Name: Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Keşfedin optik projeksiyon tomografi ile insan meme kanseri örneklerinin uzun vadeli kültür ve üç boyutlu büyüme analizi. Bu yöntem, primer tümör davranışını fizyolojik bağlamda inceleyerek ilaç yanıtını değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lorna Renshaw (Edinburgh Meme Birimi), klinik örneklerden elde onu değerli yardım için teşekkür ederim. Tümör malzeme kullanımı Lothian Araştırma Etik Komitesi (08/S1101/41) tarafından onaylanmış ve Deneysel Kanser Tıp Merkezi programı (Edinburgh) himayesi altında elde edilmiştir. Bu çalışma, İskoç Finansman Konseyi tarafından desteklenmektedir. ADL Miss Margaret Butters Reekie Güven klinik arkadaşı.

1. Rat Tails Kollajen ayıklanıyor <ol><li> % 70 etanol içinde dondurulmuş taze sıçan kuyrukları yerleştirin. </li><li> Bir neşter açığa tendonlar ile örten cilt Deglove. </li><li> Tendon kuyruk ve sterilize etmek için% 70 etanol yer uzak soyun. </li><li> Toplanan tendon ve asetik asit (250ml 0,5 M asetik asit 1g tendon) transfer tartılır. 4 48hr karıştırın ° C. </li><li> 30 dakika 10.000 g / tendon asetik asit karışımı Santrifüj ve pelet atın. </li><li> Süpernatantı eşit miktarda% 10 (w / v) NaCl ekleyin ve karışımı 4 gecede bekletilmesi ° C. </li><li> G. 10.000 ilave bir 30 dakika için kollajen zengin, çözünmez alt katman ve centrifugate toplayın </li><li> Süspanse edin 4 0.25m asetik asit kollajen zengin malzeme ° C ve 4 ° C'de 3 gün boyunca, günde iki kez diyaliz tampon değişen 1:1000 asetik asit karşı diyaliz. </li><li> Ayrıca 4 santrifüj (20.000 g 2saat için) ve mağaza kollajen çözümü sterilize ° C. </li><li> 1mg/ml bir stok konsantrasyonu steril 1:1000 asetik asit ilavesi ile gerektiği gibi kolajen sulandırınız. </li></ol> 2. 3D Testi Oluşturma 3D testi bir hücre hattı assay dayalı, daha önce 2 yayınladı. <ol><li> Çoklu çekirdek biyopsisi, invaziv meme kanseri için küratif cerrahi rezeksiyon zaman olan hastalarda rıza hasat edilir. </li><li> Göz, 1mm 3 parça halinde bir neşter kullanılarak çekirdek bölün. Düzeltin ve makroskopik farklı yağ atın. </li><li> MEGM Komple medya parçaları bırakın. Bu durumda doku kadar 1hr saklanabilir. </li><li> Buz 1mg/ml sıçan kuyruğu kollajen kollajen jel, mix oluşturmak için, 1:1000 filtreli asetik asit, 10x DMEM/F12 3:5:1:1 bir oran ve 0.22M NaOH 0.3 nihai kollajen konsantrasyonunu oluşturmak için mg / ml. </li><li> 37 ° 1.2ml, kollajen karışımı bir inkübatör içine 24 plaka yeri ve bireysel kuyulara enjekte ° C'de 10 dakika süreyle jelleşme başlatmak için. </li><li> 10dk sonra kuvöz, 24 plaka kaldırın. Jelleşme kollajen tümör parçaları yerleştirin ve yavaşça 10μl bir pipet kullanarak jel merkezine onları itmek. 24 plaka 1hr inkübatör dönün. </li><li> ER + tümörleri için, 3.2x10 -10 M. bir konsantrasyon ile β-estradiol MEGM Komple medya ek Jel deneyleri 1hr jel sonra, her bir kuyunun içine dikkatlice takviye medya 1.2ml tanıtmak. Tahlil içinde son β-östradiol konsantrasyonu 3 meme dokusunun fizyolojik östrojen düzeylerini özetlemek 1.6x10 -10 M equilibriate. </li><li> Böylece medyanın her jel içinde serbestçe yüzen dairesel sağlayan her jel bırakmadan, her bir kuyunun iç kenarı etrafında bir 10μl pipet, çalıştırın. Kuvöz, 24 plaka dönün. </li><li> Exchange medya deney sona kadar haftada iki kez desteklenmelidir. Medya çıkarılması ve formalin fiksatif ekleyerek deney sonlandırın. </li></ol> 3. Optik Projeksiyon Tomografi için hazırlık Testi Antikor Boyama Biz tüm numune boyama 4 için daha önce yayınlanmış bir yöntem benimsedik . <ol><li> Formalin sabit örnekleri PBS içinde 30 dakika yıkayın. :% 0.05 Tween 20 (% 0.05 PBST) içeren PBS her aşamasında% 33,% 66 ve% 100 ≥ 15dk