Kullanarak Bileşiklerin Biyoaktivite için eşli Nanoinjection ve Ekran için Elektrofizyoloji Testi Drosophila melanogaster Dev Elyaf Sistemi

Bu videoda, dev fiber sisteminden elektrofizyolojik kayıtlar elde edilirken bir bileşiğin litre miktarlarının nasıl enjekte edileceğini ve bileşiğin bu devrenin işlevi üzerindeki etkilerinin nasıl izleneceğini göstereceğiz. Bu videoya başlamadan önce, Augustine Etal için Melanogaster'ın Dev Fiber Yolundan Elektrofizyolojik Kayıtlar başlıklı Joe videosunu dikkatlice izlemeniz ve aşina olmanız çok önemlidir. Burada sunulan video, bu mevcut Tekniğe bir genişleme olarak tasarlandığından, elektrofizyoloji teçhizatı kurulumu için gerekli ekipman Augustine tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır Al.In bu dergi, daha önce açıklanan elektrofizyoloji teçhizatı kurulumunu, bir ano enjektörü tutan altıncı bir mikro manipülatör ekleyerek değiştirir.

Hayvanın kafasına kolay erişim için, iki uyarıcı elektrot mikro manipülatörü arasına yerleştirilmelidir. Nano enjeksiyon kurulumu, nanolitre 2000 veya benzeri tipte bir enjektörün, enjektör ile birlikte verilen cam mikro pipetleri kullanarak 80 ila 100 megas dirence çekerek enjeksiyon iğnesi hazırlamasını gerektirir. Düzgün enjeksiyonlar için bir elektrot çektirme ile, mikro pipetlerin 45 derecelik bir açıyla 11 ila 17 mikrometrelik bir açıklığa eğim vermesi gerekir.

Nanolitre 2000 kılavuzunda belirtildiği gibi bir Hamilton şırınga kullanarak enjeksiyon mikro pipetini sentetik yağ ile yavaşça doldurun ve hava kabarcığı olmadığından emin olun. Mikro pipeti nano enjektöre dikkatlice sabitleyin ve Nanolitre 2000 manuel yükün talimatına göre fazla yağı boşaltarak bileşiği yüklemeye hazırlayın. Nanolitre 2000 kılavuzunda belirtildiği gibi bileşik.

Bu işlem sırasında mikro pipetin ucunun kırılmadığından emin olun. Enjektörün kontrol kutusuna enjekte edilecek istenen nanolitre miktarını NANOLITER 2000 kılavuzunda belirtildiği gibi ayarlayın. Enjekte edilen toplam miktarın 100 nanolitreyi geçmemesi gerektiğini lütfen unutmayın.

İki uyarıcı elektrot mikro manipülatörü arasındaki mikro manipülatöre bir Nanolitre 2000 yerleştirin. Enjeksiyonun kendisi hariç, kayıt alımı sırasında enjektörü kontrol kutusundan çıkarın. Bununla birlikte, kontrol kutusuna giden güç kaynağının bağlantısını kesmemek için, daha önce açıklandığı gibi CO2 veya gözlerle anestezi uygulanmış iki ila altı günlük sinekleri sıfırlayacaktır.

Harekete geçtikten sonra, hayvanı daha önce tarif edildiği gibi bacaklarından alarak yumuşak diş mumu içeren küçük bir tabağa aktarmak için bir cımbız kullanın. Sinek sırt tarafını dikkatlice yukarı monte edin ve vücudun etrafına yerleştirilen yumuşak diş mumu ile göğüs kafesinin ve başın hareketsiz hale getirildiğinden emin olun. Kanatları, göğüs kafesine dik duracak şekilde dikkatlice açın.

Monte edilmiş Fly'ı, başı uyarıcı elektrotlara bakacak şekilde elektrofizyoloji teçhizatına yerleştirin, hayvanı karşılık gelen uyarıcı toprak ve kayıt elektrotları ile kazığa oturtun Daha önce açıklandığı gibi, DLM kası, ön dorsal merkezi kıllar ile sineğin orta hattı arasındaki toraksta bulunur. TTM kası, Fly'ın arka ve ön iç ve iç supra allar kılları arasındaki kanat bağlantılarının yakınında bulunur, bileşiği içeren Enjeksiyon mikro pipetini, başın medial arka kısmında yer alan üç oslinin merkezi ile hizalar, ancak bileşik enjeksiyondan önce henüz enjekte etmeyin. Dev lifleri 100 hertz'de 10 uyaranlı 10 trenle aktive ederek beyin stimülasyonu yoluyla dev fiberden TTM'ye ve dev fiberden DLM'ye giden yolların temel kaydını elde edin.

Trenler arasında bir saniyelik bir gecikme ile. Yabani tip bir sinek, hem DLM hem de TTM yolakları için bu stimülasyon hızında bire bir takip edebilmelidir. Sineği atın.

Dev fiberden DLM'ye ve dev fiberden TTM'ye giden yollar varsa, bire bir oranında 100 hertz stimülasyonunu takip etmeyin. Dev fiberin bir hertz'de tek darbelerle sürekli uyarılmasına geçin. Arka plan gürültüsü bir hertz stimülasyon kayıtlarını engelleyecek olsa bile, enjektörü hızlı bir şekilde kontrol kutusuna takın.

Dikkatli bir şekilde bırakmayın. Enjeksiyon mikro pipetini, yüzeyin hemen altındaki sineğin baş kapsülüne yerleştirin. Bir hertz stimülasyonunu korurken istenen miktarda bileşik enjekte edin.

Enjeksiyon mikro pipetini enjeksiyon setinden hemen çıkarın ve enjeksiyondan bir dakika sonrasına kadar bir hertz dev fiber stimülasyonuna devam ederken enjektörü kontrol kutusundan çıkarın. Bileşiklerin dev lif sistemi üzerindeki daha ince etkilerini ortaya çıkarmak için, dev lifleri, trenler arasında bir saniyelik bir gecikme ile 100 hertz'de 10 uyaranla 10 trenle strese sokun. Bu paradigma ile dev fiber yolların işlevini her beş dakikada bir 15 dakikaya kadar test etmeye devam edin.

Burada gösterilen örnekte, dev fiberden TTM'ye giden yol, bileşik enjeksiyondan sonra etkilenmeden kalırken, dev fiberden DLM'ye giden yol etkilenmiştir Bileşiğin, dev lif sisteminin nöromüsküler kavşaklarında bir etkisi olup olmadığını test etmek ve muhtemelen bileşiğin etkilerini daraltmak için, bunun için motor nöronları doğrudan torasik stimülasyon ile aktive etmeye devam edin. Motor nöronları 100 hertz'de 10 uyaran dizisi 10 trenle uyarmak için uyarıcı elektrotları gözlerden çıkarın ve bunları toraksın ön taraflarına yerleştirin. Bu örnekte, stimülasyon beyin yoluyla iletildiğinde, DLM yolu güvenilir bir şekilde takip edemez.

Bununla birlikte, bileşiğin hedefine enjekte edilen bileşiğin belirli bir hedefi olarak nöromüsküler kavşağı hariç tutan torasik stimülasyon ile 100 hertz'de bire bir DLM nöromüsküler kavşak yanıtı daha sonra dev lif ile PSI veya PSI ile DLM motor nöronu arasındaki bağlantılara kadar daraltılabilir.