RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, QPCR veya yüksek çıktı dizileme kullanarak belirli bir kodlamayan RNA ile ilişkili DNA bölgelerini belirlemektir. Bu işlem, in vivo ortamdaki doğal DNA-RNA etkileşimlerini hapsetmek için hücrelerin çapraz bağlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda hücreler lizis işlemine tabi tutulur ve hücre lizatını çözünür hale getirip kromatini küçük parçalara ayırmak için sonikasyon uygulanır.

Ardından, ilgilenilen R-N-A-D-N-A komplekslerini spesifik olarak zenginleştirmek amacıyla hücre lizatına biyotinlenmiş antisense oligolar eklenir; qPCR veya yüksek verimli sekanslama sonucunda kodlamayan RNA'ya bağlı genomik bölgelerin kimliğini aydınlatan sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin R-N-A-D-N-A FISH gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, CHIRP'in kodlamayan RNA bağlanma bölgelerinin genom çapındaki haritalarını neredeyse baz çifti çözünürlüğünde sunabilmesidir. Bu yöntem, roX RNA'ların ve erkek sineklerin dozaj kompanzasyonunu nasıl sağladığı gibi kodlamayan RNA alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir.

Bu tekniğin etkileri, kodlamayan RNA'ların kromatin durumlarını ve gen ekspresyonunu nasıl düzenlediğinin daha iyi anlaşılmasını sağladığından, kodlamayan RNA ile ilişkili hastalıkların tedavilerine kadar uzanmaktadır. Bu RNA saflaştırması ile kromatin izolasyonu veya chirp deneyi için, santrifüj sonrası 40 milyon hücre hasat edilecektir; PBS'yi dökün ve kalan sıvıyı eğik bir açıyla dikkatlice aspire ederek uzaklaştırın, ardından falcon tüpünün altına vurarak hücre peletini yerinden oynatın. Yeni hazırlanmış %1 glutaraldehit ekleyin; küçük bir hacimle başlayarak hücre peletini resüspande edin, toplam hacmi tamamlayın ve ardından karıştırmak için ters çevirin; oda sıcaklığında, uçtan uca bir sarsıcı veya rotatör üzerinde 10 dakika boyunca çapraz bağlayın; çapraz bağlama reaksiyonunu hacmin onda biri kadar 1,25 molar glisin ile durdurun ve oda sıcaklığında bir sarsıcı üzerinde beş dakika bekletin, hücreler parlak turuncu renge dönecektir.

Ardından 2000 RCF'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı döküp aspire edin ve peleti 20 mililitre soğutulmuş PBS ile yıkayıp tekrar santrifüjleyin; süpernatantı aspire edin ve yıkanmış çapraz bağlı peleti soğutulmuş PBS ile yeniden süspande edin. Hücrelerin her bir mililitresini bir eppendorf tüpüne aktarın ve 4 °C'de 2000 RCF'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, mümkün olduğunca fazla PBS'yi dikkatlice uzaklaştırmak için bir pipet ucu kullanın.

Tüm hücre peletlerini sıvı azot içerisinde şok dondurun ve eksi 80 derece Celsius'ta süresiz olarak saklayın. Chirp için hücre lizatı hazırlamak amacıyla, dondurulmuş çapraz bağlı hücre peletlerini oda sıcaklığında çözdürün. Hücre peletini yerinden oynatmak ve karıştırmak için sertçe vurun.

Peletleri santrifüjle çöktürün ve bir miligram hassasiyete sahip elektronik bir terazi üzerinde, kalan PBS'yi uzaklaştırmak için sivri uçlu 10 µL pipet ucu kullanın. Boş bir eppendorf tüpünün kütlesini daralın. Her bir peleti tartın ve ağırlığını kaydedin.

Her tüpe, taze proteaz inhibitörü PMSF ve super ace ile takviye edilmiş 10 kat hacminde lizis tamponu ekleyin ve peleti yeniden süspande edin. Hücre lizatı, hazırlandıktan hemen sonra kullanılarak işleme alınmalıdır. Her bir 15 mililitrelik falcon tüpüne 1,5 mililitreden fazla lizat aktarmayın ve sonikasyon problarını sıkıca vidalayarak yerleştirin.

