RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, QPCR veya yüksek verimli dizileme kullanarak belirli bir kodlamayan RNA ile ilişkili DNA bölgelerini belirlemektir. Bu, in vivo olarak doğal D-N-A-R-N-A etkileşimlerini yakalamak için hücrelerin çapraz bağlanmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, hücreler parçalanır ve hücre lizatını ve saf kromatini küçük parçalara dönüştürmek için sonikasyona tabi tutulur.

Daha sonra, R-N-A-D-N-A kompleksleri için spesifik olarak zenginleştirmek amacıyla hücre lizatına biyotinile antisens oligolar eklenir, QPCR veya yüksek verimli dizilemeye dayalı olarak kodlamayan RNA'ya bağlı genomik bölgelerin kimliğini aydınlatan sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin R-N-A-D-N-A FISH gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, cıvıltının, yakın baz çifti çözünürlüklerinde kodlamayan RNA bağlanma bölgelerinin genom çapında haritalarına izin vermesidir. Bu yöntem, kayaların, RNA'ların ve erkek sineklerin dozaj telafisini nasıl elde ettiği gibi kodlamayan RNA alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir.

Bu tekniğin çıkarımları, kodlamayan RNA'nın kromatin durumlarını ve gen ekspresyonunu nasıl düzenlediğini daha iyi anlamayı sağladığı için kodlamayan NA ile ilişkili hastalıkların tedavilerine yönelik kapsamı. RNA saflaştırması veya cıvıl cıvıl deneyi ile bu kromatin izolasyonu için, santrifüjlemeden sonra 40 milyon hücre toplanacak, PBS'yi boşaltacak ve kalan sıvıyı, şahin tüpünün dibine dokunarak hücre peletini yerinden çıkaran bir açıyla dikkatlice aspire ederek çıkaracaktır. Küçük bir hacimden başlayarak taze hazırlanmış% 1 glutaraldehit ekleyin ve hücre peletini tam hacme kadar yeniden süspanse edin ve daha sonra çapraz bağı karıştırmak için ters çevirin, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca uçtan uca bir çalkalayıcı veya döndürücü üzerinde çapraz bağlama reaksiyonunu 10. hacim 1.25 molar glisin ile söndürün ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde beş dakika bekletin, Hücreler parlak turuncuya dönecektir.

Bir sonraki dönüşte 2000 RCF'de beş dakika boyunca, süpernatanı boşaltın ve aspire edin ve peleti tekrar 20 mililitre soğutulmuş PBS dönüşü ile yıkayın, süpernatanı aspire edin ve yıkanmış çapraz bağlı damağı soğutulmuş PBS ile yeniden süspanse edin. Her mililitre hücreyi bir einor tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede üç dakika boyunca 2000 RCF'de döndürün. Santrifüjlemeden sonra, mümkün olduğunca fazla PBS'yi dikkatlice çıkarmak için bir pipet ucu kullanın.

Flash, tüm hücre peletlerini sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede süresiz olarak saklayın. Cıvıl cıvıl hücre lizatı hazırlamak için, donmuş çapraz bağlı hücre peletlerini oda sıcaklığında çözün. Hücre peletini çıkarmak ve karıştırmak için sertçe vurun.

Peletleri döndürün ve 10 mikrolitrelik keskin bir pipet ucu kullanarak bir miligrama kadar hassas bir elektronik terazide kalan PBS'yi çıkarın. Boş bir einor tüpünün kütlesini yırtın. Her peleti tartın ve ağırlığını kaydedin.

Her tüpe taze proteaz inhibitörü PMSF ve süper as ile takviye edilmiş 10 x hacimde lizis tamponu ekleyin ve peleti yeniden süspanse edin. Hücre lizatı, hazırlandıktan hemen sonra tüketilmelidir. Her 15 mililitrelik şahin tüpüne 1,5 mililitreden fazla lizat aktarmayın ve sonikasyon problarını sıkıca vidalayarak yerleştirin.

Daha sonra tüpleri bir biyo yırtılmaya yerleştirin, nabız aralıklarında 45 saniye kapalı 30 saniye ile en yüksek ayarda dört santigrat derecede sonikasyon yapın. Her 30 dakikada bir lizatı kontrol edin. Hücre lizatı artık bulanık olmayana kadar sonikasyona devam edin.

Bu, tüp sayısına, numune hacmine, banyo sıcaklığına ve sonikasyon süresine bağlı olarak 30 dakika ila dört saat sürebilir. Lizat berraklaştığında, beş mikrolitreyi taze bir einor tüpüne aktarın. Karıştırmak ve döndürmek için DNA proteaz K tamponu ve proteaz K girdabı ekleyin, DNA'yı bir PCR saflaştırma kiti ile çıkardıktan sonra 50 santigrat derecede 45 dakika kısa bir süre inkübe edin.

% 1 aros jeli üzerindeki DNA boyutunu kontrol edin. DNA yaymasının büyük kısmı, tam sonikasyon santrifüjünü gösteren 100 ila 500 baz çifti olmalıdır. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16, 100 RCF'de sonikasyonlu numunelerin bir mililitrelik alikotları, süpernatanı taze einor tüplerine aktarın ve tipik bir cıvıltı numunesi için oda sıcaklığında kromatin tüplerini cıvıl cıvıl çözme işlemine başlamak için sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.

Bir mililitre lizat kullanarak, RNA girişi için 10 mikrolitre ve DNA girişi için 10 mikrolitre çıkarın ve einor tüplerine yerleştirin. Daha ileri gidene kadar buzda tutun. Her kromatin örneğinden bir mililitreyi 15 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın.

