Name: Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Öğrenin, Ice-Cap yöntemiyle Arabidopsis thaliana ve domates fide kök dokularını 96-kuyucuklu plakalarda hasat ederek yüksek verimli genotipleme yapmayı. Bu teknik binlerce bitkiyi tek günde işlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (hibe sayısı MCB-0.447.750) bir hibe tarafından finanse edildi.

1. Ice-Cap Fide Tabaklar Agar Büyüme Medya ile hazırlayın Erimiş büyüme ortamı (0.5x Murashige ve Skoog (MS), bazal tuz karışımı, 2 mM Morpholinoethanesulfonic asit (MES),% 0.6 agar (w / v), pH 5.7) MicroFill Mikroplaka Dispenseri kullanarak otoklavlanmış Fide Tabaklar içine sürülür. Bir litre medya 18 Fide Tabaklar başına ihtiyaç vardır. <ol><li> Vidalı üst kapakları ve 20 dakika otoklav ile bir litrelik cam şişelerde büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> Otoklav bir litre distile su vidalı kapak ile cam şişe. Aynı zamanda da alüminyum folyo ile sarılmış boş Fide Tabaklar otoklavda. </li><li> 65 yaşında bir kuluçka ayarlamak için otoklava medya ve su transferi ° C Bu sıcaklık, erimiş bir devlet büyüme ortamı devam edecektir. </li><li> Otoklav sonrası, folyo ve kuru laminer akış kaput yer Fide Tabaklar çıkarın. Tabaklar, yapışkanlı bant, böylece geçmeden önce tamamen kuru olmalıdırtamamen plakaların kuyuların alt delik mühür. </li><li> % 95 etanol ile sterilize etmek için bench aşağı doğru silin. </li><li> Sterilize etmek için,% 95 etanol Fide Tabaklar için şeffaf plastik kapaklar bekletin. Laminer akış kaput etanol ve kuru hava kapaklarını çıkarın. Otoklav eriyecek, çünkü plastik kapaklar sterilize etmek için otoklava sokmayın. </li><li> Ambalaj bandını her Fide Plaka altına uygulayın ve sıkıca rulo aracını kullanarak mühür. </li><li> 65 ° C'de su banyosu içinde erimiş büyüme ortamı ve steril suyun şişe yerleştirin. </li><li> MicroFill makineye oda sıcaklığında% 70 etanol içeren bir şişe takın ve tasfiye döngüsü MicroFill makine tesisat sterilize etmek için iki kez çalıştırmak. </li><li> MicroFill makine steril su ile şişe takın. Sıhhi tesisat sıcak ve etanol sistemi temizlemek için temizleme çevrimi altı kez çalıştırın. Bu işlem boyunca şişe su 65 ° C banyo kalmalıdır. </li><li> Steril su ile temizler tamamladıktan sonra, hemen MicroFill makine erimiş büyüme medya şişe takın. Tasfiye döngüsü distile su tesisat temizlemek için iki kez çalıştırın. Bu işlem boyunca 65 ° C banyo şişe büyüme medya kalmalıdır. </li><li> 450 mikrolitre büyüme medya her Fide Plaka kuyuların içine koyun. Hızla büyüme medya MicroFill makine tesisat katılaşarak olmadığını çalışın. </li><li> Fide Tabaklar dolu olduğunda, hemen MicroFill makinenin şişe 65 ° C steril su ekleyin ve temizleme çevrimi sıhhi tesisat temizlemek için 12 kez çalıştırmak. Bu işlem boyunca 65 ° C banyo şişe su kalmalıdır. </li><li> Bir MicroFill makine mevcut değilse, Fide Tabaklar da el-kanallı pipet kullanarak mühürlü plakaların içine erimiş agar pipetleme tarafından hazırlanmış olabilir. </li><li> Her Fide Tabaklar t kuyu kontrol edino büyüme ortamı herhangi bir kuyu dışarı sızdırılmış olmadığından emin olun. Bireysel kuyulara El pipet ek erimiş büyüme ortamı gerektiği gibi. </li><li> Şeffaf plastik bir kapak ile her levha Kapak ve büyüme ortamı oda sıcaklığında Fide Tabaklar katılaşmasını sağlamak. Yığın plakaları ve depolama için alüminyum folyo ile sarın 4 ° C Mağaza plakaları ters depolama sırasında kuyulardan su birikmesini önlemek için. </li></ol> 2. Ice-Cap Fide Tabaklar ve çimlenmeye Fideleri içine Sow Tohumları Daha önce bir tohum yükleme cihazı (2) Fide Tabaklar Arabidopsis tohum dağıtımı için yarı otomatik bir yöntem tanımlanmıştır. Bu cihaz, tohum bazı partiler için yararlı olsa da, biz Arabidopsis tohumu farklı partiler tarafından gösterilen tohum boyutu değişkenlik Bu cihazın genel kullanımını sınırlar bulduk . Biz bu tohum dağıtımı için bir alternatif otomatik bir yöntem geliştirme sürecindeŞu anda biz Fide Tabaklar içine tohum dağıtım için en etkili strateji, aşağıda açıklandığı gibi elle, bu adımı gerçekleştirmeniz olduğunu t bulduk. <ol><li> Whatman filtre kağıdı üzerine kuru tohumları serpin. </li><li> % 95 etanol tüm tohumların etanol ile kaplıdır, böylece tohum üzerine koyun. Bu tedavi yüzeyi tohum sterilize edecektir. </li><li> Tohumları kuru hava için izin ver. </li><li> Değiştirilmiş bir tek cam Pasteur pipeti kullanarak Fide Tabaklar kuyulara bireysel tohumları aktarın. Pasteur pipet ucu yanan tarafından mühürlenir. Ortaya çıkan cam ucu tek bir tohum kolayca kaldırdı ve Fide Plaka kuyulardan agar yüzeyine transfer olmak için izin verir agar medya, hafifçe dokunarak ıslatılır. Bu tohum kaplama aracın çift başlı bir versiyonu da verimi artırmak için kullanılabilir. </li><li> Her Fide Plaka şeffaf plastik kapak ve conta ile Micropore cerrahi bant ile kaplayın. Yığılmış plakaları sarınalüminyum folyo ve mağaza Arabidopsis tohumları ile 4 ° C dört gün için tohumların çimlenme tabakalandırmak ve senkronize etmek için. Domates tohumu dört gün boyunca, 12 ° C'de karanlıkta muhafaza edilmelidir. </li><li> 18 ° - 20 ° C çimlenme başlatmak için floresan ışığı altında Fide Tabaklar yerleştirin. </li></ol> 3. Ice-Cap Çeşmesi Fide Tabaklar transfer Fide Plakalar ışık altında dört gün sonra, Ice-Cap çeşme Fide Tabaklar aktarın. Arabidopsis için, fide genellikle 10 ila 14 gün Ice Cap çeşme bırakılmıştır. <ol><li> Ice-Cap Çeşmesi bir plastik saklama kutusu içine yerleştirilmiş olan özel raf yapının üstüne bir tanımlama levha koyarak birleştirin. Tesviye fındık çerez levha seviyesini ayarlamak