Ardından tüpleri bir bio rupture yerleştirin ve dört derece Celsius sıcaklıkta, en yüksek ayarda, 30 saniye açık 45 saniye kapalı puls aralıklarıyla sonikasyon uygulayın. Lizatı her 30 dakikada bir kontrol edin. Hücre lizatı bulanık olmaktan çıkana kadar sonikasyona devam edin.

Bu işlem; tüp sayısına, örnek hacmine, benmari sıcaklığına ve sonikasyon süresine bağlı olarak 30 dakikadan dört saate kadar sürebilir. Lizat berraklaştığında, beş µL taze bir einor tüpüne aktarın. DNA proteaz K tamponu ve proteaz K ekleyip karıştırmak için vorteksleyin ve kısa süre santrifüjleyin; ardından 50 °C'de 45 dakika inkübe edin ve DNA'yı bir PCR saflaştırma kiti ile ekstrakte edin.

DNA boyutunu %1'lik agaroz jelde kontrol edin. DNA yayılımının büyük kısmının 100 ila 500 baz çifti arasında olması, sonikasyonun tamamlandığını gösterir. Sonike edilmiş numunelerin bir mililitrelik alikotlarını 4 °C'de, 10 dakika boyunca 16.100 RCF'de santrifüjleyin. Süpernatanı taze eppendorf tüplerine aktarın ve ChIRP prosedürüne başlamak için sıvı azot içinde hızlıca dondurun. Tipik bir ChIRP numunesi için kromatin tüplerini oda sıcaklığında çözdürün.

Bir mililitre lizat kullanarak, RNA girişi için 10 mikrolitre ve DNA girişi için 10 mikrolitre ayırıp einor tüplerine yerleştirin. Daha sonraki aşamaya kadar buz üzerinde tutun. Her bir kromatin örneğinden bir mililitreyi 15 mililitrelik bir falcon tüpüne aktarın.

Her tüpe iki mililitre hibridizasyon tamponu ekleyin. Ardından, probları oda sıcaklığında çözdürün. Bu biyotinize döşeme oligoları, RNA boyunca konumlarına göre etiketlenmiş ve iki havuza ayrılmıştır.

Çift havuzu, çift numaralı tüm probları içerir. Tek havuzu ise tek numaralı probları içerir. Tüm deneyler, birbirleri için iç kontrol görevi gören her iki havuz kullanılarak gerçekleştirilir.

Gerçek protokolün en zorlayıcı yönlerinden biri, tüm hibridizasyon ve yıkama adımlarının 37 derecede gerçekleştirilmesi gerekmesidir. Deney sıcaklığının tutarlı olmasını sağlamak için tüm adımları bir inkübasyon fırınının içinde veya yakınında gerçekleştirin. Uygun hacimdeki probları belirli tüplere ekleyin. İyice karıştırın ve hibridizasyon tamamlanmadan 20 dakika önce, çalkalamalı olarak dört saat boyunca 37 derecede inkübe edin.

C one manyetik boncuklarını hazırlayın. Prob başına 100 pico mol için 100 microliter kullanın. Boncukları tampondan ayırmak için Dyna mag iki şerit mıknatısını kullanarak, unsu eklenmemiş lizis tamponu ile üç kez bir mililitre ile yıkayın.

Son yıkamanın ardından, boncukları orijinal lizis tamponu hacminde yeniden süspanse edin ve taze PMSF ile proteaz inhibitörü ekleyin. Dört saatlik hibridizasyon reaksiyonu tamamlandığında, her tüp karışımına 100 µL boncuk ekleyin. 37 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin; ilk yıkamada boncukları 37 °C'de ön ısıtmaya tabi tutulmuş 1 mL yıkama tamponu ile yıkayın.

