Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray'ler

Bu video, çip üzerinde foto polimerizasyon tekniği kullanarak bir polimer mikrodizi oluşturmak ve kullanmak için bir yöntemi açıklar. İlk olarak, cam slaytlar, düşük bağlı bir substrat üretmek için poli hidroksietil, metakrilat veya FEMA ile daldırılarak kaplanır. Monomerler, bir monomer çözeltileri kütüphanesi üretmek için çeşitli oranlarda karıştırılır.

Çözeltiler, robotik bir baskı cihazı kullanılarak bir cam slayt formatına aktarılır ve UV ışınlaması ile kürlenir. Monomer polimerize olur ve çözücü vakumla ekstrakte edilir. Yüksek verimli yüzey karakterizasyonunu takiben, mikrodiziler, bakteriyel bağlanma testleri gibi malzeme performansının taranması için kullanılabilir.

Bağlantı verilerinin analizi, polimer mikrodizi formatının faydasını vurgulayan yeni biyomalzemelerin keşfine yönelik bir adımdır. Bu tekniğin, farklı malzemelerin biyolojik tepkisinin araştırıldığı mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, her seferinde bir malzeme, tek bir slayt üzerinde kolayca manipüle edilebilen yüzlerce malzemenin paralel olarak taranmasıdır. Bu teknik, bakteri bağlanmasına direnen veya kök hücrelerin genişlemesini destekleyen materyallerin taranması gibi çeşitli biyolojik tahlillere kolayca uyarlanabilir.

Bu teknik, rejeneratif tıp için ploy potent kök hücre genişlemesini desteklemek için potansiyel uygulamalara sahip materyallerin keşfedilmesine yardımcı olmuştur. Ayrıca, tıbbi cihazla ilişkili enfeksiyonların oluşumunu azaltma potansiyeline sahip bakteri bağlanmasına direnen malzemelerin yakın zamanda keşfedilmesi konusunda da çok heyecanlıyız. Genel olarak, yönteme yeni başlayan kullanıcılar, bir mikrodiziyi yazdırmak için gereken koşulları optimize etmek için mücadele edeceklerdir, çünkü en uygun koşulları tahmin etmek zordur.

Küçük ayrıntıların bile yanlış anlaşılması, kullanılamaz dizilere yol açabilir. Hangi bakteri suşunun ve kültürel durumun kullanılacağını da dikkate almak önemlidir, çünkü bağlanma ve biyofilm morfolojisi türe ve ortama özgüdür ve bu nedenle önemli ölçüde değişebilir. Burada aerojeni model organizma olarak ve iyi kontrol edilen bağlanma testi için kimyasal olarak tanımlanmış ortamı kullanıyoruz.

MIT işbirlikçilerimiz ilk olarak DNA ve protein mikrodizileri ile karşılaştırarak bu yöntem için fikir sahibi oldular. Bunlar, kendi biyolojik birleşimsel alanlarını keşfetmek için iyi bir şekilde kurulmuştur. Dan ve Bob, bir prosedürü gösteren malzemelerden keşfedilmesi gereken benzer bir kimyasal Birleştirici uzayın var olduğunu fark ettiler: Andrew Hook ve Chen Chang, hoş geldiniz güveni tarafından finanse edilen projemizde doktora sonrası araştırmacılar olacak: Bu prosedüre düşük bir bağlanma arka planı hazırlayarak başlayın.

Bu, proteinler ve hücreler gibi biyomoleküllerin bağlanmasına direnen bir yüzeydir. İki gram poli hidroksietil metakrilat veya FEMA'yı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne tartın. Ardından, suda% 95 etanol ile hacmi 50 mililitreye getirin.

Daha sonra tüpü yaklaşık 24 saat boyunca veya FEMA tamamen çözünene kadar bir alete yerleştirin ve cam ışığını cımbızla tutun. Epoksi fonksiyonel cama batırın. Beş milimetre hariç hepsini birleştirmek için FEMA çözümüne kaydırın.