için kullanın. Bir dalgıç pompa saklama kutusu yerleştirin ve bir yaylı cla kullanarak çerez levha yan pompa çıkış hortumu eklemekmp. Ice-Cap Çeşmesi, Ice-Cap Çeşmesi yüzey direkt floresan aydınlatma alması için bitki büyüme odası ya da büyüme odasına bir raf üzerinde birleştirin. </li><li> Ice-Cap Çeşmesi 3 parça 1 kısım musluk suyu distile su karışımı ile doldurun. Dalgıç pompa, su seviyesinin altında birkaç santimetre kadar çeşme su ilave edilmelidir. Laboratuvar bant kullanarak plastik saklama kutusu, son su seviyesi ve işaretleme kalemi işaretleyin. </li><li> Kök Tabaklar Kök Plaka her iyi bir 3/32-inch çapında paslanmaz çelik bilya ekleyerek hazırlayın. </li><li> Paslanmaz çelik bilyalar kullanılarak yapılan özel bir top dağıtma cihazı, 1 Kök Plaka eklenebilir . Bu cihaz 96-PCR plaka yüzey üzerine alüminyum folyo tek bir sayfaya yerleştirme ve folyo yüzey üzerinde her bir kuyunun merkezleri yerleri işaretlemek için bir işaretleme kalemi kullanarak yapılır. Bu işaretli levha folyo alüminyum ek bir 6 sayfa üstüne yerleştiriliril ve kullanılan pipet ucu kutusu kapağı ve pürüzsüz bir yüzeye sarılı. Böyle bir ahşap şiş gibi keskin bir aracı daha sonra 96 ​​pozisyonların her biri tek bir metal topu tutmak için yeterince büyük bir çimen oluşturmak için kullanılır. Topları ile bu dağıtım cihazı doldurmak için, aşırı metal topları cihaz üzerinden dökülür ve aşırı topları kaldırmak için hafifçe çalkalanır. Kök Plaka sonra topu Kök Plate her kuyuya bir damla devrildiğinde dağıtım cihazı, üst üzerine yerleştirilir. </li><li> Kök Plaka MicroFill makine kullanarak her bir kuyunun 340 mikrolitre 3 parça 1 kısım musluk suyu distile su karışımı ekleyin. Çelik bilyalar, su dağıtım önce Kök Plaka eklenmiş olduğunu emin olun. </li><li> Fide Tabaklar altındaki kapalı yapışkan film soyun ve plakalar şeffaf plastik kapakları kaldırmak. Kök Plaka metal bir top ve su içeren her Fide Plaka yerleştirin ve iki elastik hai ile birlikte iki tabak güvenlir bantları. </li><li> Ice-Cap Çeşmesi yığılmış Ice-Cap tabak yerleştirin. Plakalar Ice-Cap Çeşmesi zaman açık plastik kapaklar kullanılmamalıdır. Fide Plate A-01 Kök Plaka A-01 ile uyumlu olduğundan emin olmak için kontrol edin. </li><li> Fide çoğunluğu Kök Tabaklar nüfuz kök doku kadar yığılmış Fide / Kök Tabaklar Ice-Cap Çeşmesi bırakılmalıdır. Ice-Cap Çeşmesi Arabidopsis fide için ideal gelişme sıcaklığı yaklaşık. 18 ° C Çerez levha su seviyesi Fide Plate fide batık olduğunu öyle derin, öyle ki su Kök Tabaklar kuyu içine akabilir, ama olmamalıdır. Su seviyesi doğru değilse doğru derinlik farklı bir çerez levha almak gerekir. </li><li> Ice-Cap Çeşmesi, orijinal su seviyesini korumak için periyodik olarak damıtılmış su ekleyin. Çeşme saf distile su ekleyerek yerini alacakçeşme suyu mineral bileşimi değiştirmeden sıvı buharlaşması nedeniyle kaybetti. Ice-Cap Çeşmesi Su seviyesi günlük olarak kontrol edilmelidir. </li></ol> 4. Hasat Kök dokusu Kök dokusu kök Plate suyun donma ve ardından Kök Plaka uzak Fide Plaka soyma hasat edilir. <ol><li> Gün kök doku hasat öncesi, Ice-Cap Çeşmesi'nden yığılmış Ice-Cap Tabaklar çıkarın. </li><li> Yığılmış Fide ve Kök plakalar kuyuları arasında üç ahşap şiş takın. Şiş amacı, dondurma işlemi için hazırlık Kök plakalar kuyulardan Fide Tabaklar hazretleri yükseltmektir. </li><li> Gece ışıkları altında durmak eklenen tahta şiş ile yığılmış Ice-Cap Tabaklar izin verin. Bu kuluçka sonraki dondurma ve plaka ayırma işlemleri kolaylaştıran Kök Tabaklar, sıvı hafif buharlaşma sağlar. </li><li> Üzerindedoku hasat gün, donmuş bir banyo hazırlayın. 96-iyi bir metal termal blok kuru buz ve% 95 etanol karışımı ile kabına yerleştirin. Termal blok ca sıcaklık dengelenmesi için izin ver. 20 dakika. Pyrex çanak yalıtım malzemesi gibi düşük sıcaklık laboratuar tezgah yüzeyine zarar vermez, böylece mitten bir otoklav gibi bazı tip üstüne yerleştirin. </li><li> 5 dakika soğutulmuş termal blok ve inkübe içine tahta şiş ile yığılmış Ice-Cap tabak yerleştirin. Kök Plate Bu süre boyunca katı su donar. Fide Plate fide, bu tedavi sırasında dondurmak ve tam canlı kalmaz. </li><li> Termal blok yığılmış Ice-Cap plakaları çıkartın ve oda sıcaklığında bench üzerine koyun. Lastikleri ve yığılmış plakalar ahşap şiş çıkarın. Fide Plaka üst plakalar "crack" için sıkıca bastırın. Kök Plaka ve Fide Plaka ap soyma sonra dikkatlicesanat. </li><li> Kök Tabaklar su oda sıcaklığında çözünme izin verin. Çözülme 25 termal blok ° C Kök Tabaklar kuluçka hızlandırılmış </li></ol> 5. Mağaza Fide Plate in the Dark Düşük Sıcaklık Doku hasat sonrasında fide plakaları genotip analizi yapıldığında ise fide canlılığını koruyacaktır düşük ısıda karanlıkta saklanabilir. Fide canlılığı etkileyen birkaç hafta boyunca bu sıcaklıklarda saklanabilir. <ol><li> Fide plakanın alt kısmında mühür, yapışkan bant ile doku hasat sonrasında. </li><li> Fide Plaka üstüne şeffaf plastik kapak yerleştirin ve mikropor bant ile sabitleyin. </li><li> Birlikte çeşitli Fide Tabaklar Yığın ve alüminyum folyo ile sarın. </li><li> Arabidopsis fide, 4 tabak ° C Domates fideleri için, 12 ° C'de plakaları Bir kez genotipleme se, tamedlings bu düşük sıcaklık kuluçka kaldırılır ve aşağıda açıklandığı gibi toprak nakledilen olabilir. </li></ol> 6. DNA Ayırma PCR reaksiyonları için uygun DNA, kök doku örnekleri kolayca elde edilebilir. Arabidopsis kök doku örnekleri ele toplam DNA verim ca. Ortalama 2 400 ng. <ol><li> Kök Tabaklar su DNA ekstraksiyon işlemi gerçekleştirmeden önce tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. Herhangi bir kuyu