış boncukların hazırlanması ve test edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, saf naif CD dört pozitif CD 25 negatif T hücresini in vivo aktive edilmiş CD dört pozitif, CD 25 düşük T hücresi ve düzenleyici CD dört pozitif CD 25 yüksek T hücresi N'yi antijen sunan hücreler veya APC'ler olarak kullanılmak üzere yayılan bir PP BMC'lere izole etmektir.

Daha sonraki tek kültürler, aynı koşullar altında APC'ler veya kokültürler olarak P BMC'ler ile yanıtlayıcı olarak naif veya aktive edilmiş T hücrelerinden kurulur, ancak bir ila 10 oranında tregler eklenir. Son adım, hücreleri hasat etmek ve çoğalmalarını tritiye ederek ölçmektir. Timidin dahil edilmesi, sonuçta elde edilen sonuçlar, naif ve in vivo aktive edilmiş T hücresi yanıtlarının baskılanmasında farklılıklar gösterebilir.

Benim adım Jeff Woodcliff. Düzenleyici T hücreleri, benzersiz hücre yüzeyi belirteçlerini ifade etmez. Bu nedenle, işlevlerini güvenilir bir şekilde ölçmek için, en iyi ayrımı sağlayan teknikler kullanılarak izole edilmeleri gerekir.

Maksimum izolasyon gibi diğer yöntemlere göre floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını kullanmanın ana avantajı, faksın elde edilebilecek saf hücre popülasyonlarını sunmasıdır. Hücre fonksiyonu daha sonra burada gösterildiği gibi in vitro baskılama testlerinde güvenilir bir şekilde test edilebilir, ancak bu yöntem sağlıklı ve tip bir diyabetle ilgili deneklerde treg fonksiyonu hakkında bilgi sağlayabilir. İnsan romatoid artriti, sistemik lupus, eri mitoz, multipl skleroz ve diğerleri gibi diğer otoimmün hastalıklara da uygulanabilir.

Orijinal şişeden bir mililitre M dört adet 50 zahmetli aktif boncuk ekleyin ve tüm boncuklar tüpün yan tarafına yapışana kadar tüpü manyetik bir standa yerleştirin. Ardından, tüp hala manyetik standın içindeyken pipetleyerek boncuk tamponunu çıkarın. Ardından tüpü manyetik standdan çıkarın ve bir mililitre tampon ekleyin.

Tüpü manyetik standa tekrar tekrar yerleştirin. Tüp manyetik standın içindeyken tamponu çıkarın. Resus, boncukları bir mililitre tamponda tekrar askıya alın.

Bu sefer 40 mikrolitre anti-insan CD'si de ekliyor: üç. Boncukları ve antikoru 37 santigrat derecede 15 dakika çalkalayın. Daha sonra BS, A hacmi başına% 0.1 ağırlık ekleyin ve sonraki 16 saat boyunca çalkalamaya devam edin.

Daha sonra, boncukları bir mililitre tamponda inkübe ederek boncukları iki kez tampon iki ile yıkayın. İki ila sekiz santigrat derecede beş dakika boyunca iki ve ardından tüp manyetik standın içindeyken tamponu çıkarın. Daha sonra boncukları aynı steril koşullar altında bir kez daha yıkayın.

Bu kez bir mililitre tampon üç kullanarak, optimal oranı belirlemek için hücre başına değişken sayıda CD üç kaplamalı boncuk ekleyerek ve 96 bilyeli bir plakada üç kopya halinde kuyu başına 50.020 5.000 P BMC'yi ALI alıntılayarak antikor kaplamasının verimliliğini test edin. 37 santigrat derecede kültürde 72 saat geçirdikten sonra, bir mikro köri tritiatlı timidin ekleyin ve sonraki 16 saat boyunca inkübe etmeye devam edin. Hücreleri çok ekranlı bir hasat plakasında veya benzeri bir şekilde hasat edin.

Sintilasyon sıvısı ekleyin ve dakika başına sayımları veya kuyu başına CPM'yi okuyun. En yüksek sayım N XT sintilasyon sayacı veya benzerini kullanarak, deneyimlerimize göre sürekli olarak 5.000'in üzerinde, ancak 15.000'den az bir BGBM veren birini kullanarak boncuk / hücre oranını belirleyin. Hücre başına üç boncuk oranı, test edilen tüm insan deneklerde genellikle hem yanıtlayıcı hem de treg hücreleri için en uygun stimülasyonu verir.

50 mililitrelik konik bir tüpü 15 mililitre fal plus ile doldurun. Daha sonra kan tüpüne 250 mililitre PBS ekleyerek 50 mililitre buffy coat bir ila altı seyreltme işlemi gerçekleştirin. Seyreltilmiş buffy kaplamanın 25 mililitresini, katmanları bozmadan fial paketinin üzerine yavaşça yerleştirin.

Dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin. Kırılma kapalıyken, fial ve tampon arasındaki beyaz ara faz olan PBMC katmanını dikkatlice toplayın. Gerekirse, tüpün duvarından hücreleri kazıyın.

Birkaç dakika bekleyin ve ara aşamadan tekrar toplayın. Hücreleri 50 mililitrelik taze tüplere aktarın ve tüpleri PBS peleti ile doldurarak yıkayın. PBM cs.

Yıkama adımını her seferinde iki kez tekrarlayın. İki hücre peletini tek bir tüpte birleştirmek, sonuçta tüm hücre peletlerini tek bir 50 mililitrelik tüpte birleştirin. Daha sonra, trian mavisi dışlama ile hücre canlılığını belirlemek için 20 mikrolitre askıya alınmış hücre kullanın.

Canlı pbmc'nin bir mililitresini yeni bir tüpe aktararak APC'leri test edin. Daha sonra dört mililitre ortam ekleyin ve hücreleri, PBS tamponlu P BMC'lerin geri kalanını içeren tüpün üzerine 5.000 rad ile ışınlayın. Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 250 kez G'de döndürdükten sonra, süpernatanı dökün ve hücreleri aynı karışımın dört mililitresinde yeniden süspanse edin.

Daha sonra pbmc'ye 200 mikrolitre maksimum anti CD dört mikro boncuk ekleyin ve hücre ve boncuk karışımını 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri 40 mililitre PBS tamponunda yıkayın, ardından hücreleri peletleyin. Daha sonra süpernatanı dökün ve hücreleri oda sıcaklığında sekiz mililitre Degas PBS tamponunda yeniden süspanse edin.

Ardından, hücre süspansiyonunu filtrelemek için ön ayırma filtrelerini kullanın. Ardından PBM CS'yi iki adet 15 mililitrelik tüpe bölün. Her tüpe dört mililitre P BMC eklemek.

İki s sütununu bir minimax ayırıcıya kalın bir şekilde yapıştırın ve toplama tüplerini her sütunun altına yerleştirin. Daha sonra, her sütuna üç mililitre DGA PBS tamponu ekleyin, tampon kalmadığında, hücre süspansiyonu tamamen tükenmeden önce her tüpten dört mililitrelik hücre çözeltisinin tamamını sütunların üzerine koyun. Her sütuna üç mililitre DGA oda sıcaklığında PBS tamponu ekleyin ve tamponun toplama tüplerine geçmesine izin verin.

Berrak çıkana kadar daha fazla tampon ekleyin. LS sütunlarına beş mililitre DGA tamponu daha pipetleyin ve ardından LS sütunlarını minimax ayırıcıdan çıkarın. Sütunları yeni steril 50 mililitrelik toplama tüplerine yerleştirin.

Yarım mililitrenin bitmesine izin verin ve ardından hacmin geri kalanını, yani yaklaşık dört mililitreyi yavaşça dışarı daldırın. Şimdi iki CD'yi dört pozitif fraksiyonu birleştirin. Daha sonra tüpe 50 mililitreye kadar PBS ekleyin ve hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 400 kez G'de döndürdükten sonra hücreleri sayın.

Hücreleri iki mililitre PBS tamponunda yeniden askıya alın. Gerçek boyama için kullanılacak antikorları bir tüp anti CD 14, CD 32, CD one 16 ve isteğe bağlı olarak anti CD four'da birleştirin. FLUOROCHROME eksi bir tüpü boyamak için bir karışım alikotu alın.

Tüp mililitre hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini bir faks tüpüne aktararak FMO tüpünü hazırlayın ve hücreleri önceden hazırlanmış antikor kokteylinden iki mikrolitre ile boyayın. Ardından, hücre sıralama için kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılmak üzere yeni ayrı faks tüplerine tek bir florokrom ile boyanmak üzere fare IgG ile kaplanmış boyanmamış hücreleri ve boncukları ekleyin. Daha sonra kokteyle 50 mikrolitre anti-insan CD 25 PE ekleyin ve kokteyli hücre süspansiyonunun geri kalanına ekleyin.

Tüpleri 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri antikor kokteyli ile inkübe ettikten sonra, hücrelere PBS tamponu ekleyin ve ardından Resus'u peletleyin. Peletleri PBS tamponunda mililitre lideri başına 10 ila yedi hücre konsantrasyonunda askıya alın.

