Name: Enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik Tuz-modifiye Nafion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Keşfedin enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik tuz-modifiye Nafion membran sentezi. Bu yöntem, enzim aktivite testlerinde kararlılığı artırarak biyokimyasal uygulamalarda verimliliği yükseltir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Donanma Araştırma, Birleşik Soya Kurulu ve finansmanı için Ulusal Bilim Vakfı Office kabul ederler.

1. Kuaterner Amonyum Tuzları ile Nafion Modifikasyonu <ol><li> Yaklaşık kuvvetlice% 5 w / v Nafion süspansiyon bir şişe çalkalanır. Bu Nafion sağlamak için 30 saniye çözelti içinde eşit şekilde süspanse edilir. </li><li> Bir cam şişeye (şişeye hacmi 2.5 ml ila 10 ml içerebilir) içine artık tekrar askıya Nafion 2 mL dışarı Pipeti. </li><li> Bir 3-kat molar fazlalıktan (Nafion polimer üzerindeki sülfonik asit grupları oranla) alkil amonyum bromür tuzu (uygun kütleler Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir) ile ölçülür ve Nafion 2 mL ihtiva eden bir şişeye, bu ekleyin. </li><li> 10-15 dakika 1500 rpm&#39;de Vortex flakon. </li><li> Yaklaşık ölçen bir plastik tartım tepsisine viskoz solüsyonu dökün. 3 x 3 inç ve tartım tepsiye tüpten kalan çözüm aktarmak için bir pipet kullanın. </li><li> Çözücüler tartım tepsinin alt (Fi sarı / kahverengi, şeffaf film bırakarak, tartmak tekne dışarı buharlaşmasına izinGure 2). Çözücü buharlaştırma ile oranı da buharlaştırmak için tüm solvent için birden fazla 6 saat sürer ki bu olmalıdır. Çözücü buharlaşır çok hızlı, bir beyaz, kabuklu malzemenin polimerin micellar yapısı tahrip olmuştur belirten bir saydam film yerine oluşturacak ve prosedür tekrar başlaması gerekir. Solvent buharlaşması çok yavaş ise buharlaşma çok yavaş tipik bir yapışkan, portakal jel yol ve yordamı yeniden başlamalıdır, çünkü bir de nemlendirici, gerekli olabilir. 37 ° C - solvent buharlaşması için tipik sıcaklık aralıkları 20 olan Kurutma için gerçek koşulları odasında bağıl nem ve sıcaklık bir fonksiyonu vardır, ama önemli olan jel oluşumuna imkan vermek için kuruma misel yapısını korumak için yavaş olmak, ama çok yavaş olduğunu. </li><li> Dolgu 18M Ωcm de-iyonize su (su, 10-20 ml), kapak ile tekne tartmak ve fazla alkil amonyum bromür tuzları ve HBr kaldırmak için 12-24 saat suda bekletiniz. </li><li&gt; suyu (ya da pipet) dökün ve tepsiyi her zaman doldurmak için yeterli DI su ile 3 kez yıkayın. Bu adım esnasında polimer filmin herhangi bir kaybetmemek için dikkatli olun. </li><li> Polimer Bu noktada tamamen kuruduktan sonra ortaya oturmak tartım tepsisi İzin, polimer açık ve biraz kırılgan plastik film olmalıdır. Hava çok rutubetli Yine, bir nem-zamanında buharlaşma tamamlamak için gerekli olabilir. </li><li> Spatula kullanarak, dikkatli bir şekilde tartım tepsiden kurutulmuş filmi çıkarın ve temiz bir cam şişeye aktarın. </li><li> 2 mL etanol ve 3 seramik karıştırma boncukları ve 4 saat boyunca vorteks eklemek veya polimer filmi tamamen yeniden süspanse kadar. </li></ol> 2. Aktivite Tahliller için TBAB-Modifiye Nafion içine Enzimlerin immobilizasyonu <ol><li> Kuru bir enzim, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine enzim 1-10 mg tarttın, ve bir 1-10 mg / ml enzim çözeltisi oluşturmak için 100 mM pH 7 fosfat tampon 1 ml ilave edilir. For çözelti içinde bir enzim, protein miktarını belirlemek için, bir bicinchoninic asit (BCA) test 13 kullanmak ve 1-10 mg / mL kadar protein konsantrasyonu getirmek için 100 mM fosfat tampon maddesi ile uygun bir miktarda ilave edin. 1-10 mg / mL, genellikle 1-50 nanomol / mL &#39;ye karşılık gelir. </li><li> 1 mg / ml enzim çözeltisinin 120 uL için, 10 saniye için 60 alkil amonyum ile modifiye Nafion ® çözeltisi ile uL, ve girdap ekleyebilir. (Bu karışım çoğaltır büyük sayılar için kadar ölçeklendirilebilir. 