ortalamaya göre önemli ölçüde daha az su olup olmadığını belirlemek için tabak olmadığını kontrol edin. El pipet distile ilave su gerektiren kuyu içine su. </li><li> Kök Plakalar her bir kuyunun 25 mikrolitre; Tris-EDTA solüsyonu (50 mM EDTA, pH8 500 mM Tris, pH 8) eklemek için MicroFill makinesi kullanın. </li><li> Kök plakalar termal sızdırmazlık folyo ve ısı yapıştırma makinesi kullanarak kuyu Seal. </li><li> GenoGrinder makine mühürlü kök tabak yerleştirin.aşağı bakacak şekilde plakalar mühürlü sonuna. Bu plaka yönünü, en iyi boncuk hareketi sağlar ve boncuk kuyularda yapışmasını önler. Dakikada 1350 vuruş GenoGrinder plakalar 3 ½ dakika sallayın. </li><li> Mikroplak taşıyıcıları ile bir santrifüj plakaları transferi ve 3500 RPM hızında 10 dakika boyunca plakalar döndürmek 4 ° C pelet için pulverize kök doku. </li><li> Sonucunda seyreltilmiş özü doğrudan PCR reaksiyonlarında kullanılabilir genomik DNA içerir. Tipik bir PCR reaksiyonu bu DNA özü 2 mikrolitre katacak. </li><li> DNA örnekleri depolama için mikroplak mührü yapışkanlı bant ve yer eksi 20 ° C DNA örnekleri kalitesinde belirgin bir azalma ile birkaç ay boyunca saklanabilir. </li></ol> 7. Toprak için İstenilen Genotip ile Fideleri aktarın Genotip analizi tamamlandıktan sonra, istenilen genotipi ile fideler Fide transfer edilebilirToprağa Tabaklar. <ol><li> Fide Plakalar soğuk depolama çıkarın ve suya doymuş toprak karışımı ile tencere hazırlamak. </li><li> Fide Plaka ayrı bir fide çıkarmak için, bir fide zarar vermeden agar fişi kapmak için olanak sağlayan bir forseps kullanın. Forseps ile agar fişi fide zarar vermemek için dikkatli olmak Fide Plaka agar fiş alın ve yavaşça kaydırın. Alternatif olarak, basınçlı hava agar tak ve hafifçe dışarı fide iyi çekmek için kullanılabilir. Fiş bench üzerine dışarı çıkar kadar kuyunun altındaki küçük delikten basınç uygulayın. </li><li> Toprak agar fişi boyutu küçük bir delik hazırlayın. Toprak agar fiş yerleştirin ve toprak fide güvenliğini sağlamak için agar fişi etrafında nemli toprak paketi. Herhangi bir fide her yerinden agar kaldırmak için teşebbüs etmeyin. </li><li> Standart büyüme koşulları altında bir büyüme odasında nakledilen fide yerleştirin. Için plastik bir kapak ile tencerenin kapağını kapatın.İlk iki gün sonra nakli. Daha sonra kapağını kaldırın ve bitkilerin standart koşullar kullanarak büyümeye devam ediyor. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 4A, Ice-Cap sistemi kullanılarak yetiştirilen Arabidopsis fidelerinin bir örnek gösterilmiştir . Bu fide resmi alındığında, iki hafta boyunca, Ice-Cap çeşme ve doku hasat için hazır olduklarını vardı. Bu aynı fide kök doku Şekil 4B gösterilmiştir. Arabidopsis kök dokusunun bir örnek çıkarılan DNA toplam tutarı 100 ng 700 ng 2 aralığında genellikle. Bu verim hesaplama sadece bir kısmını ham kök ekstresinin kullanımına dayanmaktadır. Bu ca sadece. Ham kök ekstresi% 10 genellikle DNA ekstraksiyon işlemi için kullanılan, ham özü koruyarak, sonraki analiz için önemli ölçüde daha genomik DNA elde etmek mümkündür. Kullanılarak elde edilen genomik DNA toplam tutarı Ice-Kap prosedür PCR reaksiyonları 2 yüzlerce gerçekleştirmek için yeterli. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Ice-Cap sürecinin akış şeması. A) fide çimlenmeye agar büyüme ortamı içeren Fide Plate. Kökler agar nüfuz ve plakasının altına doğru büyüyebilir. Plaka kuyu diplerinde delikler yapışkan film ile mühürlenir. B) Fide Plaka Kök Plaka su içeren ve metal bir topu üst üste. Kökler Fide Plaka kuyu diplerinde delikleri çıkmak ve Kök Plaka kuyu içine büyümek. Yığılmış Ice kap tabak kuru buz / etanol banyo termoblok yerleştirilir önce C) Ahşap şiş gün Fide Plaka ve Kök Plate arasında eklenir. Kök Plate su donup sonra D), 96 doku örnekleri ile Kök Plaka Fide Plaka verimli, Kök Plaka soyulmuş.96 canlı fide ve Fide Plaka. Ahşap şişleri bu adımı sırasında iki tabak ayrılmasını kolaylaştırmak. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Fide Plaka ve Kök Plaka Fotoğrafları. A) Fide Plaka ve ayrı ayrı görülen Kök Plate. B) Fide Plaka Kök Plaka üstüne yığılmış. DNA ekstraksiyonu için kullanılan çelik bilya Kök Plaka kuyuları görülebilir. Elastik bantlar iki plaka birlikte güvence altına almak için kullanılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: Ice-Cap Çeşmesi Ice-Cap Çeşmesi Kök Tabaklar kuyuların üstleri kesin yükseklikte sabit bir su seviyesini korumak için kullanılır. Bu sürekli sulama sistemi kök plakaların kuyulardan su buharlaşma ve terleme nedeniyle tükenmiş haline gelmemesi sağlar. A) bir ev yapılmış raf.yığılmış Ice-Cap Tabaklar oturduğu çerez levha destekler. B) çeşme yüzeyi boyunca düzgün bir su derinliği elde edilir, böylece tam çerez levha düzeyini ayarlamak için bir araç sağlar 1 "fındık birinin yakın çekim görüntüsü. C) Bu resim tüm görüntüler parçalar Ice-Cap Çeşmesi D) monte Ice-Cap Çeşmesi ev yapımı raf oluşturmak için gerekli bir dalgıç fıskiye pompası sürekli ev yapımı dayanmaktadır çerez levha, alt rezervuar su hareket raf. yaylı kelepçe hortum çerez levha kenarına takmak için kullanılır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3280/3280fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4: Ice-Cap süreci Arabidopsis fide kullanılarak yetiştirilir. A) Üstten görünüm bir Fide Plaka iki kuyu içine aşağı bakıyor. Her iyi bir Arabidopsis fide içerir. B) Kök Plate iki kuyu Yandan görünüm. Kökler büküm görülebileceğikuyuların iç yüzeyi etrafında. Bu resimde fide ca Ice-Cap Çeşmesi olmuştu. iki hafta ve doku hasat normal olurdu büyüme aşamasında.

