Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Bu prosedürün genel amacı, kalitelerini korurken üretim sürelerini ve maliyetlerini azaltarak yüksek titreli rekombinant parvovirüsler veya rec PVS üretmektir. Bu, öncelikle HEC 2 93 T hücrelerinin rec PV plazmitleri ve beraberinde adenovirüs tip beş türevli bir vektör ile transfekte edilmesi yoluyla başlangıç bir rec PV viral stok üretilerek gerçekleştirilir. Çünkü ad genomik elementlerinin HEC 2 9 3 T hücrelerine aktarılması, rec PVS üretimini on kattan fazla artırmaktadır.

Mevcut protokollerle karşılaştırıldığında, rekombinant parvovirüs üretimini artırmak için gerekli olan genomik adenoviral elementlerin yanı sıra parvovirüs VP gen ünitesini içeren yeni bir AD VP helper oluşturulmuştur. Bir sonraki adım, bu yeni ADD VP helper'ı standart protokollere göre üretmek ve saflaştırmaktır.

Bu prosedürün son adımı, NB three 20 4K hücrelerinin rec PV ve AD ADP virüsleri ile birlikte enfekte edilerek rec PVS'nin amplifiye edilmesidir. Bu strateji ile rec PV üretim verimliliği 100 kattan fazla artırılmaktadır; bu yöntem, transfeksiyon yoluyla küçük bir miktar rec PVS üretildikten sonra münhasıran kullanılabilir. Son olarak, üretilen viral stokların titrasyonu için kantitatif gerçek zamanlı PCR veya bir transduksiyon analizi kullanılır.

Ek olarak, üretim süreci sırasında istenmeyen replikasyon yetenekli virüslerin oluşmadığını doğrulamak için bir plak deneyi gerçekleştirilir. Bu tekniğin, plazmid aracılığıyla klasik rekombinant parvovirüs üretimi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, adenovirüs VP yardımcı virüsünde başlangıç rekombinant parvovirüs stoklarını ürettikten sonra, üretimimizin tamamen virüs enfeksiyonuna dayalı olacak olmasıdır. Bu durum, parvovirüs üretimi için uygun olan ancak transfekte edilemeyen NBK hücrelerinin kullanımına olanak tanır.

Bu sayede, rekombinant virüslerin çoğaltılması ve virüslerin yayılma gücünün 100 kattan fazla artırılması mümkün hale gelerek üretim süresi ve maliyeti düşürülmektedir. Prosedürü, Virüs Üretim Birimi başkanı ve bu yeni protokolü bizimle birlikte geliştiren Barbara Loic uygulamalı olarak gösterecektir. Bu videoyu beğenmenizi umuyor ve deneylerinizde başarılar diliyoruz.

Transfeksiyon yoluyla rekombinant parvovirüs veya rek PV üretimi, enfeksiyon yoluyla yapılacak sonraki rek PVS üretiminde inokulum olarak kullanılacak minimum miktardaki rek PVS'yi elde etmek için gereklidir. Transfeksiyondan bir gün önce, rek PVS üretimi için biyogüvenlik seviyesi iki laboratuvar gereklidir. %50 hücresel konfluans elde etmek için 10 santimetrelik bir plakaya 2 milyon HEC 2 9 3 T hücresi ekilmelidir.

Transfeksiyon gününde hücreleri; %10 FBS, L-glutamin, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş 10 mililitre DMEM içinde, 37 °C sıcaklıkta, %5 karbondioksit ve %92 nem altında gece boyunca inkübe ederek büyütün. Transfeksiyon gününde, 1,5 mililitrelik bir tüp içerisinde virüs üretim karışımını hazırlayın. İlgili transgeni taşıyan üç mikrogram rekombinant PV vektörünü bir iki bir molar oranında aşağıdaki reaktiflerle ekleyin.

Parvovirüs kapsid geni birimini taşıyan altı µg vektör P-C-M-V-V-P ve sekiz µg adenovirüs kaynaklı yardımcı plazmid kullanılmıştır. Plazmid karışımını, mikrolitre başına 20 ng nihai konsantrasyon elde edecek şekilde serumsuz ortam ile 850 µL'ye kadar seyreltin. Ardından, 2,5 birim FU gene reaktifi ile 1 birim DNA oranında 42,5 µL FU gene HD transfeksiyon reaktifi ekleyin.

FU gen reaktifinin tüpün kenarına temas etmemesine dikkat edin, beş ila 10 saniye boyunca nazikçe vortexleyin ve ardından transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Transfeksiyon karışımını hücrelere damla damla ekleyin. Karışımın eşit şekilde dağılması için plakayı nazikçe sallayın.

Plakayı 37 °C'de, %5 karbondioksit ve %92 nem ile 72 saat boyunca inkübe edin. Virüsleri toplamak için bu süre zarfında, parvovirus plazmidlerinden progeni parvovirus partikülleri oluşur. İlk olarak, hücreleri ortamları içindeyken kazıyın, ardından süspansiyonu plakadan aspire ederek 15 mL'lik plastik bir tüpe aktarın.

Tüpü 250 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, yaklaşık 0,5 mililitre kalacak şekilde süpernatantın %95'ini uzaklaştırın. Peleti kalan süpernatant içinde yeniden süspande etmek için tüpü hafifçe vorteksleyin ve 1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpüne aktarın.

Süspansiyonu sıvı azot banyosunda dondurun ve ardından 37 °C sıcaklıktaki ılık suda çözdürün. Tüpü 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Dondurma-çözdürme döngüsünü iki kez daha tekrarlayın.

Tüpü 4 °C'de 15 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir tüpe toplayın. Bu aşamadaki süpernatant, enfeksiyon yoluyla rek PVS üretimi için inokülüm olarak kullanılabilecek ham virüs özütünü içerir. Power virus gain.