Epoksi grupları, FEMA kaplama ile kovalent bağlar oluşturur. Kaplanmamış kısım, bir saniyelik bir süre boyunca pozitif bir kontrol görevi görebilir. Slaytı FEMA solüsyonundan geri çekin, ardından slaytı ters çevirin ve kuruması için yataya yakın bir konuma yerleştirin.

Sürgü kuruduktan sonra bir sürgü tutucusuna yerleştirin. Çözücünün tamamen buharlaşmasını sağlamak için FEMA kaplı slaytları bir hafta boyunca atmosferik koşullarda bırakın. Monomer çözeltilerini yapmak için, beş mikrolitre foto başlatıcı solüsyonu ve 15 mikrolitre dimetilformamid çözünür akrilat, metakrilat monomerlerini 384 kuyucuklu bir kaynak plakasına pipetleyin.

Toplamda 20 mikrolitrelik bir hacim leke oluşumu için idealdir. Artık çözümler üretildiğine göre, mikrodiziyi oluşturmak için X, Y, Z aşamasına sahip bir temaslı baskı robotu kullanılır. Robot, çözelti transferi için rezervuar işlevi gören yarıklar içeren 220 mikrometre çapında oluklu pimler kullanır.

Pimleri ve pim tutucuyu 10 dakika boyunca di kloro metan içeren bir atore yerleştirerek başlayın. Ardından pimlerin kurumasını bekledikten sonra, tutucuyu yazıcı kafasına yeniden takın. Ardından, pimleri tutucuya yerleştirin.

Daha sonra kurutma için 10 cam slaytı ve FEMA kaplı slaytları robota yükleyin. Tipik olarak, her slayta üç çoğaltma dizisi yazdırılır. Ardından boru kullanarak robotun yıkama istasyonunu 2,5 litre taze dimetilformamid içeren bir şişeye bağlayın.

Monomer çözeltisini içeren plakayı robota yükleyin. Oksijen seviyesini 2000 PPM'nin altına düşürmek için robotun tüm odasını Argonne ile doldurun. Bu düşük seviyede polimerizasyon radikalleri oksijen ile söndürülmemelidir.

Bir nem düzenleme cihazı kullanarak, nem de dahil olmak üzere robot odası içinde %30 ila %40 arasında tutulacak nemi ayarlayın, FEMA'nın şişmesine izin verir, bu da oluşan polimerin FEMA tabakasına nüfuz etmesine ve fiziksel olarak yüzeye sıkışmasına izin verir. Yazdırma çalışmasını başlatmak için, ilgili bilgisayarla yazılıma devam edin. Pimler daha sonra saniyede 25 milimetre hızında monomer çözeltilerine inecektir.

Daha sonra 2,5 saniye boyunca çözelti içinde tutulacaklar ve saniyede 25 milimetre hızla çekilecekler. Daha sonra, pimin ucu, pimin yorgan kısmından yaklaşık 2,4 nanolitre çözelti dağıtan FEMA kızakları ile temas ettirilir. Her temas için toplam temas süresi 10 milisaniyedir ve yaklaşma ve geri çekilme hızı saniyede 175 milimetredir.

Pimler daha sonra, monomer çözeltisini pimin dışından çıkarmak için cam kurutma kızakları ile tekrar tekrar temas ettirilerek lekelenir. Kullanılan lekeleme dizisi, temiz bir cam kızağa sahip 33 kontaktan oluşur. İlk dört pozisyon sırasıyla 10, 5, 4 ve üç temas kuracaktır.

Sonraki dört konum iki temas oluşturacak ve son üç konum baskının ardından bir temas kuracaktır. Pimler, 30 saniye boyunca çalkalama ile bir DMF akış banyosunda yıkanır. Aynı zamanda, basılı slaytlar, santimetre kare başına 30 milivolt yoğunlukta bir kısa dalga UV 365 nanometre kaynağı ile ışınlanır.