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
<li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li>
<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single-nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li>
<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan Ice-Cap yöntemi, tek bir gün içinde bireysel bitkilerin bile yüzlerce ya da binlerce, doku örnekleri toplamak ve verimli bir şekilde kullanmak genotipleme reaksiyonlar için bu örnekleri genomik DNA ayıklamak için, bir bilim adamının sağlar. Bireysel bir bilim adamı, kısa bir süre içinde binlerce fide genotipi yeteneği vererek, Ice-Cap yöntemi, aksi takdirde gerçekleştirmek için pratik olmazdı bir dizi genetik deneyler kolaylaştırmak için bir potansiyele sahiptir. Bazı örnekler aşağıda verilmiştir. <ol><li> Genetik Haritalama. Güzel ölçekli genetik haritalama araştırmacı 3 kromozom boyunca belirli bir aralık içinde rekombinasyon olayları tanımlamak için ise hızlandırılmış olabilir. Bu aralığı çok kısa bir genetik mesafe gerektiriyorsa, o zaman rekombinasyon olayları ayırma haritalama nüfus nispeten nadir olacaktır. Bu nedenle, istenilen yeniden bulmak için bireysel bitkiler ekran binlerce için gerekli olabilircombinant bireyler. Bu süreç büyük ölçüde Ice-Cap kullanımı ile hızlandırılmış olabilir. Genom yeniden sıralama çağında bile, doğrudan belirli bir mutasyon bir ilgi fenotipi doğrudan sorumlu olduğunu göstermek için hala gereklidir. Bu durumlarda, aday mutasyon aslında etken olduğunu kanıtlamak amacıyla yakından bağlantılı diğer mutasyonlar uzak ilgi mutasyon ayırmak için gerekli olacaktır. Bu gibi durumlarda, Ice-Cap sıkıca bağlı mutasyonlar arasında bir çift bağ kırılması için etkili bir yöntem sağlayacaktır. </li><li> Multi-mutantlar. Arabidopsis okuyan araştırmacılar için fonksiyonel fazlalık 4-6 aşmak için tek bir bireyin içine birkaç farklı lokusların mutant allel birleştirmek için yaygın hale gelmiştir. Bir örnek olarak, bir genetik geçişi ile tek bir bitki dört farklı lokusların mutant allel birleştirmek isteyen bir durumda düşünün. Bu proje için, üretmek için gerekli olacaktırgeçiş şemasının bir parçası olarak bu dört lokusların heterozigot birey. Bu dörtlü heterozigot setleri tohum, dörtlü homozigot döl ortaya çıkan nüfus 256 kişiden birinin bir oranda mevcut olması bekleniyor. Geleneksel yöntemler ile bu nadir bir birey için Eleme oldukça emek yoğun olurdu. Karşılaştırıldığında, Ice-Cap bu proje için kullanarak, tek bir nesil nadir dörtlü homozigot belirlenmesi için etkin bir strateji ile bilim adamı sağlayacaktır. </li><li> iTILLING. Laboratuvarımız son zamanlarda yeni bir yaklaşım, genlerdeki Arabidopsis 7 faiz kaynaklı mutasyonların varlığı için tarama nitelendirdi. Bu yöntem, kimyasal bir mutajen 8-10 ile tedavi edilen bireylerin sipariş popülasyonlarda mutasyonlar bulmak için kullanılan bu toprağın işlenmesinde adında kurulmuş bir teknik bir çeşididir. Bir ind, toprağın işlenmesinde kişiselleştirilmiş bir versiyonu çünkü iTILLING yöntem adında varividual bilim adamı geleneksel olarak büyük bir araştırma ekibi tamamlamak için gerekli bir şey başarmak için. Ice-Cap, 7 iTILLING yöntemi aşağıda açıklandığı gibi ayrılmaz bir parçasıdır. </li></ol> ITILLING arkasındaki fikir, geleneksel toprağın işlenmesinde projeler için oluşturulan dayanıklı mutant nüfusunun aksine duruyor geçici bir mutant nüfusu üretmektir. ITILLING için, 50 ila 100 Buz kap bloklar halinde bir Hacimli M2 nüfus tohumları ekilen ve DNA Ice-Cap yöntemi ile elde edilir. Arabidopsis fideler daha sonra yerleştirilen 4 ° C Ice-Cap DNA mutasyon tarama kullanılarak yapılır preparatlarıyla. Domates fideleri 12 ° C&#39;de saklanır. Fide taşıyan istenilen mutasyonlar tespit edildikten sonra, Ice-Cap plakalardan kurtarıldı ve toprağa aktarılır. iTILLING ekrana, tüm bir araştırma toplum için uzun süreli bir mutant nüfus sağlamak için uygun değildir. ITILLING Bunun yerine, bir strateji sağlarBir bilim adamı, verimli ve nispeten düşük bir maliyetle, hızlı bir avuç gen mutasyonları için özel bir mutant nüfusunun ekranı yapabilirsiniz. Ice-Cap Arabidopsis, domates, pirinç büyüyen ve genotipleme için etkili bir yöntem olarak buldular. Biz diğer bitki türleri de Ice-Cap uygun olması gerektiğini bekliyoruz. Bir sınırlama Ice-Cap kalınabilmektedir çeşitli türlerin tohumlarının boyutu. 96 plaka kuyuların içine sığacak kadar küçük tohumlar Sadece bitkiler bugünkü yapılandırma Ice-Cap ile uyumlu olacak.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Öğütücü </td><td> DNA ekstraksiyonu için Kök Tabaklar sallayarak Makine </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene ABD </td><td> AB-0384 </td><td> Manuel ısı yapıştırma makinesi doku bozulmasına önce Kök Tabaklar </td></tr><tr><td> Sallanan mikroplak taşıyıcıları ile donatılmış Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Sallanan mikroplak taşıyıcıları ile herhangi bir santrifüj uygun olacaktır </td></tr><tr><td> MicroFill Mikroplaka Dispenseri </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Otomatik dolum mikropleytin sıvı dağıtıcı </td></tr><tr><td> BIALETTI marka17x11 inç Ticari Büyük Cookie Sheet </td><td> Hedef Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> Bu özel çerez levha, Ice-Cap için ideal bir derinliğe sahiptir. </td></tr><tr><td> Özel Metal Raf </td><td> Donanım Mağaza </td><td></td><td> Tam bir açıklama için metne bakınız </td></tr><tr><td> 33 Litre plastik saklama kutusu </td><td> Hedef Department Store </td><td> Sterilite Marka </td><td> Ice-Cap Fountain. Plastik saklama kutusu 17x11 inç çerez levha içine alabilecek kadar büyük </td></tr><tr><td> Saat Çeşmesi Pompa başına 30 galon </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Küçük bahçe gereçleri satan mağazalarda bulunan dalgıç fıskiye pompası </td></tr><tr><td> Fıskiye pompası için hortum </td><td> Herhangi bir laboratuvar tedarik şirketi </td><td></td><td> Fıskiye pompası ile uyumlu Hortum </td></tr><tr><td> Plastik Kelepçe </td><td> Donanım Mağaza </td><td></td><td> Çerez için hortum tutun Kelepçelevha </td></tr><tr><td> Falcon Microtest düz dipli 96-iyi polistren levhalar şeffaf plastik kapakları </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Ice-Cap Fide Tabaklar kapsayan için şeffaf plastik kapakları </td></tr><tr><td> 3M cerrahi bant Micropore </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch çapında paslanmaz çelik bilyalar </td><td> Hartford Teknolojileri, Rocky Hill, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> Hasat sonrası kök doku bozmak için kullanılır. </td></tr><tr><td> 3 inç elastik saç bantları </td><td> Yerel bakkal </td><td></td><td> Fide Kök Plaka Plaka güvenliğini sağlamak için kullanılan </td></tr><tr><td> 4 mm çaplı tahta şiş </td><td> Yerel bakkal </td><td></td><td> Bu şiş kebapları hazırlamak için genellikle kullanılır </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marka, frit olmadan 1 ml filtre plakaları </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> Alt delik 96-iyi Fide Tabaklar. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Tall-Baca PCR Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> 96-iyi Kök Tabaklar </td></tr><tr><td> Ağar - hücre kültürü test </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic asit (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige ve Skoog (MS), bazal tuz karışımı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Kolay Peel ısı folyo sızdırmazlık </td><td> ABgene ABD </td><td> AB-0745 </td><td> Kök Plakalar doku bozulması için önce sızdırmazlık için ısı sızdırmazlık filmi </td></tr><tr><td> Duck Marka Ekstra Geniş Ambalaj Teyp, 3.00 &quot;x 54,6 yd </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Hiçbir madde. 21242139 </td><td> Yapışkan bantdepolama için DNA ekstreleri içeren sızdırmazlık mikropleytin </td></tr><tr><td> Sızdırmazlık Rulo </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> El mikropleytin üzerine yapışkan sızdırmazlık bantı basarak yuvarlanan aracı düzenlenen </td></tr><tr><td> 96-metal termal blok </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Kök Plakalar doku hasat için dondurmak için kullanılır. </td></tr><tr><td> Whatman Filtre kağıdı </td><td> Whatman Uluslararası </td><td> 1002 090 </td><td> Yüzey sterilizasyon tohumları kullanılır </td></tr><tr><td> Tek kullanımlık Pasteur Pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;tek Pasteur pipeti Fide Plaka tohum transferi için kullanılan </td></tr><tr><td> Pyrex pişirme çanak (20 cm x 30 cm) </td><td> Hedef Department Store </td><td></td><td> Kuru buz / etanol banyosu oluşturmak için kullanılır. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: büyüyen bir yöntem arabidopsis</emyüksek verim genotiplendirme için 96-iyi tabaklar ve domates tesisleri>