2:1 enzim-to-polimer çözeltisi oranı tutun.) </li><li> Pipet 60 3 ayrı 1 cm 2 cuvettes dibine enzim / polimer çözüm uL, ve geceleme kurumasını bekleyin. </li></ol> 3. İmmobilize NAD-bağımlı Dehidrogenaz Enzim Testi <ol><li> Küvetine, 50 mM sodyum pirofosfat (pH 8.8) ve 1.3 mL, 15 mM NAD (taze hazırlanmış) ve 1,5 mL ve 0,1 mL su ilave edilir. </li><li> UV / Vis spektrofotometre (yani ThermoScientific Evolut de küvet koyuniyon 260 Bio ve Thermo Spectronic Genesys 20) 340 nm dalga boyunda ayarlanmış. </li><li> Spektrometre sıfır, ve daha sonra 0.1 ml etanol ilave edin. Hafifçe 5 kez aşağı çözümü pipetleme tarafından reaktifleri karıştırın. Boş için ek su 0,1 ml yerine etanol 0,1 ml kullanın. </li><li> Reaktifler sonra küvet ve 20 dakika sonra ilave edildi 5 dakikada 340 nm&#39;de absorbans kaydediniz. Aktivite hesaplamalar için kullanılabilecek bir eğim elde etmek için iki veri noktaları çizilir. </li></ol> 4. İmmobilize PQQ-Bağımlı dehidrogenazlar miktar tayini <ol><li> Küvet için, sodyum fosfat 1.5 mL (pH 7.3) ve 600 mM PMS 200 ul ekleyin. </li><li> 600 nm dalga boyunda ayarlanmış bir UV / Vis spektrofotometre içinde küvet yerleştirin ve sonra spektrometre sıfıra. </li><li> 700 uL DCIP 100 uL ve faiz substrat (etanol, asetaldehit, gliserol, glikoz veya gliseraldehit) 200 uL ekleyin ve hafifçe solut pipetleme tarafından reaktifler karıştırıniyon aşağı yukarı 5 kez. Boş için 200 su uL yerine ilgi substrat kullanın. </li><li> Reaktifler sonra küvet ve 20 dakika sonra ilave edildi 5 dakikada 600 nm&#39;de absorbans kaydediniz. </li></ol> 5.. İmmobilize Glukoz Oksidaz miktar tayini <ol><li> Küvetine, 0.2 M, p-hidroksibenzoik asit,% 0.02 (w / v) sodyum azid, 128 U peroksidaz, 4-aminoantipirin 0.3 mM, 1 M potasyum fosfat, ve 50 mM glukoz ihtiva eden bir çözeltiden 2.0 ml ilave edilir. 5 kez aşağı yukarı pipetleme tarafından çözüm karıştırın. </li><li> 510 nm dalga boyunda bir UV / Vis spektrofotometre sette küvet yerleştirin. </li><li> Reaktifler sonra 20 dakika küvet içinde tekrar ilave edilmiştir sonra 5 dakika 510 nm&#39;de absorbans kaydediniz. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Modifiye Nafion polimerin micellar yapısı orijinal tuzu / polimer co-döküm filmin çok Haldun&#39;un kurutularak bozulabilmektedirt. Şekil 2 doğru şeffaf, açık kahverengi bir tabakaya yolaçan kurutulmuş olan bir tuzu / polimer karışımı gösterir. Kurur çok hızlı kurutma işlemi misel yapısı tahrip etme nedeni polimer opak, beyaz pul neden olabilir bir film. Modifiye Nafion polimer ve enzim karıştırılır ve bir küvet alt üzerinde eş-atılmıştır sonra, enzimatik testler aktivitesi polimer filmi içinde enzim stabilite değerlendirmek için kullanılabilir. Tablolar iki dehidrogenaz enzimlerin 2-4 kez deneyi sonuçları ve glukoz oksidaz sırasıyla çeşitli modifiye Nafion filmlerinde immobilize. Modifiye Nafion polimerler, aslında, belirli enzimler (superactivity olarak adlandırılır) aktivitesi artırabilir gösteren, tampon çözeltisi içinde enzimlerin vs immobilize edilen enzimler daha yüksek aktivite not edin. Diğer enzimler polimer onları hareketsiz zaman kendi özel aktivite azaltmak ulaşım sınırlamaları vardır (olan yüzeyler) oldukça büyük makromoleküller yani selülazlar ve amilazlar. <table border="1"><tbody><tr><td> Kullanılan kuaterner amonyum tuzu </td><td> 3 kat daha fazla </td></tr><tr><td> T3a (tetrapropylammonium bromür) </td><td> 32,37 mg / ml </td></tr><tr><td> TBAB (tetrabutilamonyum bromür) </td><td> 39,19 mg / ml </td></tr><tr><td> TPAB (tetrapentylammonium bromür) </td><td> 46,01 mg / ml </td></tr><tr><td> TEHA (triethylhexylammonium bromür) </td><td> 32,37 mg / ml </td></tr><tr><td> TMHA (trimethylhexylammonium