Name: Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Öğrenin, adenovirüs yardımcı vektör kullanarak rekombinant parvovirus üretim verimliliğini on kat artırma yöntemini. HEC 293T hücre transfeksiyonu ve enfeksiyon stratejileriyle gen tedavisi uygulamaları için maliyet ve süre tasarrufu sağlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz özellikle Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau ve Mandy Roscher yılında, DKFZ virüs üretim ve geliştirme biriminin ekip teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen Eğitim ve Araştırma (BMBF) ve Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est Uygulamalı Tümör Viroloji ortak Programı çerçevesinde Helmholtz Topluluğu Federal Bakanlığı tarafından desteklenen hibe edilmiştir.

Biyogüvenlik düzeyi 2 olan bir laboratuvar rekombinant parvoviruses (recPV) üretimi için gerekli olduğunu unutmayın. Protokol, iki ana bölümden ayrılır. Birinci kısım (transfeksiyon ile recPV üretimi) protokolü ikinci bölümü (enfeksiyonu yoluyla recPVs üretiminde) inokulum olarak hizmet recPVs minimal miktarda üretmek için gereklidir. Bir kez recPVs küçük bir miktar protokolünün birinci bölümü atlanabilir, üretilen ve rekombinant parvovirüsü, sadece adenovirüs helper yoluyla parvovirüsü kapsid proteinler (bkz. aşağıda) için gen kodlaması sağlayan enfeksiyonu yoluyla amplifiye edilebilir. 1. Transfeksiyon üzerinden recPVs Üretimi 1.1 Viral DNA transfeksiyon Bu ya da katyonik lipidler veya kalsiyum fosfat dayalı protokol, bu bölümde oluşturulan bir DNA transfeksiyon yöntemi kullanmak mümkündür. Biz genellikle Fugene H kullanırD Transfeksiyon Reaktif. Transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için bir plazmid ifade gelişmiş Yeşil floresan proteini (örneğin pEGFP-N1, Clontech) ile ilave plaka transfekte öneririz. Hücre nüfusunun en az% 50 EGFP-pozitif 24 saat sonra, transfeksiyon sonucunda meydana transfeksiyon verimli ve virüsünün üretimi için optimal olarak kabul edilir. <ol><li> Transfeksiyon günde% 50 hücresel konfluent elde etmek için bir 10 cm plakası, içinde transfeksiyonuyla, tohum 2.000.000 HEK293T hücreleri daha önce 1 saat. % 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, 100 ml penisilin başına U ve 100 ug / ml streptomisin ilavesiyle Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 10 ml hücre büyümesi. </li><li> 1.5 ml tüp virüs verme karışımı (01:02:01 molar oranı) hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> RecPV vektörünün 3 ug ilgi transgen (EI hastayı-1-GFP 6) barındıran. </li><li> Vektör pCMV / VP 5 6 mikrogram parvovirus kapsid gen birimi barındıran </li><li> 8 mikrogram of adenovirüs kökenli yardımcı plazmid pXX6 7. </li></ol></li><li> 850 ul (20 ul / ng nihai konsantrasyon) ile serum içermeyen aracı kadar olan plazmid karışımı ile seyreltilir. </li><li> 42.5 ul Fugene HD (: mikrogram DNA 2.5:1 oranı ul Fugene) ekleyin. Orta Fugene eklerken tüp tarafında dokunmayın. </li><li> 5-10 saniye yavaşça vorteksleyin. </li><li> 30 dakika oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> Transfeksiyon karışımı hücrelere damla-akıllıca ekleyin. Eşit boyunca karışımı dağıtmak için hafifçe sallayın plaka. </li></ol> 1.2 Virüs üretim <ol><li> Hasat önce 72 saat boyunca% 92 nem,% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe plakası. Bu süre içinde soyu parvovirüsü parçacıklar parvovirüsü plazmit ile oluşturulmaktadır. </li></ol> 1.3 Virüs hasat <ol><li> Bir doku kültürü davlumbaz, bir 15 içine plakadan süspansiyon, bunların orta içinde hücreleri sıyırmak ve transfer aspireml plastik tüp. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüje tüpü. </li><li> Üstte kalan% 95 çıkarın. </li><li> Vorteks tüpü yavaşça geri kalan süpernatan (0.5 ml) içine pelletini için. </li><li> -80 Azından tüp dondurmak ° C. Bu aşamada, üretim durdurmak ya protokolü ile birlikte devam etmek mümkündür. </li><li> Süspansiyon eritmeyi ve oda sıcaklığında getirmek. </li><li> 37 sıcak su, sıvı azot banyo ve çözülme içinde süspansiyon Freeze ° C Vortex gayretle 15 saniye için ve donma-çözülme çevrimi fazla iki kez tekrarlayın tüpler. </li><li> 4 azından 15 dakika süreyle 16,000 x g'de santrifüje tüpler ° C. </li><li> Taze bir tüp içine süpernatant toplayın. Bu aşamada, tüp ham virüsü ekstresi preparatı içerir. </li><li> Virüs titrasyon (bkz. aşağıda) ile devam edin. GFP genini taşıyan recPV için tipik bir üretim yaklaşık 1 tekabül eden 1-3 x 10 7 viral enfeksiyon birimleri vermelidir -3 x 10 10 viral genom parçacıklar içeren. </li></ol> 1.4 Virüs depolama <ol><li> Uzun süreli saklama için -80 az ham virüs özü içeren tüp dondurmak ° C Bu protokolün bir ikinci bölümünde aşı malzemesi olarak ham viral ekstreler kullanmak mümkündür. </li></ol> 2. Enfeksiyon ile recPVs Üretimi Enfeksiyon yoluyla recPV üretim başlamadan önce, üretmek ve Adenovirüs standart protokol 8'e göre parvovirus VP gen (Ad-VP yardımcısı, 5 açıklanan) taşıyan 5 arındırmak. Aynı zamanda ilgi transgen (örn., yukarıda açıklandığı gibi transfekte yoluyla üretilen) taşıyan recPVs minimal miktarda olması gereklidir. Aşağıda, 175 cm 2 şişe (T175) biçiminde recPV üretimini açıklar. Bu şekilde üretilen virüsü stokunun daha da çok katlı amplifikasyon 10 CellSTACK kültürü odalarına (Corning) içinde gerçekleştirilebilmektedirprotokolünün küçük ayarlamalar teklif ile. 2.1 Enfeksiyon <ol><li> Enfeksiyon günde% 60-80 hücresel konfluense elde etmek için bir T175 şişesi enfeksiyon, plaka 10 milyon NB324K hücreleri 1 gün öncesine. Bir kontrol olarak hücreler aynı sayıda (non-enfekte olmuş hücreler) içeren ikinci bir şişe hazırlayın. Her T175% 5 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, ml başına Penisilin 100U ve 100 ug / ml streptomisin ile desteklenmiş bir son hacim olarak Minimum Essential Medium (MEM) 20 ml sahip olmalıdır. </li><li> Ertesi sabah oluşan bir 2 ml plastik tüp içinde virüsü karışımının hazırlanması: <ol class="lalpha"><li> Enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı, enfeksiyöz birim / hücre) de Ad-VP-helper 5 = 10 (1 x 10 8 enfeksiyöz birim karşılık gelen); </li><li> MOI azından recPVs = 0.5 (5 x 10 6 enfeksiyöz birim karşılık gelir). MEM ile 1.5 ml'ye tamamlayın. </li></ol></li><li> T175 şişeye birinde tamamını virüsü karışımı geçerlidir. </li><li> Inkübe37 de 2 saat için şişeye ° C,% 92 nem,% 5 CO2 yavaşça her 15 dakikada çalkalama. </li><li> 37 daha az 20-24 saat boyunca inkübe ° C,% 92 nem,% 5 CO2. </li><li> Taze ortam ile kültürel ortamı değiştirin. </li></ol> 2.2 Virüs üretim 48 saat süreyle% 92 nem,% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe şişeler. Etkin viral üretim göstergesi olarak, sitotoksisite açık işaretleri 36-48 saat sonrası enfeksiyon başlamadan, viral enfekte hücre içeren şişeyi dikkat edilmelidir. 