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Bu bitkilerin çok sayıda genotipleme gerektiren projeler geliştirmek için bitki bilim adamları için yaygın hale gelmektedir. Herhangi bir genotipleme projesinde ilk adım, her bir bitkinin bir doku örneği toplamak için. Bu görevi geleneksel yaklaşım örnek bitkiler için bir-at-a-zaman. Ancak, bir dilek bireylerin genotip yüzlerce ya da binlerce genotipleme boru hattının önemli bir darboğaz bu strateji sonuç kullanıyorsanız. Biz burada açıklamak Ice-Cap yöntemi, bir bilim adamı, tek bir günde 1,2 birkaç bin fide doku toplamak için izin vererek bu zorluğu yüksek verimli bir çözüm sağlar. Bu verim düzeyi, doku, bitki yerine bir-at-a-çok 96-at-a-zaman hasat olduğu gerçeği ile mümkün hale gelmiştir. Ice-Cap yöntem fide büyüme, doku hasat ve DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için entegre bir platform sağlar. Ice-Cap temelinde seedli büyüme96-kuyucuğu yığılmış çifti NGS. Üst plaka kuyu bireysel fide çimlenmeye agar büyüme medya fişleri içerir. Agar medya aracılığıyla üst plaka, bir delikten çıkmak ve daha düşük bir plaka içeren su geçer kökleri aşağı doğru büyür. Üst plaka fide oda sıcaklığında devam ederken, DNA ekstraksiyon, kök doku içeren alt tablası su doku hasat için hızla dondurulur. Üst plaka, 96 kök doku örneklerinde buz ve 96 canlı fideler ile bir tabak içinde donmuş bir tabak verimli alt tabak soyulmuş. Bu teknik, kök doku yakalamak için buz kullandığı için &quot;Ice-Cap&quot; olarak adlandırılmıştır. Fide içeren 96 plaka daha sonra folyo ile sarılmış ve düşük sıcaklık transfer. Bu işlem fideler daha fazla büyüme askıya ama onların canlılığı etkilemez. Genotip analizi tamamlandıktan sonra, istenilen genotipi ile fideler 96-iyi p transfer edilebilirdaha fazla yayılması için toprağa geç. Biz, Arabidopsis thaliana, domates, pirinç ve fide kullanarak Ice-Cap yöntemi yararını göstermiştir . Biz yöntem 96-kuyucuğu kuyu içine sığacak kadar küçük tohumlar bitkilerin diğer türler için de geçerli olması gerektiğini bekliyoruz.