seyreltilmiş metanol kademeli jeller dehydrate. </li><li> DMSO::% 30 H 2 O otofloresans gidermek için oda sıcaklığında 24 saat için 2:01:03 'lik bir oran (% 15 v / v H 2 O 2) 2 taze hazırlanmış MeOH doku inkübe edin. </li><li> Örnekleri metanol içerisinde 30 dakika için iki kez yıkayın. Numuneler -80 ° C oda sıcaklığında (RT) en azından geri 1hr her zaman ve doku derin kısımlarında bu antijenleri sağlamak için beş kez işlenir erişilebilir dondurun. </li><li> Seyreltici (her adımda% 33,% 66 ve 15 dakika için% 100) olarak metanol ile geri% 0.05 PBST doku rehidrate. </li><li> 24 saat için çözüm engelleme (% 0,05 PBST serum% 10) doku engelleyin. </li><li> 48hr için% 5 DMSO içeren engelleme çözüm 1.5ml içinde seyreltilmiş 1:500 konsantrasyonda anti-sitokeratin tavşan kullanarak, epitel içeriğini belirlemek için doku primer antikor ile inkübe edin. </li><li> 30 dakika her biri için% 0.05 PBST örnekleri dört kez yıkayın. </li><li> 48hr için% 5 DMSO içeren 1.5ml engelleme çözüm seyreltilmiş ikincil floresan antikor (1:100 keçi anti-tavşan Alexa555), doku inkübe edin. </li><li> Örnekleri 30 dakika her biri için% 0.05 PBST dört kez tekrar yıkayın. </li></ol> 4. Optik Projeksiyon Tomografi Optik projeksiyon tomografi, 15 milimetre 5 kalınlığında floresan biyolojik örneklerin yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntüler üretmek için önceden geliştirilmiş bir mikroskopi tekniği. <ol><li> Mount ssaklanmaktadır% 1 düşük erime noktası agaroz jel ve 24 saat için% 100 metanol kurutmak. Babb çözümü (1:2 Benzil alkol, Benzil benzoat) 48hr için örnek temizleyin ve OPT 3001M Tarayıcı (Bioptonics) kullanarak tarama. </li><li> Hem hedef ve otofloresans Cy3 filtre seti (uyarıcı 545nm/30 nm, yayıcı 610 / 75 nm) ve sırasıyla GFP1 filtre seti (uyarıcı 425nm/40 nm, yayıcı LP475 nm) kullanarak yakalanır. </li></ol> 5. İmar ve 3D kantifikasyon <ol><li> OPT tarafından satın açısal projeksiyonlar kesit dilimleri işgali tahlil aracılığıyla bir dizi oluşturmak için NRecon yazılımı (SkyScan) kullanarak yeniden olabilir. Bu yazılımı ücretsiz olarak indirmek için kullanılabilir. <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Volocity yazılım (Perkin Elmer) kullanarak yeniden inşa verileri analiz edin. Gösteri Ücretsiz yazılımı indirmek için kullanılabilir. <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> Sitokeratin boyanarak epitel hacmi ölçmek için, hedef kanal eşiğe girişimi azaltmak için en az voksel yoğunluğu eşik ayarlayın. Biz mevcut parametrelerin ölçümü uygulaması listesini kullanarak 9000 au ampirik bu eşiğin tanımlanan orijinal çekirdek (autofluorescent kanal demarcated) süreklilik epitel hacmi sayısal Bu bize farklı arasındaki epitel akıbet hacimleri ölçmek için izin tümör örneği. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Testin geliştirilmesi sırasında, toplam 52 meme kanseri biyopsi örneklerinde histopatoloji geniş bir yelpazesi ile kullanılmaktadır. Bunlardan &lt;% 10 (5 / 52) en az bir canlı işgali tahlil sağlamak için başarısız oldu. Testi yetmezliği, bakteriyel enfeksiyon ya da üstü ya da yetersiz tümör biyopsisinin malzeme nedeniyle oldu. Bu nedenle testin uygulanması, meme kanserinin belirli bir alt tipi ile sınırlı değildir. Tipik testleri (Şekil 1), 20 gün sonra kolajen kültür sabit ve sonradan sitokeratin boyandı. Volocity yazılım orijinal çekirdek ve müstakil hücreleri istila grupları ile sürekli epitel toplu hem de tanımak ve her birimin ayrı ayrı ölçmek için yapabiliyor. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Fiksasyon ve miktar aşağıdaki Şekil 1 Invasion testleri. Birden fazla meme kanseri alt tiplerinin elde edilen numunelerin tahlil destekler: a) ER + b) HER2 + ve c) ER-.