bromür) </td><td> 27.25 mg / ml </td></tr><tr><td> TMOA (trimethyloctylammonium bromür) </td><td> 30,66 mg / ml </td></tr><tr><td> TMDA (trimethyldecylammonium bromür) </td><td> 34.07 mg / ml </td></tr><tr><td> TMDDA (trimethyldodecylammonium bromür) </td><td> 37.48 mg / ml </td></tr><tr><td> TMTDA (trimethyltetradecylammonium bromür) </td><td&gt; 40,89 mg / ml </td></tr><tr><td> TMHDA (trimethylhexadecylammonium bromür) </td><td> 44,31 mg / ml </td></tr><tr><td> TMODA (trimethyloctadecylammonium bromür) </td><td> 47,71 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Tetra-alkil amonyum tuzları edilmiştir Nafion polimer modifikasyonu için kullanımı. <table border="1"><tbody><tr><td> Nafion Tipi </td><td> Enzim aktivitesi (U / g) </td></tr><tr><td> Tampon (hayır polimer) </td><td> 16.63 ± 8.11 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 9.25 ± 2.21 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 3.23 ± 2.92 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 3.93 ± 3.33 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 4.19 ± 1.04 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 3.51 ± 1.11 </td></tr><tr><td> TMDA </td><td> 8.00 ± 4.53 </td></tr><tr><td> TMHA </td><td> 1.68 ± 1.39 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 4.83 ± 0.99 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 10.45 ± 3.20 </td></tr></tbody></table> Tablo 2 seçilen modifiye Nafion polimerler (not: immobilize aktivitesi enzim başlangıç ​​spesifik aktivite bir fonksiyonudur) immobilize NAD-bağımlı glukoz dehidrogenaz aktivitesi.. <table border="1"><tbody><tr><td> Nafion Tipi </td><td> Enzim aktivitesi (mU / g) </td></tr><tr><td> Tampon (hayır polimer) </td><td> 7.18 ± 0.51 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 70.1 ± 0.5 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 133 ± 6 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 244 ± 4 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 221 ± 6 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 1.78 ± 0.63 </td></tr><tr><td> TMDA </td><td> 206 ±5 </td></tr><tr><td> TEHA </td><td> 40.1 ± 50.6 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 0 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 1.45 ± 0.06 </td></tr></tbody></table> Tablo 3 PQQ-glukoz dehidrogenaz bağımlı aktivitesi seçilen modifiye Nafion polimerler (not: immobilize aktivitesi enzim başlangıç ​​spesifik aktivite bir fonksiyonudur) immobilize.. <table border="1"><tbody><tr><td> Nafion Tipi </td><td> Enzim aktivitesi (U / g) </td></tr><tr><td> Tampon (hayır polimer) </td><td> 103,61 ± 3.15 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 19.93 ± 10.10 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 247,25 ± 12.49 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 152,27 ± 5.29 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 262,05 ± 6.26 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 129,18 ± 2.31 </td></tr&gt; <tr><td> TMDA </td><td> 141,23 ± 1.97 </td></tr><tr><td> TMHA </td><td> 131,75 ± 2.89 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 132,50 ± 1.18 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 136,50 ± 0.96 </td></tr></tbody></table> . Tablo 4 Temsilcisi glukoz oksidaz spesifik aktivite seçilen modifiye Nafion polimerler (: immobilize enzim aktivitesi ilk spesifik aktivitelerinin bir fonksiyonudur not) immobilize. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig1.jpg" /> Şekil 1. Nafion polimer ve enzim immobilizasyonu daha sonraki kullanıma TBAB şirketleşme şematik. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig2.jpg" /> Şekil 2. Nafion ve TBAB ilk co-döküm filmlerin optik fotoğraf. Verimleri bo kapsayan şeffaf, açık kahverengi film kurutma Yavaştartım tepsi ttom.