2.3 Virüs hasat <ol><li> Bir doku kültürü olarak davlumbaz, aspire ve bir 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne şişesi orta süpernatan transfer. </li><li> 1.5 ml PBS ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> % 0.25 Trysin-EDTA 1.5 ml hücreleri Trypsinize. Çıkarıldı ve orta hücre süspansiyonu ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında, 5 dakika boyunca 5000 x g'de hücreleri ve süpernatan santrifüjebelgelendiğinden. </li><li> Süpernatant atın. </li><li> Hücre topağı ve yavaşça vorteks hücreleri yeniden süspanse etmek tüpüne TE tampon 1 ml (1 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 8.7) ilave edilir. </li><li> 37 sıcak su içinde bir sıvı azot içinde çözülme banyo ve hücre süspansiyonu dondurmak ° C. 15 sn için tüp şiddetle Vortex ve donma-çözülme döngüsü üç kez tekrarlayın. </li><li> Hücre genomik ve non-paketlenmiş viral DNA'lar sindirimi için, 37, 30 dakika için 50 U / ml Benzonase Nükleaz ° C ile hücre süspansiyonu Treat. </li><li> 4 de 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüje tüp ° C. </li><li> Taze bir tüp içine süpernatant toplayın. Bu aşamada, süpernatan ham virüsü ekstresi preparatı içerir. RecPV-GFP tipik verimleri Bu protokol 1-10 x 10 8 viral enfeksiyon birimlerinin aralığında olmalıdır takiben üretilir. </li></ol> 2.4 Virüs depolama <ol><li> 4 ° C'de kısa süreli depolama için (en fazla 2 ay), mağaza virüs </li><li> Lon için-80 at g süreli saklama (daha uzun süre 2 ay), mağaza virüs ° C </li></ol> 3. RecPV Arıtma <ol><li> Ham lizatları gelen recPVs saflaştırılması için, Zolotukhin ark göre bir iodixanol süreksiz degrade çalıştırmak için önerilir. 9. Bu etkin virüsü saflaştırılması için ham özütü viral (beş T175 şişeler üretim elde) 5 ml en az kullanılarak önermektedir. </li></ol> 4. Rekombinant Parvovirus Titrasyon <ol><li> El-Andaloussi ark açıklandığı gibi recPV titrasyonu gerçekleştirmek. 5 </li></ol> 5.. Kalite Denetimleri <ol><li> NB324K göstergesi hücrelerinde parvovirüsü plak assay yürüten istenmeyen virüslerin kopyelemeye yetkin (RCV) varlığında kontrol etmek için El-Andaloussi ve ark. 5 anlatılan protokolde kullanabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar RecPVs productio bir örneğin adenovirüs genomik elemanlarının varlığında veya yokluğunda, transfeksiyon yoluyla Şekil 3 'de gösterilmiştir. Hücreler hastayı-1-GFP (a recPV GFP geni barındıran) veya hastayı-1-lusiferaz (a recPV ateşböceği lusiferaz geni barındıran) ile birlikte pCMV / VP (VP parvovirüsü kapsid proteinleri için kodlayan gen taşıyan plazmid) ile transfekte edildi ile (+ pXX6) veya olmayan (-pXX6) pXX6 plazmid (adenovirüs taşıyan E2A, E4 (orf6) ve VA RNA genleri). Ham hücre ekstreleri arasında eşit hacimde El-Andaloussi ark bildirildiği gibi hücreler ve GFP transdüksiyon ya lusiferaz deneyleri yapıldı. 5 NB324K uygulanmıştır. RecPVs üretiminde belirgin bir artış bizim yöntemi (Şekil 3A, B) takiben elde edilen yaklaşık 5 TU / hücre geleneksel protokollere göre üretim 0,3 GFP transductional birimleri (DS) / hücreden artan pXX6 varlığında elde elde edildi. RecPV verimlilik önemli bir artış (24-kat yaklaşık)ayrıca hastayı-1-lusiferaz (Şekil 3C) söz konusu gözlenmiştir. Bu sonuçlar pXX6 içerdiği genetik malzeme parvovirüsü üretimi artırmak için mümkün olduğunu göstermiştir. Enfeksiyonu yoluyla recPVs üretim temsili bir örnek, Şekil 4 'de gösterilmiştir. NB324K hücreleri çeşitli recPVs (şekilde gösterildiği) ve Ad-VP-helper (PV VP kapsid proteinleri kodlayan gen barındıran) ile ko-enfekte edildi. Kadar Ad-VP yardımcısı daha gelişmiş recPV üretime&gt; istenmeyen çoğaltma yetkili viral parçacıkların (Şekil 4B) oluşumunu artırmadan numaralı seribaşı hücre başına 70 TU (Şekil 4A). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.. Vektörler özerk parvoviruses dayanmaktadır. (A) Üst: transgen VP-kodlayan genlerin kısmını değiştirir ve viral promotor P38 kontrolü altındadır. NS1 / 2 için genlerin rebakımlı ve bunların ifade viral promotör P4 tarafından kontrol edilir. Vektör genom kopyelenmesi ve rekombinant genomunun ambalajları için gerekli olan cis-etkili elementleri içeren parvoviral ITRs tarafından taarruz altında kalır. Altta: bir plazmid, (örneğin, CMV.) Ya da heterolog bir veya otolog (örn. P38.) Promoter (Px) altında VP-genini taşıyan yapısal genlerin bozulması telafi etmek için rekombinant parvovirüsü üretimi sırasında trans temin edilir Rekombinant genomunda. ITR, ters terminali tekrarlayın. Şekil 4 uyarlanmıştır. RecPVs üretimi için kullanılan klasik protokolü (B) şematik görünüm. HEK293T hücreleri geçici olarak viral DNA (vektör ve yardımcı plazmid) ve üç gün sonra transfekte edilir, hücreleri toplanır ve virüsleri hasat edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Ile recPVs üretimiAd-VP yardımcı olur. RecPV ve Ad-VP genomların (A) şematik haritalar. RecPV VP bölgenin parçası yerine bir heterolog transgen içerir. Ad-VP parvovirus VP geni barındırır. Bu makalede açıklanan protokol (B) şematik görünümü. NB324K hücreleri recPV ve Ad-VP virüsleri ile birlikte enfekte olmaktadır. Üç gün hücreler hasat edilmiş ve recPV partikülleri hücre lizatı elde edilirler sonra. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Adenovirüs tabanlı plazmidler pXX6 tarafından recPV üretiminin uyarılması. 10 cm tabaklar tohumlanmış HEK293T hücreleri, recPVs üretmek için hastayı-1-GFP (A ve B) veya hastayı-1-lusiferaz (C) ile kombinasyon halinde pCMV / VP ile transfekte edildi. Eş zamanlı olarak, hücreler adenovirüs-türetilmiş plazmidler helper pXX6 ya da olmasın, olarak belirtilen ile birlikte transfekte edildi. Üç gün sonrası transfeksiyon, hücreler üç donma ve çözülme döngüleri ile hasat ve parçalanır edildi. Rezil eşit hacimleriE virüsü özleri göstergesi hücreleri NBK uygulandı ve iletimi deneyleri yapılmıştır. (A) konfluent NB324K monotabaka içinde GFP pozitif hücreler gösteren Temsilcisi mikrografları. (B) GFP transdüksiyon tahlillerin Kantitasyonu numaralı seribaşı hücre başına transdüksiyon birimi (TU) olarak ifade . (C) lusiferaz aktivitesi Kantitasyonu nispi lusiferaz birimi (RLU) olarak ifade edilir. El-Andaloussi ark açıklandığı gibi lusiferaz yapıldı. 5. Sütunlar üç ortalama değerler standart sapma çubuklarla çoğaltır temsil eder. + PXX6 sütun üzerine numarası, (B ve C), karşılık vermeden pXX6 varlığında elde recPV virüs titreleri in kat artış gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Reklam rekombinant-VP yardımcı virüsü ile recPV üretimi uyarılması. (A) NB324K hücreleri, enfeksiyon olduğunudaha sonra İçişleri Bakanlığı 10 az saflaştırılmış Ad-VP yardımcı virüsü (Ad-X birim / hücre, Adeno-X Hızlı titresi Takımı ile titre) ile Ted ve aşağıdaki rekombinant parvovirus Chi-HH-1-EGFP 11 (0.1 biriyle süperenfekte TU / hücre) ya da H-1-GFP (0,5 TU / hücre) 5. Bir gün sonrası enfeksiyon, orta değiştirildi ve iki gün sonra, hücreler toplandı ve üç dondurma-ve-çözülme döngüleri ile parçalanır. Ham hücre ekstreleri El-Andaloussi ark göre transdüksiyon deneyi tarafından virüs titreleri belirlemek için kullanılmıştır. 5. TU, iletim birimi. (B) Ad-VP yokluğu varlığında üretilen Viral toplu NB324K göstergesi hücreleri üzerinde plak testi ile çoğaltma yetkili viral parçacıkların (RCV) kendi içeriği için analiz edildi.