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW ve JF MAM Teknoloji, Bioptonics OPT tarayıcılar ticarileştirmek tarafından istihdam edilmektedir. Diğer yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Kanser hücre hatları davranışlarını incelemek için kolajen bazlı testlerin artık yaygın olarak 6,7,8 kullanılır . Bununla birlikte, bu testlerin, tümör ve çevresinin tam karmaşıklığı yansıtılmaz. Bu çalışmada, insan meme kanseri malzemeleri, benzer bir biçimde, ex vivo kullanılabilir . Ayrıca, OPT, meme kanseri 3D genişleme karakterize etmek için yararlı bir araçtır. Biz bu tekniğin ana sınırlama tümör malzemeleri (tek bir biyopsi 4-6 deneyleri için yeterli) olduğu bulundu. Başka bir sınırlayıcı faktör yapısal işgali, sadece testlerin yaklaşık% 40 oluşur. Bunu aşmak için, düzenli olarak görünür büyüme ile 7 gün etrafında istenen herhangi bir tedavi tüm analizler eklemek. OPT kullanımı da toplu değişiklik, ex vivo, ilaç tedavisinden kaynaklanan algılamak için gelecekte uzatılabilir. Bu da daha bireyselleştirilmiş kanser tedavisi, hayvan modellerinde bağımsız kolaylaştırabilir. Şu anda ER + tümörler tamoksifen ex vivo yanıt keşfediyoruz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog No. </td></tr><tr><td> Komple MEGM </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> ß-östradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E8875-250mg </td></tr><tr><td> Tavşan, anti-sitokeratin </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> Keçi anti-tavşan Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> Tüm diğer standart reaktifler Sigma-Aldrich elde edildi.

optik projeksiyon tomografi İnsan meme kanseri Örnekler ve analiz uzun vadeli kültür