<ol><li>Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+biofuel+cells+for+implantable+and+microscale+devices+Chem%5BTitle%5D)+AND+%22Rev%22%5BJournal%5D)">Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem.</a> Rev. 104, 4867-4886 (2004).</li>
<li>Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+as+Working+or+Inspirational+Electrocatalysts+for+Fuel+Cells+and+Electrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrolysis.</a> Chem. Rev. 108, 2439-2461 (2008).</li>
<li>Minteer, S. D., Liaw, B. Y., Cooney, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Based+Biofuel+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Based Biofuel Cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 18, 228-234 (2007).</li>
<li>Callahan, J. W., Kosicki, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Lipid+Micelles+on+Mitochondrial+Malate+Dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Lipid Micelles on Mitochondrial Malate Dehydrogenase.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 45, 839-851 (1967).</li>
<li>Martinek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+Membrane+Environment+of+Enzymes%3A+Superactivity+of+Laccase+Entrapped+into+Surfactant+Reversed+Micelles+in+Organic+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biokhimiya%22%5BJournal%5D)">Modeling of the Membrane Environment of Enzymes: Superactivity of Laccase Entrapped into Surfactant Reversed Micelles in Organic Solvents.</a> Biokhimiya. 53, 1013-1016 (1988).</li>
<li>Moore, C. M., Akers, N. L., Hill, A. D., Johnson, Z. C., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+Environment+for+Immobilized+Dehydrogenase+Enzymes+by+Modifying+Nafion+with+Tetraalkylammonium+Bromides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides.</a> Biomacromolecules. 5, 1241-1247 (2004).</li>
<li>Schrenk, M. J., Villigram, R. E., Torrence, N. J., Brancato, S. J., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mixture+Casting+Nafion+with+Quaternary+Ammonium+Bromide+Salts+on+the+Ion-Exchange+Capacity+and+Mass+Transport+in+the+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of Mixture Casting Nafion with Quaternary Ammonium Bromide Salts on the Ion-Exchange Capacity and Mass Transport in the Membranes.</a> J. Membr. Sci. 205, 3-10 (2002).</li>
<li>Akers, N. L., Moore, C. M., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Alcohol%2FO2+Biofuel+Cells+Using+Salt-Extracted+Tetrabutylammonium+Bromide%2FNafion+Membranes+to+Immobilize+Dehydrogenase+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of Alcohol/O2 Biofuel Cells Using Salt-Extracted Tetrabutylammonium Bromide/Nafion Membranes to Immobilize Dehydrogenase Enzymes.</a> Electrochim. Acta. 50, 2521-2525 (2005).</li>
<li>Sokic-Lazic, D., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citric+Acid+Cycle+Biomimic+on+a+Carbon+Electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Citric Acid Cycle Biomimic on a Carbon Electrode.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 939-944 (2008).</li>
<li>Arechederra, R. L., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Oxidation+of+Glycerol+in+an+Enzymatic+Biofuel+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Fuel+Cells%22%5BJournal%5D)">Complete Oxidation of Glycerol in an Enzymatic Biofuel Cell.</a> Fuel Cells. 9, 63-69 (2009).</li>
<li>Germain, M., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroaromatic+Actuation+of+Mitochondrial+Bioelectrocatalysis+for+Self-Powered+Explosive+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nitroaromatic Actuation of Mitochondrial Bioelectrocatalysis for Self-Powered Explosive Sensors.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 15272-15273 (2008).</li>