Boncukları ayırmak için dyna mag 15 manyetik şerit kullanın, üst fazı boşaltın ve 1 mL yıkama tamponu içinde yeniden süspande ederek 1,5 mL'lik EOR tüpüne aktarın. Sonraki yıkamalar için 37 °C'de beş dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin, her bir tüpü mini santrifüjde çöktürün ve örneği bir dakika boyunca dyna mag iki manyetik şeride yerleştirip örneğin üst fazını boşaltın. Sızan damlaları Kim wipe ile silin ve 1 mL içinde yeniden süspande edin.

Yıkama tamponu ile beş dakika boyunca 37 °C'de çalkalayarak inkübe edin. Toplamda beş yıkama olacak şekilde işlemi tekrarlayın. Son yıkamada boncukları iyice resüspande edin; RNA izolasyonu için 100 µL alıp kenara ayırın, DNA fraksiyonu için 900 µL rezerv edin.

Tüm tüpleri dyna mag tüp manyetik şeridine yerleştirin ve yıkama tamponunu uzaklaştırın. Kısa bir santrifüj işleminden sonra, tüpü tekrar manyetik şerit üzerine yerleştirin ve keskin bir 10 µL pipet ucu kullanın. Her tüpte kalan yıkama tamponunu tamamen uzaklaştırın.

Ardından, miktar tayini ve sekanslama için chirp örneklerinden RNA ve DNA fraksiyonları izole edilir. Bu şekil, HELOC hücrelerinden GA dh üzerinden insan telomeraz, RNA veya Turk zenginleşmesini göstermektedir. Bolluğu fazla olan hücresel bir RNA, negatif kontrol olarak hizmet eder.

Hücrede bulunan Turk RNA'nın büyük çoğunluğu (yaklaşık %88), chirp uygulanarak çöktürülmüşken, GA DH RNA'nın yalnızca %0,46'sı geri kazanılmış olup bu durum yaklaşık 200 katlık bir zenginleştirme faktörünü kanıtlamaktadır. Memeli hücrelerde genellikle eksprese edilmeyen LAC Z RNA'yı hedefleyen problar gibi spesifik olmayan problar, ek negatif kontroller olarak kullanılabilir. Hedefle bağlanması beklenen DNA bölgeleri. Uzun kodlamayan RNA'lar, QPCR ile ölçüldüğünde genellikle negatif bölgelere göre zenginleşmiş durumdadır.

Bu şekil, aynı hücre hattında chirp SSE gerçekleştirilerek belirlenen, primer insan sünnet derisi fibroblastlarındaki dört sıcak hava bağlanma bölgesinin QPCR doğrulamasını göstermektedir; Turk ve GA DH DNA bölgeleri ise negatif kontrol bölgeleri olarak hizmet etmektedir. Hem çift hem de tek sayılı prob setleri, beklenen sıcak hava bağlanma bölgelerinde negatif bölgelere kıyasla benzer zenginleşme sağlamıştır. Bu durum, gerçek uzun kodlamayan RNA bağlanma bölgelerinin karakteristik bir özelliğidir.

Dozaj kompanzasyonu için gerekli olan bir şekilde X kromozomu ile etkileşime girdiği bilinen trla uzun kodlamayan RNA Rocks two'dan elde edilen bu verilerin gösterdiği gibi, chirp ile zenginleştirilmiş DNA'nın yüksek verimli sekanslanmasıyla uzun kodlamayan RNA bağlanma bölgelerinin küresel bir haritası elde edilebilir. Hem çift hem de tek numaralı örnekler ayrı ayrı sekanslanmış ve her bir pikin güçlü bir rocks two bağlanma bölgesini belirttiği örtüşen sinyallerden oluşan bir iz üretmek için benzersiz gürültüler giderilmiştir. Bu prosedür uygulanırken, doğru RNAz'sız tekniklerin uygulanması önemlidir. Bu prosedür takip edilmelidir.

Geliştirilmesinin ardından, ilgilenilen klinik dışı DRNA ile hangi proteinlerin etkileşime girdiğini belirlemek gibi ek soruları yanıtlamak için protein dot blotting gibi diğer yöntemler uygulanabilir. CHI, RNA biyolojisi alanındaki araştırmacıların kültür hücrelerindeki ve fikse edilmiş dokulardaki RNA etkileşimlerini haritalandırmasının önünü açmıştır.