CD 25 pozitif T hücrelerinin sıralanması için eşiği ayarlamak için FMO tüpünü kullanın. Bu geçit stratejisini kullanarak, önce, bu şekilde gösterildiği gibi monositleri, makrofajları ve diğer tüm CD dört pozitif T olmayan hücreleri içeren fitz pozitif hücreleri dışlamak için fite negatif hücrelerin etrafında bir yürüyüş ayarlayın. Ayrı bir çizimde, CD 25 negatif ve CD 25 düşük T hücreleri ve CD 25 yüksek treg hücreleri için bu şekilde olduğu gibi yürüyüşler çizin.

Akıştan sonra, hücre alt kümelerini sıralayın, toplama tüplerini peletleyin ve ardından T hücresini kaplanana kadar buz üzerinde tutun. Tabloda gösterildiği gibi bir U alt 96 kuyulu plakayı etiketleyin. 50 mikrolitrelik bir CD alikotu olan üç kaplamalı boncuk, 96 oyuklu plakada% 10 havuzlanmış insan AB serumu ile tam ortamda kuyu konsantrasyonu başına üç boncuk olarak hesaplandı, daha sonra daha önce ışınlanmış APC'leri ortamda beş kez 10 ila beşinci hücrelere kadar seyreltin.

96 oyuklu plakaya 50 mikrolitre hücre ekleyin ve daha sonra dört CD dört pozitif CD 25 negatif veya CD dört pozitif CD 25 düşük T hücresine 2.5 kez 10 ekleyin, üçlü olarak oyuk başına B satırına treg ekleyin ve burada gösterildiği gibi bir ila 10 oranında sadece ko-kültürün tregleri olarak etiketlenen kuyucuklara. Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede 37 santigrat derecede, doymuş nemde% 5 CO2 içeren bir inkübatörde 72 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücreleri bir mikro küri tritiata timidin ile vurun ve daha sonra timidin ko-kültürün son birkaç saatinde dahil edildikten sonraki 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübasyona devam edin.

Hücreleri çok ekranlı bir hasat plakasında hasat etmek için bir filtre montaj ilişkisi biçerdöver kullanın. Ardından hasat plakasını daha önce bir sintilasyon sıvısı ile doldurulmuş şeffaf plastik bir kapakla örtün. Son olarak, kuyu başına BGBM'yi okuyun.

Bir parıldama sayacı kullanılarak, T hücresi alt kümeleri, aşağıdaki nokta grafiği serisinde görüldüğü gibi, bu sistem tarafından yüksek saflıkta izole edilebilir: CD, dört pozitif, CD, 25 negatif T hücresi burada alt kapıda gösterilmiştir. Bu sonraki şekilde, yüksek oranda saflaştırılmış CD dört pozitif CD 25 düşük T hücresi burada görülebilir. Saf bir akış popülasyonu CD dört pozitif olarak sıralandı.

CD 25 yüksek treg hücreleri üst kapı kontrolünde gösterilir. Sağlıklı deneklerden alınan APC'lerin ve treglerin tek hücre tipi kültürleri, timidin dahil edilmesiyle ölçüldüğü gibi arka plan üzerinde çok az proliferasyon sergiledi veya hiç proliferasyon göstermedi, oysa naif CD 25 negatif ve in vivo aktive edilmiş CD 25 düşük T hücreleri, bu yanıtlayıcı hücre tipleri treg hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde baskılanan belirgin proliferasyon sergiledi. Treglerin yanıtlayıcı naif CD 25'i baskılama kapasitesinde hafif farklılıklar olmasına rağmen, negatif ve in vivo aktive edilmiş CD 25 düşük T hücreleri gözlendi.

Önemli bir kontrol değildi. Risk altındaki deneklerden APC'lerin ve Treg'lerin tek hücre tipi kültürleri, timidin dahil edilmesi ile ölçüldüğü gibi arka plan üzerinde çok az proliferasyon sergiledi veya hiç proliferasyon göstermedi. Naif CD 25 negatif ve InVivo aktive edilmiş CD 25 düşük T hücreleri, sağlıklı kontrollere kıyasla daha düşük proliferasyon seviyeleri sergiledi.

Yanıtlayıcı T hücreleri, test güvenilir sonuçlar verdiği için tregler ve kokültürler tarafından daha da baskılandı. Ek olarak, düşük CPM değerlerinin, farklı bir çalışma türünde daha fazla araştırılması gereken sinyal iletiminde potansiyel kusurları önerdiği sonucuna varabiliriz. Bununla birlikte, risk altındaki hastalarda CD 25 negatif ve CD 25 düşük yanıtlayıcı T hücrelerini baskılama kapasitesindeki fark anlamlıydı.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlıklı deneklerde ve bağışıklık sistemi zayıf olan deneklerde Treg'lerin varlığı için başarılı ve güvenilir bir fonksiyonel test için gerekli tüm adımları sorunsuz bir şekilde nasıl bağlayacağınızı iyi anlamalısınız. Örneğin, tip bir diyabetli kişilerde.