<li>Addo, P. K., Arechederra, R. L., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Enzyme+Cascades+for+Methanol%2FAir+Biofuel+Cells+Based+On+NAD%2B-Dependent+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Evaluating Enzyme Cascades for Methanol/Air Biofuel Cells Based On NAD+-Dependent Enzymes.</a> Electroanalysis. 22, 807-812 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Açıklanan prosedür içinde, tetra-alkil amonyum tuzları enzimler hareketsiz ve stabilize etmek için kullanılabilir micellar polimerler oluşturmak için ticari Nafion değiştirmek için kullanılır. Testler polimer aktivitesi yüksek bir tutma ile enzimler çeşitli immobilize etmek için kullanılan bir prosedürü göstermektedir tarif. Söz konusu enzimi çok düşük bir aktiviteye sahiptir veya saf olmayan ise, daha yüksek bir konsantrasyonu gerekli olabilir ve 10 mg / ml &#39;den daha büyük konsantrasyonda enzimler hareketsizleştiri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Nafion </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 70160 </td></tr><tr><td> Tetra alkilamonyum bromit tuzlarıdır </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Alkol dehidrogenaz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3263 </td></tr><tr><td> Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) </td><td> Simga-Aldrich </td><td> N7004 </td></tr><tr><td> Sodyum pirofosfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8010 </td></tr><tr><td> Fenazin methosulfate (PMS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9625 </td></tr><tr><td> 2,6-Dichloroindophenol (DCIP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1878 </td></tr><tr><td> Glukoz oksidaz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7141 </td></tr><tr><td> 4-hidroksibenzoik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 240141 </td></tr><tr><td> Sodyum azid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8032 </td></tr><tr><td> Peroksidaz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8375 </td></tr><tr><td> 4-aminoantipirin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 06800 </td></tr><tr><td> UV / Vis Spektrofotometre </td><td> Thermo </td><td> Evrim 260 Bio ya Spectronic Genesys 20 </td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Analitik terazi </td><td></td><td></td></tr></tbody></table&gt;

enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik tuz-modifiye nafion

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Son on yılda, biyokataliz, biyosensörler ve biyo yakıt pilleri de dahil olmak üzere tutuklanmış ve stabilize enzimleri için uygulama bir zenginlik olmuştur. En bioelectrochemical uygulamalarda 1-3, enzim veya organel bir çeşit kullanımı ile bir elektrot yüzeyine immobilize edilir polimer. Bu polimer iskele enzimler stabil tutmak ve matriks dışında molekül ve iyonları basit difüzyon için izin vermelidir. Immobilizasyon bu tür polimerler için kullanılan en poliaminler ya polialkollerdir dayanmaktadır - bunlar, hidrojen veya iyonik bağ yoluyla enzim saklanması ve stabilize bu enzimin doğal ortamda taklit eden polimerler. Enzimlerin stabilitesi için başka bir yöntem enzimler saklanması ve stabilize hidrofobik bölgeler içermesi miseller, kullanımını içerir. Özellikle 4,5, Minteer grubu, piyasada bulunan Nafion dayanan bir micellar polimer geliştirmiştir. 6,7 Nafionkendisi proton ve diğer küçük katyonlar arasında kanalı-assisted difüzyonu için izin veren bir micellar polimer, fakat miselleri ve kanallar son derece küçük olduğu ve polimer enzim harekersizliği için elverişsiz olduğu sülfonik asit yan zincirleri, nedeniyle çok asittir. Bununla birlikte, bu tür Nafion tetrabutilamonyum bromür (TBAB) gibi hidrofobik alkil amonyum tuzları bir fazlası ile karıştırıldığı zaman, kuaterner amonyum katyonları ve proton yerine polimer yan zincirleri (Şekil 1) üzerine sülfonat gruplarına karşı iyonların hale gelir. Böyle nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) gibi enzimatik işlevi için gerekli olan geniş bir substrat ve iyon difüzyonu için izin vermek polimer içindeki büyük miselleri ve kanalları ile sonuçlanır. Bu modifiye Nafion polimer biyosensör ve biyo hücreleri kullanılmak üzere pek çok değişik enzim türleri gibi mitokondri immobilize etmek için kullanılmaktadır. 8-12 Bu kağıt Bu mikrofon yapmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadırenzimler stabilize ellar polimer enzim immobilizasyon membran. Misel enzim immobilizasyon membran, membran içindeki enzimler immobilizing için prosedür ve immobilize enzimin enzim spesifik aktivitesi eğitimi için tahlillerin sentezi aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Bu makale, hidrofobik olarak modifiye edilmiş Nafion enzim immobilizasyon membranı ve nasıl membran içindeki protein ve / veya enzim hareketsiz ve spesifik aktivite için test etmek için sentez prosedürü tarif edecektir.

Enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik Tuz-modifiye Nafion

Son on yılda; biyokataliz, biyosensörler ve biyoyakıtlar da dahil olmak üzere, immobilize edilmiş ve stabilize edilmiş enzimlerin uygulama alanları oldukça zenginleşmiştir...

Bu prosedürün genel amacı, hücre içi enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için bir polimer sentezlemektir. Bunu gerçekleştirmek için öncelikle, nafion süspansiyonunu cheal amonyum bromür tuzu ile birleştirin ve nafionun protonlanmış formunu amonyum tuzları ile değiştirmek için karışımı vorteksleyin. İkinci adım, karışımı bir tartım kabına dökerek ve çözücülerin buharlaşmasını sağlayarak sonuçta oluşan polimeri kurutmaktır.Ardından, fazla tuzu uzaklaştırmak için polimeri deiyonize suda 12 ila 24 saat boyunca bekletin. Tuz ekstraksiyonunun ardından, polimeri suyla durulayın ve ardından polimerin evaporasyon yoluyla tamamen kurumasını sağlayın. Son adım, polimeri temiz bir tüpe aktarmak ve enzim immobilizasyonunda kullanmak üzere çözücü içinde yeniden süspande etmektir. Nihayetinde, bu hücre içi enzim immobilizasyon polimeri, aktivite analizlerinde enzimlerin stabilitesini artırmak için kullanılır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, prosedür son derece basit göründüğü için zorlanacaklardır; ancak kurutma prosedürü, fonksiyonel bir polimerin üretimi için kritiktir. Prosedürün uygulaması, laboratuvarımdaki bir lisansüstü öğrenci tarafından gösterilecektir. Nafion'un Nerium amonyum tuzları ile modifikasyonu prosedürüne başlamak için, nafion polimerindeki sülfonik asit gruplarına kıyasla üç kat molar fazlalıkta alkil amonyum bromür tuzu ölçün.Alk amonyum bromür tuzunu cam bir viyale hızlıca aktarın. Nafion'un çözelti içinde homojen bir şekilde süspande olduğundan emin olmak için %5 ağırlık/hacim oranındaki nafion süspansiyon şişesini yaklaşık 30 saniye boyunca çalkalayın. Yeniden süspande edilen nafiondan iki mililitre pipetle çekin ve AGU amonyum bromür tuzu içeren cam viyale ekleyin.Viyalı 900 RPM'de 10 ila 15 dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, viskoz çözeltiyi plastik bir tartım kabına dökün ve viyalde kalan artık çözeltiyi bir pipet yardımıyla tartım kabına aktarın. Bu örnekte, çözücülerin tartım kabından tamamen uçması için tartım kabı kısmen kapatılmış ve altı saatten fazla sürecek bir buharlaşma hızında gerçekleşmesi amacıyla laboratuvar tezgahında bırakılmıştır.Tüm çözücünün uygun buharlaşma hızında tamamen buharlaşması, burada gösterildiği gibi tartım kabının dibinde sarı veya kahverengi şeffaf bir film tabakası bırakmalıdır. Çözücü çok hızlı buharlaşırsa, şeffaf bir film yerine polimerin misel hücresel yapısının bozulduğunu gösteren kabuksu veya kristal yapılı bir materyal oluşacaktır. Çözücü buharlaşması çok yavaş olursa veya amonyum tuzunun çok uzun süre reaksiyona girmesine ve çok fazla su buharı tutmasına izin verilirse, ya yapışkan turuncu bir jel ya da beyaz kristal yapılı bir materyal oluşacaktır.Her iki durumda da prosedür yeniden başlatılmalıdır. Tüm solvent uygun buharlaşma hızında buharlaştıktan sonra, tartım tepsisini 10 ila 20 mililitre 18 mega ohm santimetre deiyonize su ile doldurup üzerini kapatın ve fazla alkil amonyum bromür tuzlarını ve HBR'yi uzaklaştırmak için 12 ila 24 saat boyunca bekletin. 