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Meme kanseri, Batı dünyasının önde gelen ölüm nedenidir. Bu, ilk önce meme kanserinin yayılmasını yerel ve daha sonra distalde, hasta prognozu önemli bir faktör olduğunu kurulmuştur. Deneysel meme kanseri sistemleri, genellikle birincil tümörler veya plevral efüzyon türetilen hücre hatları güveniyor. Iki büyük engel bu araştırma engel: (i) bazı bilinen meme kanseri (özellikle kötü prognoz luminal B tümörler) alt türleri mevcut hat koleksiyonları içinde temsil edilmemektedir, (ii), tümör mikroçevresinin etkisi genellikle dikkate alınmaz. Biz tüm alt türleri kültür primer meme kanseri örneklerinde bir teknik göstermektedir. Bu tümör küçük parçalar Ben yastıklar, yumuşak sıçan kollajen gömülü olduğu üç boyutlu (3D) kültür sistemi kullanılarak elde edilir. 2-3 hafta içinde, tümör hücreleri, kollajen yayılmış ve insan tumours1 görülenlere benzer çeşitli yapılar oluşturur. Canlı adipositler, orijinal çekirdek içinde epitel hücreleri ve fibroblastlar histoloji belirgindi. Squamoid morfolojisi malign epitel hücreleri çevreleyen kolajen içine işgalci gösterildi. Nükleer pleomorfizm, mitotik figürler ve apoptotik organları ile birlikte, bu hücrelerin içinde açıkça görülmüştür. Biz kültür tümörün yayılma derecesi ölçmek için Optik Projeksiyon Tomografi (OPT), 3D görüntüleme teknolojisine, istihdam var. Biz, tümör kültür toplu hacmini ölçmek için OPT, bir parametre, ilaç tedavisine yanıtı değerlendirmek için rutin meme kanseri hastalarının, neo-adjuvan tedavi sırasında ölçülen. Burada alt türü önyargısız kültür insan göğüs tümörleri bir fırsat ve bu ex vivo yayılmasını ölçmek. Bu yöntem gelecekte orijinal tümör ilaç duyarlılığını ölçmek için kullanılan olabilir. Bu, şu anda kullanılan hücre hatları daha prediktif model sağlayabilir.

Biz bir kolajen bazlı geliştirdik<em&gt; In vitro</em&gt; Tüm meme kanseri alt tiplerinin örnekleri çoğalması ve işgali teşvik tahlil. Optik Projektör Tomografi, üç boyutlu mikroskopi tekniği tümör genişlemesi görselleştirmek ve ölçmek için kullanılmıştır. Bu testte, bireysel tümör örneklerinin ilaç tepkisini ölçmek için kullanılıyor olabilir.

Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Meme kanseri, Batı dünyasında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Meme kanserinin önce lokal, ardından ise... şeklinde yayılmasının iyi bilinen bir gerçek olduğu kabul edilmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, primer meme kanseri dokusundan uzun süreli bir kültür oluşturmak ve üç boyutlu büyüme paternini nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle sıçan kuyruklarından tip bir kolajen ekstrakte edilerek gerçekleştirilir. Ardından, kanser biyopsi örneği hazırlanır ve kolajen matrise gömülür.Kültürde geçirilen 20 günün ardından, meme kanseri dokusu immünofloresan yöntemle boyanır ve optik projeksiyon tomografisi kullanılarak taranır; elde edilen veriler rekonstrüktüye edilerek nicelleştirilir. Nihayetinde, bir bireyin tümörünün invazyon modelini gösteren ve üç boyutlu analiz yoluyla daha ayrıntılı olarak nicelleştirilebilen sonuçlar elde edilebilir. Ex vivo kültürlerin temel avantajı, gerçek kanser materyallerini fizyolojik bir bağlamda kullanmasıdır.Hücre hattı kültürlerinin aksine, primer kanser dokusu elde etmek zor olduğu için bu tekniğin görsel gösterimi önemlidir. Doğru teknik, başarılı bir deneysel sonuç alma şansını optimize edecektir. Tip 1 kolajen ekstraksiyonuna başlamak için bu tekniği ben ve MRC Technology'den Joanne Farrell göstereceğiz.Dondurulmuş sıçan kuyruklarını, çözülene kadar %70 etanola yerleştirin. Bir skalpel kullanarak, tendonları açığa çıkarmak için üzerindeki deriyi soyun, tendonları kuyruktan ayırın ve sterilize etmek için %70 etanola yerleştirin. Toplanan tendonları tartın ve asetik aside aktarın.4 °C'de 48 saat boyunca karıştırın. Ardından, tendon asetik asit karışımını 10,000 ×g'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve pellet kısmını atın.S süpernatantına eşit hacimde %10 sodyum klorür ekleyin ve karışımı dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca bekletin. Üst tabakayı pipetle çekip atın. Ardından kollajen açısından zengin çözünmeyen alt tabakayı toplayın ve 10,000 ×g hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, kolajen açısından zengin materyali dört °C'de 0.25 molar asetik asit içinde gravitasyonel olarak yeniden süspande edin ve bir diyaliz torbasına pipetle aktarın. Dört °C'de, 1:1000 asetik asit karşıtıyla üç gün boyunca diyalize edin.Diyaliz tamponu günde iki kez değiştirilir. Kolajen, bu analiz için başka bir santrifüj adımıyla daha sterilize edilebilir ve asetik asit içinde yeniden süspande edilebilir. İnvaziv meme kanseri için küratif cerrahi rezeksiyon sırasında, gönüllü hastalardan gözle ve bistüri kullanılarak alınan çok sayıda kor biyopsi ile işleme başlayın.Dokuyu bir milimetreküplük parçalara ayırın, makroskobik olarak belirgin olan yağ dokularını kesin ve atın. Numunenin bir bistüri lamı üzerine yerleştirilmesi, çeker ocak içerisinde daha iyi görselleştirme sağlar ve diseksiyonun hem doğru hem de güvenli şekilde gerçekleştirilmesine olanak tanır. Parçaları MEGM komple besiyerine daldırın.Doku, 0,3 mg/mL'lik bir kolajen jel karışımı hazırlamak için buz üzerinde bir saate kadar bu durumda saklanabilir. 1 mg/mL sıçan kuyruk kolajeni, 1/1000 filtrelenmiş asetik asit, 10 kat D-M-E-M-F 12 ve 0,22 M sodyum hidroksit içerikli kolajen karışımından 1,2 mL'yi 24 kuyucuklu bir plakanın münferit kuyucuklarına pipetleyin ve 10 dakika boyunca 37 °C'deki bir inkübatöre yerleştirin. Jelleşmeyi başlatmak için plakayı inkübatörden çıkarın.Tümör parçalarını jelleşmekte olan kolajenin üzerine yerleştirin ve onları jelin merkezine nazikçe itmek için 10 µL pipet ucu kullanın. Plakayı bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. A-M-E-G-M tam besiyerini, final konsantrasyonu 3,2 × 10⁻¹⁰ M olacak şekilde beta estradiol ile takviye edin.Jel analizleri bir saat boyunca inkübe edildikten sonra, her bir kuyucuğa dikkatlice 1,2 mililitre takviyeli besiyeri ekleyin. Meme dokusunda bulunan fizyolojik östrojen seviyelerini yeniden oluşturmak için final beta estradiol konsantrasyonu 1,6 × 10⁻¹⁰ molar seviyeye dengelenecektir. Her bir jeli çevre boyunca serbest bırakarak besiyeri içinde serbestçe yüzmesini sağlamak için, 