Ice-Cap yöntemi bir 96-kuyucuğu ve her fide olmayan yıkıcı hasat kök doku bitkilerin büyümesine izin verir. Bu kök dokusu elde edilen DNA genotipleme reaksiyonlar için kullanılabilir. Ice-Cap iyi çalıştığını bulduk<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Domates, pirinç fideleri.

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis</emYüksek Verim Genotiplendirme için 96-iyi Tabaklar ve Domates Tesisleri>

Bitki bilimcilerin, çok sayıda bitkinin genotiplemesini gerektiren projeler geliştirmesi yaygın hale gelmektedir. Herhangi bir genotipleme işleminin ilk adımı...

Bu deneyin genel amacı, DNA ekstraksiyonu ve genotipleme için 96 kuyucuklu plakalarda yetiştirilen bitki fidelerinden kök doku örnekleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle fidelerin, agar büyüme ortamı içeren ve her kuyucuğun altında delikler bulunan özel 96 kuyucuklu plakalarda çimlendirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, fide plakasının suyla doldurulmuş standart bir 96 kuyucuklu plakanın üzerine üst üste yerleştirilmesidir.Kökler alttaki 96 kuyucuklu plakaya doğru büyüdüğünde, üst üste dizilmiş plakalar, alttaki plaktaki suyu dondurmak için bir dondurma bloğuna yerleştirilir. Son adım, üst plakayı alt plakadan soyarak, alt plakada donmuş halde bulunan kökleri koparmaktır. Nihayetinde, elde edilen kök dokusu örnekleri, genotip analizi için her bir bireysel bitkiden DNA örnekleri çıkarmak amacıyla kullanılabilir.Ice cap yönteminin alternatif yöntemlere kıyasla temel avantajı, tek bir günde binlerce bitkiden DNA izole etmenize olanak sağlamasıdır. Bu verimlilik düzeyi, ice cap ile bitkilerin geleneksel yöntemdeki gibi tek tek değil, aynı anda 96 adet şeklinde işlenmesi sayesinde mümkündür. Icecap kullanımına dair bazı örnekler arasında, çok sayıda farklı haritalanmış mutasyon taşıyan, birbirine yakın bağlantılı IDE üreten bitkiler arasında nadir rekombinantları tanımlamak için büyük bitki popülasyonlarının taranması ve ürün türlerinde marker destekli seçilim yapılması yer almaktadır.Temel olarak, genotipleme maliyeti olan ve çok sayıda bireysel bitkinin kullanıldığı her deneyden icecap kabı potansiyel olarak fayda sağlayabilir. icecap'i başlangıçta tavşan apsesi kullanımı için geliştirdik, ancak pirinç ve domates fidelerinden doku toplamak için kullanımında da başarı elde ettik. Tohumları 96'lı duvar plakasına sığacak kadar küçük olduğu sürece, icecap'in diğer türlerde de etkili olacağını öngörüyoruz.Öncelikle fide plakalarını folyoya sarın ve aynı anda otoklavlayın. Otoklav döngüsü tamamlandıktan sonra fide plakalarının şeffaf plastik kapaklarını %95 ethanol içinde bekletin; fide plakalarının ve kapakların laminer akışlı kabinde tamamen kurumasına izin verin. Plakalar tamamen kuruduğunda, her bir fide plağının altına paketleme bandı uygulayın ve bir rulo yardımıyla sıkıca mühürleyin.Ardından, her fide plakasının kuyucuklarına 450 µL eritilmiş büyüme ortamı dağıtmak için bir microfill mikroplaka dağıtıcı veya çok kanallı pipet kullanın. Plakaları plastik kapaklarla kapatın ve büyüme ortamının oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Kuru tohumları watman filtre kağıdı üzerine serpiştirin ve her bir tohumu %95 etanol ile tamamen kaplayın.Ardından tohumların tamamen havada kurumasına izin verin. Sonra, modifiye edilmiş bir cam pipetin alevle mühürlenmiş ucunu önce agar besiyeri yüzeyine değdirerek tohumları fide plakalarına aktarın. Bu işlem pipetin ucunu nemlendirir ve tek bir tohumun kolayca alınarak agar yüzeyine aktarılmasını sağlar.Her kuyucukta bir tohum olduğunda, her fide plağını şeffaf plastik bir kapakla örtün ve mikropor cerrahi bantla mühürleyin. Üst üste dizilmiş plakaları alüminyum folyo ile sarın ve tohumları stratifiye etmek ve çimlenmeyi senkronize etmek için dört gün boyunca dört santigrat derecede saklayın. Dört gün sonra, fide plakalarını daha dört gün boyunca 18 ila 20 santigrat derecede floresan ışık altına yerleştirin.Çimlenmeyi başlatmak için, buz şapkası fıskiyesinin yüzeyi doğrudan floresan aydınlatma alacak şekilde, bitki yetiştirme odasındaki bir rafa buz şapkası fıskiyesini kurun. Kurulum için; öncelikle özel raf yapısını plastik bir saklama kutusunun içine yerleştirin ve ardından bunun üzerine bir fırın tepsisi koyun.Kurabiye tepsisinin seviyesini ayarlamak için dengeleme somunlarını kullanın. Ardından, saklama kutusuna bir daldırma pompa yerleştirin ve pompadan çıkan çıkış hortumunu yaylı bir klempe yardımıyla kurabiye tepsisinin kenarına sabitleyin. Sonrasında, buz kapağı fıskiyesini üç ölçek distile su ve bir ölçek musluk suyundan oluşan bir karışımla doldurun.Dalgıç pompa su seviyesinin birkaç santimetre altında kalana kadar su eklenmelidir. Plastik saklama kutusundaki nihai su seviyesi, laboratuvar bandı ve bir markör kalem kullanılarak işaretleyin. 