<ol><li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus.+Res%22%5BJournal%5D)">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).</li>
<li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).</li>
<li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1%2C+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li>
<li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCornelis%2C+JJ+%22J.+Virol%22">J. Virol</a>. 6, 193-193 (2004).</li>
<li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li>
<li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224(1998).</li>
<li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509(1998).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973(1999).</li>
<li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129(1997).</li>
<li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851(2003).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Biz recPV üretim adenoviral genomik elementin varlığını tarafından geliştirilmiş olabilir göstermiştir. Biz transfeksiyon ile adenovirüs genomik elemanı sağlayarak ve recPV ile kombinasyon halinde Reklam-VP-yardımcı ile 100 kat daha fazla eş-hücreleri tarafından enfekte 10&#39;dan fazla kat (0,3-5 TU / hücreden) tarafından recPV verimleri artmıştır geleneksel protokollere karşılaştırılması. Protokol daha adenovirüs genomik elemanlarının teslimat ve enfeksiyonu için kullanılmak üzere Reklam-VP helper optimum konsantrasyo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nükleaz </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Hızlı titresi Seti </td><td> Clontech&#39;in </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

adenovirüs kaynaklı sistemleri yardımı ile verimli rekombinant parvovirus Üretim

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Bu tür sıçan H-1PV ve MVM olarak Kemirgen parvoviruses (PV), küçük icosahedral, tek sarmallı DNA virüsleri vardır. Genom, sırasıyla 1, yapısal olmayan (NS1 ve NS2) ve kapsid proteinler (VP1 ve VP2) ile ifade düzenleyen iki arttırıcılar ve P4 P38 içerir. Onlar onkolitik ve oncosuppressive yetenekleri için antikanser ilaçları insanlar 2 için patojen olmayan olurken yüksek ilgi gördü. NS1 viral sitotoksisite 3 ana efektör olup. Daha da doğal antineoplastik aktiviteleri arttırmak amacıyla, bu vektörlerin gelen türevler bir terapötik transgen (örn., bir sitotoksik polipeptid, sitokin, kemokin, tümör baskılayıcı geni gibi) 4 ile kapsid proteinleri için kodlayan gen ile değiştirerek elde edilmiştir. Rekombinant parvoviruses (recPVs) vektör NS1 / 2 kodlama dizileri ve viral DNA amplifikasyonu ve paketleme için gerekli olan PV genom telomer korur. ÜretimirecPVs yalnızca tarafından üretici hücre (genellikle HEK293T), oluşur ko-transfekte VP proteinleri için kodlayan gen (Şekil 1) 4 eksprese eden ikinci bir vektör (pCMV-VP) ile hücre. Bu şekilde üretilen recPV vektörler replikasyon bozuk. RecPVs ürettikleri edilmiştir hangi ebeveyn virüsler açısından gelişmiş oncotoxic aktiviteye sahip olduğu ispat rağmen, bunların üretimi önemli bir sorun oluşturmaktadır ve güçlü anti-kanser klinik uygulamalarda bu ajanların kullanımı engellemektedir. Bu kullanımda, diğer protokollere göre daha az 10 kat recPVs üretimi geliştirilmiş HEK293T içine E2A, E4 (orf6) ve VA RNA geni (örn. pXX6 plazmid) içeren bir Reklam-5 türetilmiş vektörün bir giriş bulundu. Bu bulgu, dayanarak, recPVs üretimi artırmak için gerekli olan genomik adenoviral elemanları gibi parvovir içerdiği Reklam-VP-yardımcı olan yeni bir inşaBizi VP gen ünitesi 5. Ad-VP-helper kullanımı, rec-PV üretimi ((örneğin NB324K) olası transferinde zor olan hücre hatlarının yapımı kullanımı, viral enfeksiyon adımları (as plazmid transfeksiyon aksine) tamamen güvenir bir protokolü kullanarak verir Şek. 2). Bu büyük ölçüde nihai ürün 5 kalitesini etkilemeden, üretim süresini ve maliyeti azaltarak, üretilen rekombinant virüs miktarını arttırır bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, recPV büyük ölçekli üretim (süspansiyon hücreleri ve biyoreaktörler) artık makuldür.

Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100&#39;den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Sıçan H-1PV ve MVM gibi kemirgen parvovirüsleri (PV), küçük ikosahedral, tek zincirli DNA virüsleridir. Genomları P4 ve P38 şeklinde iki promotör içerir...

Bu prosedürün genel amacı, kalitelerini korurken üretim sürelerini ve maliyetlerini azaltarak yüksek titreli rekombinant parvovirüsler veya rec PVS üretmektir. Bu, öncelikle HEC 2 93 T hücrelerinin rec PV plazmitleri ve beraberinde adenovirüs tip beş türevli bir vektör ile transfekte edilmesi yoluyla başlangıç bir rec PV viral stok üretilerek gerçekleştirilir. Çünkü ad genomik elementlerinin HEC 2 9 3 T hücrelerine aktarılması, rec PVS üretimini on kattan fazla artırmaktadır.Mevcut protokollerle karşılaştırıldığında, rekombinant parvovirüs üretimini artırmak için gerekli olan genomik adenoviral elementlerin yanı sıra parvovirüs VP gen ünitesini içeren yeni bir AD VP helper oluşturulmuştur. Bir sonraki adım, bu yeni ADD VP helper'ı standart protokollere göre üretmek ve saflaştırmaktır.Bu prosedürün son adımı, NB three 20 4K hücrelerinin rec PV ve AD ADP virüsleri ile birlikte enfekte edilerek rec PVS'nin amplifiye edilmesidir. Bu strateji ile rec PV üretim verimliliği 100 kattan fazla artırılmaktadır; bu yöntem, transfeksiyon yoluyla küçük bir miktar rec PVS üretildikten sonra münhasıran kullanılabilir. Son olarak, üretilen viral stokların titrasyonu için kantitatif gerçek zamanlı P

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik...

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Son 15 yılda, köpek adenovirüsü tip 2 (CAV2) türevi vektörler, in vitro ve in vivo hücreleri dönüştürme etkinliklerini kanıtlamıştır ve aşılama ve gen tedavisi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, yüksek titreli viral süspansiyonlara yol açan CAV2 vektörlerini oluşturmak, üretmek ve saflaştırmak için bir prosedür açıklıyoruz.

Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Tüm viral kodlama dizilerinden yoksun yüksek kapasiteli adenoviral vektörlerin üretilmesi için bir protokol sunulmuştur. Vektör genomunda bulunan transgenlerin klonlanması, hedef güdümlü endonükleazlara dayanmaktadır. Yapışık hücreler olarak büyütülen ve süspansiyon halinde üretilen üretici hücrelerde virüs amplifikasyonu, trans halinde viral genler sağlayan yardımcı bir virüse dayanır.

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak "scarless" rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Burada, pAdEasy sistemini kullanarak adenovirüs üretimi için bir protokol sunuyoruz. Teknoloji, pAdTrack ve pAdEasy-1 plazmidlerinin rekombinasyonunu, adenovirüs paketleme ve amplifikasyonunu, adenoviral parçacıkların hücre lysate ve kültür ortamından arındırılmasını, viral titrasyonunu ve adenovirüsün fonksiyonel testini içerir.

Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem

Deniz ve tatlı su sistemlerinin virüslerin ciro oranı bir azalma ve yeniden oluşmaları tekniği ile tahmin edilebilir. Veriler araştırmacılar, su sistemlerinde virüs aracılı mikrobiyal ölüm oranları anlaması için izin verir.

Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

Öğrenin, adenovirüs yardımcı vektör kullanarak rekombinant parvovirus üretim verimliliğini on kat artırma yöntemini. HEC 293T hücre transfeksiyonu ve enfeksiyon stratejileriyle gen tedavisi uygulamaları için maliyet ve süre tasarrufu sağlayın.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Daha fazla video keşfet