G Protein-Coupled reseptörleri Agonist Aktivitesi miktarının

Bu prosedürün genel amacı, bir agonistinin reseptörün aktif durumuna olan göreceli afinite sabitinin KB değerini, konsantrasyon yanıt eğrisinin analizi yoluyla tahmin etmektir. Bu işlem, öncelikle bir grup agonistin, bir G-proteini kenetli reseptörde yanıt oluşturma konsantrasyon yanıt eğrilerinin ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, doğrusal olmayan regresyon analizi kullanarak agonistlerin eemax ve EC 50 değerlerini tahmin etmektir.

Bu değerler daha sonra, operasyonel modeli içeren sonraki doğrusal olmayan regresyon analizi için başlangıç parametre tahminlerini hesaplamak amacıyla kullanılır. Son adım olarak, agonistlerin reseptörün aktif durumuna olan afinite sabitlerinin bağıl tahminleri, konsantrasyon yanıt eğrilerinin küresel doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak elde edilir. Nihayetinde, operasyonel modelin modifiye edilmiş bir formu kullanılarak, bir agonistle karşılaştırmalı olarak ifade edilen bir agonistin reseptörün aktif durumuna olan afinite sabiti, konsantrasyon yanıt eğrilerinin küresel doğrusal olmayan regresyon analizi yoluyla tahmin edilebilir.

Bu yöntem, bir agonistin belirli bir sinyal yoluna karşı seçiciliğinin olup olmadığı gibi ilaç keşfi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler matematiksel analizin detayları nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Göreceli agonist KB değerlerinin tahmini için, en az iki agonist konsantrasyon yanıt eğrisinden oluşan bir seri gereklidir.

Bu tür deneylerle ilgili hususların tartışmasını yazılı protokolde bulabilirsiniz. Yanıt eğrilerini elde ettikten sonra, her bir agonist konsantrasyonu varlığında ölçülen değerden bazal yanıtı çıkarın ve konsantrasyon-yanıt deneylerinden elde edilen verileri bir veri tablosuna girmeye başlayın. Prism yazılımında, tüm log agonist konsantrasyonları X olarak etiketlenen sütuna girilir. En büyük maksimal yanıt veya eax değerine sahip olduğu görülen agoniste ait yanıt ölçümleri A sütununa, diğer agonistlere ait olanlar ise yanındaki harf ile adlandırılmış sütunlara girilir.

Konsantrasyon yanıt eğrilerinin tekrarlayan ölçümlerini, harfle belirtilmiş ilgili sütunun alt sütunlarına girin. Verilerin çizildiği grafik sayfasını seçin ve değişken eğim denklemini kullanarak verileri doğrusal olmayan regresyon analizi ile analiz etmek için "analyze" seçeneğini belirleyin; "bottom" parametresini sıfıra sabitleyin ve regresyon analizini gerçekleştirin. Başlangıç parametre tahminlerinin hesaplanmasında kullanılmak üzere "top" ve "log EC 50" parametrelerini kaydedin.

Başlangıç parametre tahminlerini hesaplamak için, gözlemlenen log tau K değerini standart agonistinin negatif log EC 50 değerine eşitleyin. Ardından, her bir test agonistinin log RAI değerini; test agonistinin eemax değeri ile standart agonistinin EC 50 değerinin çarpımının, standart agonistinin emax değeri ile test agonistinin EEC 50 değerinin çarpımına bölünmesinden elde edilen miktarın logaritması olarak hesaplayın. Bu denklemde standart agonistinin parametreleri kesme işareti ile belirtilmiştir.

Ardından, test agonistinin log afinite sabitini, ilgili EC değerlerinin negatif logaritmasına atayın. Verileri Prism'e girdikten sonra, en yüksek EMAX değerine sahip agoniste ait verilerin A sütununa girildiğinden emin olun. Bu agonist artık standart olarak belirlenmiş olurken, diğer agonistler test agonistleri olarak tanımlanır. Sonrasında, kullanıcı tanımlı bir denklem olan log, RAI'yi Prism'e birkaç satır halinde girin.

Bu durumda, kullanıcı tanımlı denklem toplam beş agonisti içermektedir. R kilidinin başlangıç parametre tahminlerini ve test agonistlerinin afinite sabitlerini girin. M sis'e standart agonistinin EMAX değeri atanmış ve M'ye bir değeri atanmıştır.

Şimdi test agonistlerinin log RAI değerlerinin başlangıç parametre tahminlerini girin. log K birini sıfıra sabitleyerek ve log GR, m, sis ve M değerlerini tüm veri setleri için ortak bir değere ayarlayarak parametre kısıtlamalarını uygulayın. Ardından, doğrusal olmayan regresyon analizini başlatın.