Yıkama ve ışınlama tamamlandıktan sonra bir sonraki slayt yazdırılır. Baskı başarılı görünüyorsa, dizileri 10 dakika daha 365 nanometrede UV ile ışınlayın. Yeni basılmış diziler, baskı ve vakumlu ekstraksiyondan sonra polimerize olmamış, monomer ve çözücüyü çıkarmak için bir hafta boyunca 50 mili turdan daha az olacak şekilde ayarlanmış bir vakumlu fırına yerleştirilir.

Polimer noktaların polimerizasyonunun başarısı, herhangi bir anormal nokta morfolojisini tanımlamak için basit ışık mikroskobu ile değerlendirilebilir, tipik olarak lekeler soldaki bu şekilde gösterildiği gibi dairesel ve tekdüze görünmelidir. Geometrideki bir değişikliğin olası nedeni, monomer çözeltilerinde hasar görmüş veya temiz olmayan bir pim veya toz kirleticisidir. Böyle bir durumda, işlemin az sayıda monomer kombinasyonu için tekrarlanması gerekecektir.

Şekilsiz noktalar görülebilir, örneğin, sağda gösterilen küçük noktalardan oluşan bir uydu ile merkezi bir nokta veya büyük bir düz noktanın üzerinde merkezi bir nokta bulunan kızarmış yumurta şeklinde bir yer görülebilir. Bu, monomerlerin viskozitesi, hidrofiliklik uçuculuğu veya yüzey gerilimindeki farklılıklarla ilgili olarak baskıdan önce faz ayrılmasından kaynaklanabilir ve monomer kombinasyonunun bu formatla uyumlu olmadığını düşündürür. Polimer noktaların ek kimyasal haritalanması, malzeme kimyalarının noktalar arasındaki dağılımını ve üretilen mikrodizilerin dizi yüksek verimli yüzey karakterizasyonunu veya HTSC'sini belirlemek için önemli ve bazen gerekli bir kalite kontrol adımıdır.

Bu tekniğin kullanılması aynı zamanda biyolojik performansın fizyokimyasal özelliklerle ilişkilendirilmesine de izin verir. Bu, biyolojik malzeme etkileşiminin incelenmesini sağlar. HTSC, su temas açısı ölçümleri, uçuş süresi, ikincil iyon kütle spektrometresi, atomik kuvvet mikroskobu ve x-ışını foto elektron spektroskopisinden yararlanır.

Özellikle, TOF sims, hücre tepkisini moleküler bir kısım ile ilişkilendirmek için kullanılabilecek numunenin kimyasal olarak zengin bir analizini sağlar. Bazı durumlarda, biyolojik performans tahmin edilebilir. Biyolojik bir malzeme etkileşiminin kimyasal bağımlılığını gösteren ve HI malzemelerinin gelişimini bildiren TOF SIM spektrumları.

Polimer mikroarray yüzeyi karakterize edildikten sonra, biyolojik etkileşimlerin incelenmesi için kullanılabilir. Burada, bir bakteri bağlanma testinin gerçekleştirilmesinde mikrodizinin kullanımını gösteriyoruz. 10 mililitre LB'yi tek bir GFP etiketli pseudomonas kolonisi ile aşılayarak başlayın.

Aerojen, gece boyunca 200 RPM sallama ile 37 santigrat derecede büyür. Gece boyunca bakteri kültürünün OD 600'ünü ölçün ve kültürü 15 mililitre RPMI 1640'ta 0.01'lik bir OD 600'e seyreltin. Bu arada, dizi slaytlarını yıkayın ve polimerize olmamış, monomer, tüm bağlar ve çözücü gibi dizilerden çözünebilir bileşenleri çıkarmak için damıtılmış suyu 10 dakika sterilize edin.

Ardından slaytları bir hava akımı kabininde havayla kurutun. Daha sonra yıkanmış dizi slaytlarını temiz bir Petri kabına yerleştirin ve 10 dakika boyunca UV ile sterilize edin. Bakteri kültürü hazır olduğunda, slaydı diziyle birlikte bir Petri kabına aktarın ve aşılanmış RPMI 1640 ortamından 15 mililitre ekleyin.