10 mikrolitrelik bir pipet ucunu her kuyucuğun iç kenarı boyunca gezdirin.24 kuyucuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve deney sona erene kadar takviyeli besiyerini haftada iki kez değiştirin. Bu aşamada, invaziv büyüme bir parlak alan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir. Zaman gecikmeli yakalama yöntemiyle çekilmiş geniş derinlikli odak videosu, yedinci günden dokuzuncu güne kadar geçen 60 saatlik süre boyunca, epitelyumun tümör kenarından çevreleyen kollajene doğru invazyonunu göstermektedir.Besiyerini uzaklaştırarak deneyi sonlandırın ve bir formülatör ekleyin. Optik projeksiyon tomografisi için 3D assay örneklerini immün boyamak amacıyla 48 saat boyunca fiksatifte bekletin. İlk olarak, formaldehit ile fikse edilmiş örnekleri kuyucuklardan bir viyale aktarın.Ardından bunları 30 dakika boyunca yıkayın. %0,05 Tween 20 içeren PBS içinde seyreltilmiş metanol kullanarak jellerin kademeli dehidrasyonunu PBS içinde gerçekleştirin; otofloresansı söndürmek için dokuyu taze hazırlanmış metanol, DMSO ve %30 hidrojen peroksit karışımında, ikiye bir ve üçe oranında, oda sıcaklığında 24 saat inkübe edin. Sonra, numuneleri iki kez 30 dakika boyunca yıkayın.Dokunun derin kısımlarındaki antijenlerin erişilebilir hale gelmesini sağlamak için, numuneleri metanol içinde -80 °C'den oda sıcaklığına, her seferinde en az bir saat sürecek şekilde beş kez dondur-çöz döngüsüne tabi tutun. Ardından, seyreltici olarak metanol kullanarak dokuyu 0,05%T içeren PBS ile tekrar hidrate edin; epitel içeriğini belirlemek için dokuyu 4 °C'de 24 saat boyunca bloklama solüsyonunda inkübe edin; numuneleri 5%DMSO içeren 1,5 mL bloklama solüsyonu ile seyreltilmiş tavşan anti-sitokeratin primer antikorlarında 4 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Numuneleri 0,05%T içeren PBS ile her biri 30 dakika sürecek şekilde 24 kez yıkayın.Dokuyu, %5 DMSO içeren 1,5 mililitre bloklama solüsyonunda seyreltilmiş floresan sekonder antikorlarda, dört santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. Örnekleri %0,05'lik PBS ile 30'ar dakikalık sürelerle toplam 24 kez yeniden yıkayın. Örnekleri optik projeksiyon tomografisine hazırlamak için boyalı jeli %1 düşük erime noktalı agaroz içerisine gömün ve %100 metanolden 24 saat boyuncayeleterekyeleterek dehidre edin.Ardından, numuneyi 48 saat boyunca BABB çözeltisi ile şeffaflaştırın. Örnekleri OPT 3001 M tarayıcı kullanarak tarayın. Hedef ve otofloresans görüntüleri sırasıyla SI three ve GFP one filtre setleri kullanılarak yakalanır.Numune, şeffaf bir aerogel silindiri içinde desteklenir ve 0,9 derecelik açısal adımlarla döndürülür. Sabit numunenin dijital görüntüsü, döndürülen 400 pozisyonun her birinde alınır. İnvazyon deneyi boyunca bir dizi kesit dilimi oluşturarak OPT ile elde edilen açısal projeksiyon setini yeniden yapılandırmak için n recon yazılımını kullanın.Sito-keratin boyaması ile epitel hacmini belirlemek için yeniden yapılandırılmış verileri velocity yazılımı kullanarak analiz edin. Hedef kanaldaki arka plan floresansının etkisini azaltmak için minimum bir voksel yoğunluk eşiği belirleyin. Bu eşik, ampirik olarak 9, 000 keyfi birim olarak tanımlanmıştır.Son olarak, bir tümör büyümesindeki epitel hacmini belirlemek için ölçüm uygulamasındaki mevcut parametre listesini ve epiteli orijinal çekirdeğe sürekli olarak bağlayan Otofloresan kanalından gelen verileri kullanın. Kolajen kültüründe 20 gün sonra fikse edilen ve ardından sitokeratin için boyanan tipik bir analiz burada gösterilmiştir. Velocity yazılımı, hem orijinal çekirdekle bağlantılı olan epitel kütlesini hem de ayrılmış istilacı hücre gruplarını tanıyabilir ve her bir hacmi ayrı ayrı nicelendirebilir.Elde edilen orijinal biyopsiler, ex Vivi kültürlerini takiben çeşitli tümörlerden alınmıştır. Proliferasyon veya apoptoz oranlarını veya benzeri durumları belirlemek için immünohistokimya veya immünofloresans gibi diğer teknikler de kullanılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, translasyonel meme kanseri araştırmaları alanındaki araştırmacıların, meme kanserli bireylerde ilaç direncini belirleme yöntemlerini keşfetmelerine olanak sağlamıştır.

