Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Biz bir kolajen bazlı geliştirdik

Bu prosedürün genel amacı, uzun vadeli bir primer meme kanseri dokusu kültürü oluşturmak ve üç boyutlu büyüme modelini ölçmektir. Bu, ilk olarak sıçan kuyruklarından tip bir kollajenin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, kanser biyopsi örneği hazırlanır ve kollajen matrisine gömülür.

Kültürde 20 gün sonra, meme kanseri dokusu immünofloresan ile boyanır, optik projeksiyon tomografisi kullanılarak boyanır ve taranır ve veriler yeniden yapılandırılır ve ölçülür. Sonuç olarak, bir bireyin tümörünün istila modelini gösteren sonuçlar elde edilebilir ve bu da üç boyutlu analiz yoluyla daha fazla ölçülebilir. Ex Vivi kültürlerin en büyük avantajı, fizyolojik bağlamda gerçek kanser materyallerini kullanmasıdır.

Hücre hattı kültürlerinden farklı olarak, primer kanser dokusunu elde etmek zor olduğu için bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi önemlidir. Doğru teknik, başarılı deneysel sonucun şansını optimize edecektir. Bu tekniği göstermek ben ve MRC Technology'den Joanne Farrell olacak Tip bir kollajen çıkarmaya başlamak için.

Dondurulmuş sıçan kuyruklarını çözülene kadar% 70 etanole yerleştirin. Bir neşter kullanarak, tendonları ortaya çıkarmak için üstteki deriyi çıkarın, tendonları kuyruktan çıkarın ve sterilize etmek için% 70 etanole yerleştirin. Toplanan tendonları tartın ve asetik aside aktarın.

Dört santigrat derecede 48 saat karıştırın. Daha sonra, tendon asetik asit karışımını 10.000 kez santrifüjleyin. 30 dakika boyunca yerçekimi ve peleti atın.

S süpernatanına eşit hacimde% 10 sodyum klorür ekleyin ve karışımın gece boyunca dört santigrat derecede beklemesine izin verin. Pipet yapın ve üst tabakayı atın. Daha sonra kollajen açısından zengin çözünmeyen alt tabakayı toplayın ve 10.000 kez 30 dakika santrifüjleyin.

Yerçekimi daha sonra kollajen açısından zengin materyali dört santigrat derecede 0.25 molar asetik asit içinde yeniden süspanse eder ve bir diyaliz torbasına pipetler. Birden 1000'e karşı diyalize girin. Üç gün boyunca dört santigrat derecede asetik asit.

Diyaliz tamponunun günde iki kez değiştirilmesi. Kollajen, bu test için başka bir santrifüjleme aşaması ve asetik asit içinde Resus süspansiyonu ile daha fazla sterilize edilebilir. İnvaziv meme kanseri için küratif cerrahi rezeksiyon sırasında gözle ve neşter kullanılarak rıza gösteren hastalardan alınan çoklu çekirdek biyopsilerle başlayın.

Nedeni bir milimetre küp parçalara bölün, makroskopik olarak farklı yağları kesin ve atın. Numunenin bir neşter bıçağına monte edilmesi, başlık içinde daha iyi görselleştirme sağlar ve diseksiyonu hem doğru hem de güvenli hale getirir. Parçaları MEGM tam ortamına daldırın.

Doku, mililitre başına 0.3 miligram oluşturmak için bu durumda bir saate kadar saklanabilir. Buz üzerinde kollajen jel karışımı, mililitre sıçan kuyruğu kollajeni başına bir miligram, bir ila 1000 filtrelenmiş asetik asit 10 kez D-M-E-M-F 12 ve 0.22 molar sodyum hidroksit pipetleyin Kollajen karışımının 1.2 mililitresini 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Jölelemeyi başlatmak için, plakayı inkübatörden çıkarın.

Tümör parçalarını jöleli kollajenin üzerine yerleştirin ve nazikçe jelin merkezine itmek için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Plakayı bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. A-M-E-G-M tam ortamını beta estradiol ile 3.2 kez 10 ila eksi 10 molar arasında bir nihai konsantrasyona kadar destekleyin.

Jel tahlilleri bir saat boyunca inkübe edildikten sonra, her bir oyuğa 1.2 mililitre takviye edilmiş ortamı dikkatlice ekleyin. Son beta östradiol konsantrasyonu, meme dokusunda bulunan fizyolojik östrojen seviyelerini özetlemek için 1.6 kez 10 ila eksi 10 molar arasında dengelenecektir. Her bir oyuğun iç kenarının etrafına 10 mikrolitrelik bir pipet ucu sürün, her bir jeli dairesel olarak serbest bırakın, böylece her bir jelin ortam içinde serbestçe yüzmesine izin verin.