A replikasyonları, çoğalan hücrelerde eksprese edilen hücresel faktörlere bağlıdır. Bu nedenle, rekombinant güç virüsü üretimi için kullanılan hücrelerin optimal durumda olması ve bu protokolde gösterildiği gibi uygun yoğunlukta ekilmesi önemlidir. Enfeksiyondan bir gün önce, ertesi gün %60 ila %80 hücresel konfluens elde etmek için bir T 1 75 flaskına 10 milyon MB three 20 4K hücresi ekleyin.

Kontrol olarak, aynı sayıda hücre içeren ikinci bir flask hazırlayın. Her T 1 75 flask, enfeksiyon gününün sabahında; %5 FBS, L-glutamin, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş, son hacmi 20 mililitre olan MEM içermelidir. İki mililitrelik plastik bir tüp içerisinde bir virüs karışımı hazırlayın.

Bu reaktifleri ekleyin. VP yardımcısını EKLEYİN. 1,5 mililitre MEM'e 0,5 MOI değerinde ve 10 enfeksiyon çokluğuyla rek PVS ekleyin.

Virüs karışımının tamamını T 1 75 flasklarından birine uygulayın. Flaskı 37 °C, %92 nem ve %5 karbondioksit altında, her 15 dakikada bir hafifçe çalkalayarak iki saat boyunca inkübe edin. 37 °C, %92 nem ve %5 karbondioksit altında 20 ila 24 saat daha inkübe edin.

20 ila 24 saat sonra, kültür ortamını taze ortamla değiştirin ve etkili viral üretimin bir göstergesi olarak erleni aynı koşullar altında 48 saat boyunca inkübe edin. Viral enfekte hücreleri içeren erlenlede belirgin sitotoksisite belirtileri gözlemlenmelidir. Enfeksiyondan sonraki 36 ila 48. saatten başlayarak ve 48 saat dolduğunda, ortam süpernatantını erlenlele aspire edin ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri iki kez 1,5 mililitre PBS ile yıkayın, üç ila beş dakika boyunca tripsinize edin ve ardından hücre süspansiyonunu uzaklaştırılan medyuma ekleyin; hücreleri ve süpernatantı oda sıcaklığında 5.000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı dökün ve hücre peletine bir mililitre TE tamponu ekleyin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için tüpü hafifçe vorteksleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu sıvı azot banyosunda dondurun ve 37 derece santigrat sıcaklıktaki ılık suda çözdürün.

Tüpü 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Dondurma-çözme döngüsünü üç kez tekrarlayın. Ardından, genomik hücre ve paketlenmemiş viral DNA'ları sindirmek için hücre süspansiyonunu 37 °C'de 30 dakika boyunca Ben Nase nükleaz ile muamele edin.

30 dakika sonra, tüpü dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 5.000 G'de santrifüj edin. Son olarak süpernatantı temiz bir tüpe toplayın. Bu aşamadaki süpernatant kaba bir virüs ekstraktı içerir.

Bu protokol takip edilerek üretilen rekombinant PV GFP'nin tipik verimleri, 1 ila 10 × 10⁸ viral enfeksiyöz birim aralığında olmalıdır. Burada, adenovirüs tabanlı bir plazmit ile rekombinant PV üretiminin stimülasyonuna bir örnek gösterilmiştir. GFP geni taşıyan veya taşımayan PHH one GFP erect PV içeren kaba virüs ekstraktları.

Adenovirüs tabanlı PXX plazmidi NBK indikatör hücrelerine uygulandığında, bu mikrograflarda gözlemlendiği üzere, PXX altı varlığında daha fazla GFP pozitif hücre bulunmaktadır. GFP transdüksiyon analizleri gerçekleştirildiğinde, Pxx altı varlığında rek PV üretiminde belirgin bir artış elde edilmiştir. Üretim, geleneksel protokollerle elde edilen hücre başına 0,3 GFP transdüksiyon ünitesi veya TU değerinden, bu protokolle elde edilen yaklaşık hücre başına beş TU değerine yükselmiştir.

GFP transduksiyon deneyi sonuçları, PXX six içerisinde bulunan adenovirüs E 2a, E 4 ve VA RNA genlerinin parvovirüs üretimini artırabildiğini göstermektedir. Bir sonraki şekil, enfeksiyon yoluyla rekombinant PV üretiminin temsili bir örneğini göstermektedir. NB 320 4K hücreleri, saflaştırılmış ADP yardımcı virüsü ile enfekte edilmiş ve ardından iki rekombinant parvovirüsten biriyle süper enfekte edilmiştir.

Virüs titrelerini belirlemek için kaba hücre ekstraktları kullanılmış ve yapılan transdüksiyon deneyi, AD VP yardımcı faktörünün rec PV üretimini hücre başına 70 T'nin üzerine kadar daha da artırdığını göstermiştir. Son olarak, ADP varlığında veya yokluğunda üretilen viral partiler, MB three 20 4K indikatör hücreleri üzerinde plak deneyi yapılarak replikasyon yeteneğine sahip viral partikül içerikleri açısından analiz edilmiştir. Sonuçlar, ADP yardımcı faktörünün, geliştirme sonrası istenmeyen replikasyon yeteneğine sahip viral partiküllerin oluşumunu artırmadan rec PV üretimini artırdığını göstermektedir.

Bu teknik, kanser ve gen terapisi alanındaki bilim insanlarının rekombinant güçlendirilmiş virüs üretimini daha da artırmalarına olanak tanır. Biyoreaktörler kullanılarak, klinik ortamda ihtiyaç duyulan yüksek miktarlarda varyantlar üretilebilir.