12 ila 24 saat sonra, suyu pipetle çekin ve tepsiyi dolduracak kadar deiyonize su ekleyin. Polimer filmin herhangi bir kısmının kaybını önlemek için pipetleme işlemini her zaman filmden uzağa doğru yapmaya dikkat edin.Durulama işlemlerinden sonra toplam üç kez durulayın. Polimer tamamen kuruyana kadar tartım kabını ağzı açık şekilde bekletin. Tamamen kuruduğunda, polimer şeffaf ve biraz kırılgan bir plastik film şeklinde olmalıdır.Buna karşılık, düzgün kurutulmamış polimerlerin, burada gösterildiği gibi tuz ekstraksiyonundan sonra çok farklı bir görünümü olacaktır. Kurumuş filmi bir spatula yardımıyla tartım kabından dikkatlice çıkarın ve temiz bir cam şişeye aktarın. İki mililitre etanol ve üç adet seramik karıştırma boncuğu ekleyip, polimer film tamamen yeniden süspanse olana kadar veya dört saat boyunca vorteksleyin.Alkil amonyum modifiyeli nathe on çözeltisi artık enzim immobilizasyonu için kullanıma hazırdır. İmmobilize edilecek enzim kuru formdaysa, bir mikro santrifüj tüpüne 1 mg enzim tartın ve 1 mg/mL enzim çözeltisi oluşturmak için 1 mL 100 mM pH 7 fosfat tamponu ekleyin. 1 mg/mL'lik enzim çözeltisinden 120 µL'yi yeni bir tüpe aktarın.60 µL ALK amonyum modifiyeli nafion çözeltisi ekleyin ve 10 saniye boyunca vorteksleyin. Eğer bu karışımın yüksek sayıda tekrar için ölçeği artırılacaksa, enzim ile polimer çözeltisi oranı ikiye bir olarak tutulmalıdır. Son olarak, enzim polimer çözeltisinden 60 µL'yi üç ayrı bir santimetrekarelik küvetin her birinin tabanına pipetleyin ve gece boyunca kurumaya bırakın.Polimer film içindeki enzimin stabilitesi, gösterildiği üzere enzimatik aktivite analizleri ile değerlendirilebilir. Bu analize başlamak için, modifiye nafion polimeri ve NAD bağımlı dehidrogenaz enzimi ile döküm yapılmış küvete şu reaktifleri ekleyin: 1,3 ml 50 mM sodyum pirofosfat, 1,5 ml taze hazırlanmış 15 mM nikotinamid adenin dinükleotit veya NAD ve 0,1 ml su.Küveti, 340 nanometre dalga boyuna ayarlanmış bir UV-görünür bölge spektrofotometresine yerleştirin ve cihazı sıfırlayın. Spektrometre küvetine 0,1 mililitre etanol ekleyin ve çözeltiyile pipetle beş kez nazikçe çekip bırakarak reaktifleri karıştırın; kör örnek için 0,1 mililitre etanol yerine ek su kullanın. Reaktifler küvete eklendikten beş dakika sonra, 340 nanometredeki absorbansı kaydedin.Reaktifler qve'ye eklendikten 20 dakika sonra absorbansı tekrar kaydedin; immobilize edilmiş pq'nun enzimatik spesifik aktivitesini belirlemek için aktivite hesaplamalarında kullanılabilecek bir eğim elde etmek amacıyla bu iki veri noktası grafikleştirilecektir. Bağımlı dehidrogenazlar, modifiye nafion polimeri ve PQQ bağımlı dehidrogenaz ile birlikte dökülmüş olan qve içine şu reaktifleri pipetleyin: 1,5 mililitre sodyum fosfat ve 200 mikrolitre 600 mikromolar pH metilsülfat veya PMS.Küveti 600 nanometre dalga boyuna ayarlanmış bir UV- görünür bölge spektrofotometresine yerleştirin ve sıfırlayın. Spektrometrenin yanına, boş örnek için 700 µL 2,6-diklorofenol indofenol (DCIP) ile 200 µL ilgili substratın karışımından 100 µL ekleyin. Reaktifleri, çözeltiyi pipetle beş kez nazikçe çekip bırakarak karıştırın.