96 kuyucuklu bir kök plağının her kuyucuğuna bir adet paslanmaz çelik bilye ekleyerek kök plakalarını hazırlayın.Ardından, kök plakasının her bir kuyucuğuna üç birim distile su ve bir birim musluk suyundan oluşan karışımdan 340 µL dağıtın. Fide plakalarının altındaki yapışkan filmi soyun ve şeffaf plastik kapakları çıkarın.Her bir fide plağını, metal bilye ve su içeren bir kök plağına yerleştirin ve eşleşmiş plakaları iki adet elastik bant kullanarak birbirine sabitleyin. Ardından, üst üste dizilmiş plakaları buz şapkası fıskiyesine yerleştirin. Eşleşmiş plaklar, buz şapkası fıskiyesinde 10 ila 14 gün boyunca bırakılmalıdır.Bu süre boyunca, saf su ekleyerek buz şapkası fıskiyesindeki su seviyesini koruyun. Fidelerin çoğunun kök dokusu kök plakalarına nüfuz ettiğinde, kök dokusu hasadına hazırlık amacıyla plakaları buz şapkası fıskiyesinden çıkarın. Plakalar buz şapkası fıskiyesinden çıkarıldıktan sonra, üst üste istiflenmiş fide ve kök plakalarının kuyucukları arasına üç adet ahşap şiş yerleştirin.Şişler, fide plakalarının uçlarını kök plakalarının kuyucuklarından yukarı kaldıracaktır. İçine tahta şişler yerleştirilmiş şekilde üst üste dizilmiş buz başlığı plakalarını, ışıklar altında gece boyunca bekletin. Bu inkübasyon, kök plakalarındaki sıvının hafifçe buharlaşmasını sağlayarak sonraki dondurma ve plaka ayırma işlemlerini kolaylaştırır.Doku hasadı gününde, bir dondurma banyosu hazırlayın. 96 kuyucuklu metal termal bloğu, kuru buz ve %95 etanol karışımı içeren bir Pyrex kaba yerleştirin. Termal bloğun sıcaklığa uyum sağlaması için yaklaşık 20 dakika bekleyin.Üst üste dizilmiş buz şapkası plakalarını ahşap şişlerle birlikte soğutulmuş termal bloğun üzerine yerleştirin ve beş dakika boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, kök plakasındaki su tamamen donacaktır. Üst üste dizilmiş buz şapkası plakalarını dondurucu banyodan çıkarıp oda sıcaklığındaki laboratuvar tezgahına yerleştirin, ardından plakalar üzerindeki lastik bantları ve ahşap şişleri çıkarın.Plakaları çatlatmak için fide tablasının üzerine kuvvetlice bastırın. Ardından, kök tablasını ve fide tablalarını dikkatlice birbirinden ayırın. Kök tablalarındaki suyun oda sıcaklığında çözülmesini bekleyin.Alternatif olarak, kök plakalarının bir termal blokta inkübe edilmesiyle çözdürme işlemi hızlandırılabilir. Kök plakaları çözülürken sıcaklığı 25 °C'ye ayarlayın. Fide plakaları saklama için hazırlanabilir.Bunu yapmak için, fide plakasının alt kısmını yapışkan bantla kapatın. Ardından, fide plakasının üzerine şeffaf plastik bir kapak yerleştirin ve mikrogözenekli bantla sabitleyin.Fide plakalarını üst üste dizin, alüminyum folyo ile sarın ve arabidopsis fidelerini dört derece santigrat sıcaklıkta muhafaza edin. Fideler, canlılığı etkilenmeden birkaç hafta boyunca bu sıcaklıklarda saklanabilir. Kök plakalarındaki suyun tamamen çözündüğünden emin olun.DNA ekstraksiyon prosedürünü gerçekleştirmeden önce, plakaları inceleyerek herhangi bir kuyucuğun ortalamadan önemli ölçüde daha az suya sahip olup olmadığını belirleyin; ek su gerektiren kuyucuklara distile su pipetleyin. Ardından, kök plakasının her bir kuyucuğuna 25 µL 500 mM TRIS 50 mM EDTA çözeltisi pipetleyin. Sonrasında, kök plakası kuyucuklarını termal mühürleme folyosu ve bir ısı mühürleme makinesi kullanarak mühürleyin.Kapatılmış kök plakalarını, plakaların kapalı uçları aşağı bakacak şekilde geno grinder cihazına yerleştirin. Plakaları geno grinder'da dakikada 1.350 vuruş hızında üç buçuk dakika boyunca sallayın. Plakaları mikroplaka taşıyıcıları olan bir santrifüje aktarın ve toz haline getirilmiş kök dokusunu peletlemek için plakaları dört °C'de 3.500 RPM hızında 10 dakika boyunca döndürün.Çok kanallı bir pipet kullanarak, kök plakasının her kuyucuğundan 20 µL süpernatan alın ve her kuyucuğunda 80 µL milli Q su bulunan yeni bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Bu seyreltilmiş ekstrakt, standart protokollere göre genotipleme PCR reaksiyonunda doğrudan kullanılabilecek genomik DNA içerir. Her fidenin genotipi belirlendikten sonra, fide plakalarını soğuk depodan çıkarın ve suyla doyurulmuş toprak karışımı içeren saksıları hazırlayın; basınçlı hava ve kauçuk bir hortum kullanarak, agar tıpanın ve fidenin plakadan laboratuvar tezgahına fırlamasını sağlamak için fide plakasının kuyucuğundaki küçük deliğe hafif hava basıncı uygulayın.Toprakta agar tıkaç boyutunda küçük bir delik açın. Ardından agar tıkacı toprağa yerleştirin ve fideyi toprakta sabitlemek için agar tıkacın etrafını nemli toprakla doldurarak sıkıştırın. Transplantasyon yapılan fideleri 18 ile 22 °C sıcaklıkta ışık altına yerleştirin.Dikimden sonraki ilk iki gün boyunca her saksının üzerini plastik bir kapakla örtün. Ardından kapağı kaldırın ve bitkiyi standart büyüme koşullarında yetiştirin. Bu görüntü, buz şapkalı fıskiyede iki hafta boyunca büyütülen ve doku hasadına hazır olan Arabidopsis fidelerini göstermektedir.İki kuyucuğun her biri bir arabidopsis fidilesi içermektedir. Kök plakasındaki aynı iki kuyucuğun bu yan görünümü, köklerin kuyucukların iç yüzeyine sarıldığını göstermektedir. Bu teknik, sekiz saatlik bir günde 40 adede kadar icecap plakayı işlemek için kullanılabilir.Bu yöntem, bir bilim insanının tek bir günde 3.800'den fazla bireysel fidandan DNA preparatları üretmesini sağlar. Bu prosedürü uygularken, fideler çimlendiği anda ekim plakalarını buzlu kap fıskiyesine aktarmayı hatırlamak önemlidir. Doğru veri aktarımını kaçırmamak için plakaları günlük olarak kontrol edin. Deneylerinizde başarılar dileriz.