Her tüpe iki mililitre hibridizasyon tamponu ekleyin. Ardından, probları oda sıcaklığında çözdürün. Bu biyotinile döşeme oligoları, RNA boyunca konumlarına göre etiketlenir ve iki havuza ayrılır.

Çift havuz, çift sayılara sahip tüm probları içerir. Ve tek havuz, tek sayılara sahip problar içerir. Tüm deneyler, birbirleri için dahili kontrol görevi gören her iki havuz kullanılarak gerçekleştirilir.

Gerçek protokolün en zorlu yönlerinden biri, tüm hibridizasyon ve yıkama adımlarının 37 derecede gerçekleştirilmesi gerektiğidir. Tutarlı deneysel sıcaklık sağlamak için, tüm adımları bir yerleşim fırınının içinde veya yakınında gerçekleştirin, Belirli tüplere uygun hacimde prob ekleyin. İyice karıştırın, hibridizasyon tamamlanmadan önce 20 dakika çalkalanarak dört saat boyunca 37 derecede inkübe edin.

C bir manyetik boncukları hazırlayın. 100 piko mol prob başına 100 mikrolitre kullanın. Boncukları tampondan ayırmak için Dyna mag iki şerit mıknatıs kullanarak bir mililitre unsu takviyeli lizis tamponu ile üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, orijinal lizis tamponu hacmindeki boncukları tekrar askıya alın ve süper taze PMSF ve proteaz inhibitörü ile takviye edin. Dört saatlik hibridizasyon reaksiyonu tamamlandığında, her tüp karışımına 100 mikrolitre boncuk ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin, bir mililitre yıkama tamponu ile boncukları çalkalayın, ilk yıkamada 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.

Boncukları ayırmak, boşaltmak ve bir mililitrelik yıkama tamponunda yeniden süspanse etmek için bir dyna mag 15 manyetik şerit kullanın, 1.5 mililitrelik bir EOR tüpüne aktarın. Sonraki yıkamalarda beş dakika çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin, her tüpü bir mini santrifüjde döndürün ve numuneyi bir dakikalık dekant numune için bir dyna mag iki manyetik şerit üzerine ayarlayın. Damlamaları bir Kim mendiliyle silin ve bir mililitrede yeniden askıya alın.

Tamponu yıkayın, beş dakika çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Son yıkamada toplam beş yıkama için tekrarlayın Resus. Boncukları iyice askıya alın, 100 mikrolitreyi çıkarın ve RNA izolasyonu için bir kenara koyun, DNA fraksiyonu için 900 mikrolitre ayırın.

Tüm tüpleri dyna mag tube manyetik şeridine yerleştirin ve yıkama tamponunu çıkarın. Kısa bir döndürmeden sonra, tüpü 10 mikrolitrelik keskin bir pipet ucu ile mıknatıs şeridine tekrar yerleştirin. Kalan yıkama tamponunu her tüpten tamamen çıkarın.

RNA ve DNA fraksiyonları daha sonra kantitasyon ve dizileme için cıvıl cıvıl numunelerden izole edilir. Bu şekil, insan telomerazı, RNA veya Turk'ün HELOC hücrelerinden GA dh üzerinden zenginleşmesini göstermektedir. Negatif kontrol görevi gören bol miktarda hücresel RNA.

Hücrede bulunan Türk RNA'sının çoğunluğu, yaklaşık% 88'i cıvıltı yapılarak aşağı çekilirken, GA DH RNA'nın sadece% 0.46'sı elde edildi ve yaklaşık 200 kat zenginleştirme faktörü gösterdi Genellikle memeli hücrelerinde eksprese edilmeyen LAC ZRNA'yı hedefleyen problar gibi spesifik olmayan problar, ek negatif kontroller olarak kullanılabilir. Hedefe bağlanması beklenen DNA bölgeleri. Uzun kodlamayan RNA, QPCR ile ölçüldüğünde tipik olarak negatif bölgeler üzerinde zenginleştirilir.

Bu şekil, aynı hücre hattında cıvıl cıvıl SSE gerçekleştirilerek belirlenen primer insan sünnet derisi fibroblastlarında sıcak havaya bağlı dört bölgenin QPCR doğrulamasını gösterirken, Turk ve GA DH DNA bölgeleri negatif kontrol bölgeleri olarak görev yapar. Hem çift hem de tek prob setleri, negatif bölgeler üzerinde beklenen sıcak havaya bağlı bölgelerin karşılaştırılabilir zenginleşmesini sağladı. Gerçek uzun kodlamayan RNA bağlanma bölgelerinin ayırt edici özelliği.

Dozaj telafisi için gerekli bir şekilde X kromozomu ile etkileşime girdiği bilinen trla uzun kaplamasız RNA Rocks iki'den alınan bu verilerle gösterildiği gibi, cıvıl cıvıl zenginleştirilmiş DNA'nın yüksek verimli dizilimi ile uzun kodlamayan RNA bağlanma bölgelerinin küresel bir haritası elde edilebilir. Hem çift hem de tek örnekler ayrı ayrı sıralandı ve benzersiz sesleri, bu prosedürü denerken her bir zirvenin güçlü bir kaya görüşünü gösterdiği örtüşen sinyallerin bir izini üretmek için ortadan kaldırıldı. Bu prosedürü takiben doğru RNA'lardan arınmış tekniği uygulamak önemlidir.

Protein do blotting gibi diğer yöntemler, hangi proteinlerin klinik olmayan DRNA ile etkileşime girdiği gibi ek soruları yanıtlamak için yapılabilir. CHI, RNA biyolojisi alanındaki araştırmacıların kültür hücrelerinde ve sabit dokularda RN aktütünü haritalamasının yolunu açtı.