24 oyuklu plakayı, deneyin sona ermesine kadar haftada iki kez inkübatör değişim takviyeli ortama geri koyun. İnvaziv büyüme, burada bir parlak alan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir. Bir zaman gecikmeli yakalama genişletilmiş odak derinliği videosu, epitelin tümör kenarından çevredeki kollajene istilasını gösterir Yedinci günden dokuzuncu güne kadar 60 saatten fazla.

Ortamı kaldırarak denemeyi sonlandırın ve bir formül ekleyin. Optik projeksiyon tomografisi için 3D tahlil örneklerini immün boyamak için 48 saat boyunca sabitleyici. İlk olarak, sabit numunelerde resmi olarak kuyulardan bir şişeye aktarın.

Sonra 30 dakika boyunca yıkayın. PBS'de,% 0.05 Tween 20 içeren PBS'de seyreltilmiş metanol kullanarak jellerin kademeli olarak dehidrasyonunu gerçekleştirin, dokuyu taze hazırlanmış metanol DMSO% 30 hidrojen peroksit içinde 24 saat boyunca oda sıcaklığında iki ila bir ila üç oranında inkübe edin otofloresanı söndürmek için. Ardından, numuneleri 30 dakika boyunca iki kez yıkayın.

Metanolde, dokunun daha derin kısımlarındaki antijenlerin erişilebilir hale getirilmesini sağlamak için numuneleri eksi 80 santigrat dereceden oda sıcaklığına kadar her seferinde en az bir saat boyunca beş kez dondurun. Daha sonra, seyreltici olarak metanol kullanarak dokuyu 20 arasında% 0.05 T ile PBS'ye geri rehidre edin, epitel içeriğini belirlemek için dokuyu dört santigrat derecede 24 saat boyunca bloke edici çözelti içinde inkübe edin, örnekleri tavşan anti sitokeratin birincil antikorlarında inkübe edin 1.5 mililitre bloke edici çözelti içinde% 5 DMSO ile% 48 santigrat derece boyunca. Numuneleri PBS'de 30 dakika boyunca 24 kez arasında% 0,05 T ile yıkayın. Her.

Dokuyu floresan sekonder antikorlarda inkübe edin, dört santigrat derecede 48 saat boyunca% 5 DMSO içeren 1.5 mililitre bloke edici çözelti içinde seyreltin. Numuneleri PBS'de tekrar %0,05 ile 24 kez 30 dakika boyunca yıkayın. Optik projeksiyon tomografisi için numune hazırlamak için, leke jelini %1 düşük erime noktalı aase'ye monte edin ve 24 saat boyunca %100 metanol içinde susuz bırakın.

Daha sonra, numuneyi 48 saat boyunca BABB çözeltisinde temizleyin. Numuneleri OPT 3001 M tarayıcıyı kullanarak tarayın. Hem hedef hem de otofloresan, sırasıyla SI üç ve GFP bir filtre setleri kullanılarak yakalanır.

Numune, şeffaf bir aro jel silindiri içinde desteklenir ve 0,9 derecelik açısal adımlarla döndürülür. Statik numunenin dijital bir görüntüsü, döndürülen 400 konumun her birinde alınır. İstila tahlili boyunca bir dizi enine kesit dilimi oluşturarak OPT'de elde edilen açısal projeksiyonlar kümesini yeniden oluşturmak için n keşif yazılımını kullanın.

Sitokeratin ile epitel hacmini ölçmek için hız yazılımını kullanarak yeniden yapılandırılmış verileri analiz edin. Boyama, hedef kanaldaki arka plan floresansından kaynaklanan paraziti azaltmak için minimum bir voksel yoğunluğu eşiği ayarlayın. Burada. Bu eşik ampirik olarak 9.000 keyfi birimde tanımlanmıştır.

Son olarak, ölçüm uygulamasındaki mevcut parametrelerin bir listesini ve bir tümör büyümesindeki epitel hacmini ölçmek için epitel sürekli olarak orijinal bir çekirdeği ayıran Otofloresan kanalından gelen verileri kullanın. Kollajen kültüründe 20 gün sonra sabitlenen ve daha sonra sitokeratin için boyanan tipik bir test burada gösterilmiştir. Velocity yazılımı, hem orijinal çekirdek hem de müstakil istilacı hücre gruplarıyla sürekli olan epitel kütlesini tanıyabilir ve her hacmi ayrı ayrı ölçebilir.

Elde edilen orijinal biyopsiler, ex Vivi kültürleri takiben çeşitli tümörlerden alınmıştır. Proliferasyon veya apoptoz veya benzeri herhangi bir oranlarını belirlemek için immünohistokimya veya immünofloresan gibi diğer teknikler de kullanılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, translasyonel meme kanseri araştırmaları alanındaki araştırmacıların meme kanseri olan bireylerde ilaç direncini belirleme yöntemlerini keşfetmelerine izin vermiştir.