ice-cap-method-for-growing-arabidopsis-tomato-plants-96-well-plates

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Bu makalede, tropik yanıtı sırasında plasmodesmal geçirgenliği ve oksin gradyanı kontrol eden genlerin taranması için yöntemler açıklanmaktadır. Bu hipokotil içinde tropik yanıtın derecesi ölçümü içerir   Arabidopsis thaliana ve 8-hydroxypyrene-1,3,6-trifülfonik asit (HPTS) yükleme ve nihayet kaloz seviye değerlendirme ile plasmodesmal geçirgenliği kontrol edilmesi.

Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Bu çalışmanın amacı çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon steril ortam üzerinde yetiştirilen bir aralığı Arabidopsis genotip tohum çimlenmesi üzerindeki etkilerini belirlemek için yapıldı. En iyi duruma getirilmiş sterilizasyon protokolleri tatmin edici tohum hayatta kalma sağlarken mikrobiyal kirleticiler gelişimini engellemek için geliştirilmiştir.

Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Sentetik küçük moleküllerin yüksek üretilen iş ekran modeli bitki türleri, Arabidopsis thalianayapılmıştır. Sıvı işleme robot için geliştirilen bu iletişim kuralı, ileri kimyasal genetik ekranlar, Bitki fizyolojisi etkileyen roman küçük moleküller keşfi hızlanan hızını artırır.

Sıvı işleme bir yüksek üretilen iş ileri kimyasal genetik ekran Arabidopsis thaliana yapmak için Robot kullanımı en iyi duruma getirme

Genellikle kültürlü hücreler üzerinde bileşiklerin bir dizi potansiyel sitotoksisite değerlendirmek için gereklidir. Burada, 96-iyi formatında toksik bileşikler için güvenilir bir tarama stratejisi açıklar.

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

Nazik bir dokunma kuvveti yükleme makinesi insan saç fırçaları, robotik kollar ve bir kumandanın inşa edilmiştir. Saç fırçaları makineye monte edilen robotik kollar tarafından tahrik edilir ve bitkiler üzerinde dokunmatik kuvvet uygulamak için periyodik olarak hareket ederler. Makine odaklı saç dokunuşlarının gücü, manuel olarak uygulanan dokunuşlarla karşılaştırılabilir.

Bir model tesisi Arabidopsis thaliana Thigmomorphogenesis çalışması Için bir işgücü tasarrufu ve tekrarlanabilen dokunma-Force sinyalizasyon mutant ekran Protokolü

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Fide sel testi Pseudomonas syringae bakteridirenç için yabani domates katılımları hızlı tarama kolaylaştırır. Bu tetki, fide bakteri büyüme testi ile birlikte kullanılan, daha fazla bakteriye altta yatan direnç karakterize yardımcı olabilir, ve direnç genetik temelini belirlemek için popülasyonları tarama için kullanılabilir.

Pseudomonas syringae pv Direnci yüksek-Throughput Tanımlama. Fide Sel Asası Kullanarak Domates

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Öğrenin, Ice-Cap yöntemiyle Arabidopsis thaliana ve domates fide kök dokularını 96-kuyucuklu plakalarda hasat ederek yüksek verimli genotipleme yapmayı. Bu teknik binlerce bitkiyi tek günde işlemenizi sağlar.

Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis

Daha fazla video keşfet