Sonuçlar, agonist KB değerlerini ters molar birimler cinsinden mutlak birimlerle tahmin etmek için test agonistlerinin gözlemlenen log K ve log RAI değerlerini verir; burada konstitütif reseptör aktivitesi sergileyen hücre tabanlı vitro deneyler kullanılmıştır. Yazılı protokolde açıklandığı şekilde agonistleri seçin ve deneyi tasarlayın. Konstitütif reseptör aktivitesini ve her bir agonist konsantrasyonuna verilen yanıtı, ölçülen yanıttan, burada gösterilen reseptör ile transfekte edilmemiş hücrelerdeki bazal yanıtın çıkarılmasıyla hesaplayın; ön analiz için çok düşük konstitütif aktivite sergileyen bir sinyal yolu için bu yöntemle hesaplanmış çeşitli agonistlere verilen yanıtlar.

İlk olarak, verileri konstitütif olmayan aktivite için açıklandığı şekilde Prism'e girin. Kabul edin. Ayrıca, konstitütif reseptör aktivitesinin neden olduğu yanıtı, -20 log agonist konsantrasyonuna karşılık gelen satırdaki uygun harflendirilmiş sütunlara girin. Burada, sıfır agonist konsantrasyonunu yaklaşık olarak belirtmek için büyük bir negatif logaritma değeri girilmiştir.

Konstitütif aktivite için alt (bottom) parametresi tüm veri setleri için ortak olacak şekilde kısıtlanarak, verileri daha önce olduğu gibi analiz edin. Paylaşılan parametrenin yanı sıra her agonist için üst (top) ve log EC parametrelerini kaydedin. Standart agonist için log afinite sabiti ayrı deneylerle belirlendikten sonra, her bir kısmi test agonisti için log K gözlemlenen değerinin başlangıç tahminini; standart agonist ile test agonistinin emax değerleri arasındaki farkın, EC 50 ile standart agonist ve konstitütif yanıtın emax değerleri arasındaki farkın çarpımına bölümünün logaritması olarak hesaplayın.

Her bir agonist için log KB'nin başlangıç tahminini ve agonist KB değerlerini tahmin etmek için cis'in log T başlangıç tahminini hesaplayın. Verileri Prism'e girin ve ardından kullanıcı tanımlı bir denklem girin. İki agonist durumu için burada gösterildiği gibi, log KB'yi Prism'de birkaç satır halinde girin.

Ardından, her bir agonistin afinite durumunu girerek başlangıç parametre tahminlerini kaydedin. log T sis tahmini, M sis tahmini ve M tahmini için; M sis'e standart agonistin EMAX değeri atanır ve M'ye bir değeri atanır. Son olarak, log kb başlangıç tahminlerini girin.

log K1'i önceden belirlenmiş değerine sabitleyerek ve log T sis, m sis ve M değerlerini tüm veri setleri için ortak bir değere ayarlayarak parametre kısıtlamalarını uygulayın. Doğrusal olmayan regresyon analizini başlatın. Sonuçlar; standart agonistin log KB değerini, gözlemlenen log K değerini ve parsiyel agonistlerin log KB değerlerini verir.

Burada gösterilen operasyonel modeldeki sistemin maksimal yanıtı, serbest reseptör kompleksi için log T cys değeri ve dönüştürücü eğim faktörü, M three muskarinik reseptörünü stabil olarak eksprese eden Çin hamster yumurtalık hücrelerinde muskarinik agonist tarafından indüklenen fosfoinositid hidrolizidir. Seçilen muskarinik agonistlerin konsantrasyon-yanıt eğrileri bu analizde ölçülmüş ve her bir agonistin KB değeri, Oxo Tremaine M'ninkine oranla ifade edilerek burada açıklandığı şekilde analiz edilmiştir. Teorik eğriler, regresyon denkleminin verilere en küçük kareler yöntemiyle uydurulmasını temsil etmektedir. kabale, a recline, pilocarpine ve McNeil için log RAI tahminleri gösterilmiştir.

A 3, 4 3. Sistemin maksimum yanıtı ve dönüştürücü eğim faktörünün ilgili tahminleri belirlendi. Gösterilen her bir agonist için agonistlerin gözlemlenen log K değerleri de bulundu.

İşte HC 2 93 hücrelerinde muskarinik agonist stimüle fosfoinositid hidrolizi üzerine yapılan deneylerin sonuçları. G alfa 15'i stabil olarak eksprese eden hücrelerde M üç muskarinik reseptörün geçici ekspresyonu, konstitütif reseptör aktivitesine bağlanan bazal fosfoinositid hidrolizinde bir artışa neden olmuştur. Veriler, Oxo Tremaine M ve MacNeil, A 3 43'ün log KB değerlerini tahmin etmek için analiz edilmiştir.

Teorik eğriler, regresyon denkleminin verilere en küçük kareler yöntemine göre uyarlanmasını temsil etmektedir. Oxo Tremoring M ve McNeil, A 3 43 için log KB tahminleri gösterilmiştir. McNeil A 3 43'ün gözlemlenen K değeri tahmini de belirlenmiştir.

Bu veri analiz tekniği bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde birkaç dakika içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir G proteini kenetli reseptörün sinyal yolunda aşağı akışta bir yanıt oluşturmak için kullanılan agonistlerin konsantrasyon yanıt eğrilerinden hem bağıl hem de gerçek KB değerlerinin nasıl tahmin edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.