İkinci bir Petri kabına başka bir dizi slaydı yerleştirin ve kontrol olarak 15 mililitre steril RPMI 1640 ekleyin. Bulaşıkları 37 santigrat derecede 72 saat boyunca inkübe edin ve inkübasyonu takiben 60 RPM'de çalkalayın. Slaytları 15 mililitre steril PBS ile 100 RPM'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra fosfat tuzunu çıkarmak için slaytları 15 mililitre steril damıtılmış su ile iki kez yıkayın. Yıkamayı takiben. Slaytların bir hava akışı kabininde kurumasına izin verin.

Slaytlar kuruduktan sonra. Uygun görüntüleme teknolojisi ve yazılımı kullanılarak GFP'nin bozulmasını önlemek için mümkün olan en kısa sürede bir floresan tarayıcı tarafından okunmalıdırlar. Bakteriyel bağlanmaya bağlı floresan, bakteri yapışmasına dirençli malzemeleri tanımlamak için yalnızca aşılanmış numuneden ortam kontrolünden floresansın çıkarılmasıyla hesaplanır.

Mikrodiziler oluşturuldu ve bu videoda açıklanan yöntemlere göre bakteriyel adezyon testleri yapıldı. Burada görüldüğü gibi, polimer mikroarray, hem düşük floresansa sahip düşük bakteri yapışmasına sahip hem de yüksek floresansa sahip yüksek bakteri yapışmasına sahip malzemeler içerir. Burada gösterilen üç dizi, üç kopyadan gelen floresan değerlerinin ortalaması alındığında ve bir 3B gösterim olarak sunulduğunda çoğaltılır.

Burada gösterildiği gibi, nicel görsel yorumlama basitleştirilmiştir. Sağdaki yoğunluk ölçeği, floresan verilerinin değerlerini temsil eder. Temel düzeyde, düşük floresanslı malzemelerin tanımlanması, bakteri bağlanmasına direnmek gibi belirli bir biyolojik uygulamayı yerine getiren malzemelerin hızlı bir şekilde tanımlanması için bir araç sağlar.

Bununla birlikte, bu sonuçlar, malzemelerin belirli özellikleri ile biyolojik performansları arasındaki korelasyonları araştırmak için HTSC ile de birleştirilebilir. Bu analiz, yapıyı, işlev ilişkilerini açıklığa kavuşturabilir, böylece malzemelerle biyolojik etkileşimi destekleyen mekanizmaları belirleyebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir polimer mikrodizisinin nasıl hazırlanacağını ve yazdırılacağını iyi anlamalı ve ayrıca polimer mikrodizilerin malzemelere bakteri tepkisini araştırmak için nasıl kullanılabileceği hakkında bir fikir sahibi olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bir polimer mikro dizisi doğru şekilde gerçekleştirilirse iki gün içinde basılabilir. Monomerlerin hazırlanması yaklaşık bir gün sürer ve dizinin basılması yaklaşık altı saat sürer. Bakteriyel bağlanma testi beş gün sürer, bu da kaplama kültürünü bir oküler olarak büyütme süresini artırır Bakteri kültüründeki mikroışın ışığının 72 saat boyunca inkübe edilmesinde ve mikroray tarayıcı kullanarak ormanı ve sinyali tespit ederken, Tamam, bu prosedürü denerken, pimi ve pim tutucuları temiz tutmak önemlidir.

Bir çalışmanın yarısında pimin dik konumda sıkışması ve artık yüzeyle temas edememesi çok sinir bozucudur, bu da pimin veya pim tutucunun yeterince temizlenmemesine neden olur. DMF ve toksik monomerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve ekstraksiyon gibi önlemlerin her zaman prosedüre dahil edilmesi gerektiğini unutmayın.