long-term-culture-human-breast-cancer-specimens-their-analysis-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Huang, Y. et. al., Optik Koherens Tomografi Kullanarak Üç Boyutlu Tümör Sferoidlerinin Boylamsal Morfolojik ve Fizyolojik İzlemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, yüksek çözünürlüklü kesitsel görüntüler yakalayarak çok kuyulu bir plakadaki tümör sferoidlerini izlemek için optik koherens tomografinin (OCT) kullanımını göstermektedir. OCT, hücresel yapılardan gelen ışık yansımalarını analiz ederek, boyut ve şekil gibi morfolojik özellikleri değerlendirmek için 3D modeller oluştururken, aynı...

Optik Koherens Tomografi ile Tümör Sferoidlerinin Morfolojik ve Fizyolojik İzlenmesi 

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Kardiyovasküler hastalığın hayvan modellerinden arteriyel lezyonların ex vivo analizi klasik olarak histolojik ve immünohistokimyasal tekniklere dayanır. Bunlar 3 boyutlu lezyonlarda 2 boyutlu ölçümler sağlar. Bu el yazması, optik projeksiyon tomografisi kullanılarak 3 boyutlu kantitatif analiz için arteriyel lezyonların oluşumunu açıklamaktadır.

Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile

Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Hasta BMPC örneklerinin üç boyutlu kültürleri ve kemik metastatik prostat kanserinin ksenogreftleri orijinal tümörlerinin fonksiyonel heterojenliğini korur ve bu da kistler, sferoidler ve kompleks, tümör benzeri organoidlerle sonuçlanır. Bu makale, heterojen hasta türemiş örneklerin 3D kültürü ve IFC kullanılarak analizleri için bir optimizasyon stratejisi ve protokolü sağlar.

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), translasyonel kanser araştırmalarında, hastalığın hem genetik hem de fenotipik heterojenliğini ve kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavilerine yanıtı yansıtan güçlü bir araçtır. Burada, fenotipik analizlerin ve ilaç yanıtlarının değerlendirilmesine hazırlık olarak insan primer mesane kanseri PDO'ları üretmek için konsolide bir protokol detaylandırılmıştır.

Hassas Tıp Araçları Olarak Mesane Kanseri Organoidleri Kültürü

Periton yüzeylerine metastaz yapmış insan kanserlerinin üretimi, kültürü ve görselleştirilmesi için bir protokol tanımlıyoruz. Rezeke edilen tümör örnekleri bir vibratom kullanılarak kesilir ve oksijenasyon ve canlılığın artması için geçirgen ekler üzerinde kültürlenir, ardından konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak görüntüleme ve aşağı akış analizleri yapılır.

Rezeke Edilen İnsan Tümör Örneklerinden Ex Vivo Organotipik Psödomiksoma Peritonei Tümör Dilimlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Burada, hasta kaynaklı meme tümörü rezeksiyonlarından veya normal meme dokusundan insan meme organoidlerinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Protokol, insan hasta kaynaklı meme organoidlerinin kültürlenmesi, dondurulması ve çözülmesi için kapsamlı adım adım talimatlar sağlar.

Hasta kaynaklı meme organoidlerinin kurulması ve kültürü

Bu protokol, farklı hastalık evrelerinden yumurtalık kanseri organoidlerinin oluşturulması için sistematik bir çerçeve sunar ve verimi artırmak ve sonraki uygulamalar için sağlam uzun vadeli genişleme sağlamak için hastaya özgü değişkenliğin zorluklarını ele alır. Doku işleme, tohumlama, ortam gereksinimlerini ayarlama ve immünofloresan boyama için ayrıntılı adımlar içerir.

Yumurtalık Kanseri Organoidlerinin Biyobankacılığı Stratejisi: Histolojik Alt Tipler ve Hastalık Evrelerinde Hastalar Arası Heterojenliğin Ele Alınması

Keşfedin optik projeksiyon tomografi ile insan meme kanseri örneklerinin uzun vadeli kültür ve üç boyutlu büyüme analizi. Bu yöntem, primer tümör davranışını fizyolojik bağlamda inceleyerek ilaç yanıtını değerlendirir.

Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Daha fazla video keşfet