İlgili substrat yerine 200 µL su kullanın. Reaktifler eklendikten beş dakika sonra, 600 nm'deki absorbansı kaydedin.Bu analize başlamak için reaktifleri ekledikten 20 dakika sonra absorbansı tekrar kaydedin. Modifiye nafion polimeri ve glukoz oksidaz ile birlikte dökülmüş Q VET'e şunları içeren 2 mL'lik bir çözelti ekleyin: 0,2 molar para hidroksibenzoik asit, %0,02 sodyum azid, 128 ünite peroksidaz, 0,3 milimolar 4-aminoantipirin, 1 molar potasyum fosfat ve 50 milimolar glukoz.Beş kez pipetleyerek çözeltiyi hazırlayın. Cuvette'i 510 nanometre dalga boyuna ayarlanmış bir UV-görünür spektrofotometreye yerleştirin. Reaktifler cuvette eklendikten beş dakika sonra.510 nanometredeki absorbansı kaydedin. Ardından, reaktiflerin eklenmesinden 20 dakika sonra absorbansı tekrar kaydedin. Bu tablo, immobilize edilmiş ve seçilmiş modifiye nafion polimerlerinin NAD bağımlı glikoz dehidrogenaz aktivitesi analiz sonuçlarını göstermektedir.İmmobilize edilmiş NAD bağımlı glukoz dehidrogenazın, enzim ve tampon çözeltiden daha düşük spesifik aktiviteye sahip olduğu gözlemlenmiştir. Bunun nedeni, polimer membranların büyük moleküllerin taşınımını azaltmasıdır; analiz için substrat olan glukoz küçük olsa da, ko-enzim NAD'ın membrandan içeri ve dışarı difüze olması gerekir. NAD bağımlı dehidrogenaz için, polimer içindeki immobilizasyondan kaynaklanan taşınım kısıtlaması, gözlemlenen enzimatik aktiviteyi düşürmektedir.Sıradaki tablo, immobilize edilmiş ve seçilmiş modifiye nafion polimerlerinin PQQ bağımlı glikoz dehidrogenaz aktivitesine ilişkin analiz sonuçlarını göstermektedir. Burada, çoğu nafion film üzerine immobilize edilen enzimlerin, enzim ve tampon çözeltiye kıyasla daha yüksek aktivite sergilediğini belirtmek önemlidir. PQQ bağımlı glikoz dehidrogenaz membranla ilişkili bir protein olduğundan, hidrofobik modifiye miseller nafion, aktif PQQ bağımlı glikoz dehidrogenazı stabilize etmek için tampona göre membrana daha benzer bir ortam sağlayarak enzimin aktivitesini artırır.Son olarak, glukoz oksidaz spesifik aktivitesinin temsili analiz sonuçları verilmiştir. İmmobilize edilmiş ve seçilmiş modifiye nafion polimerleri bu tabloda gösterilmektedir. Her bir polimerin üç enzimin her biriyle yapılan enzimatik analizleri, serbest enzime ve solüsyona kıyasla göreli spesifik aktivitedeki eğilimlerin, enzim sisteminin bir fonksiyonu olduğunu göstermektedir.Sonuç olarak, her enzim için gereken kesin polimerin optimize edilmesi gerekir. Bu prosedürü uygularken, kurutma adımının bu özel işlem için kritik olduğunu unutmamak önemlidir.

hydrophobic-salt-modified-nafion-for-enzyme-immobilization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bir bölünmüş intein aracılı protein hidrojel sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein kopolimerleridir. İki protein kopolimerlerinin Karıştırma bir hidrojel halinde kendi kendine birarada monte edilmiş bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-ekleme reaksiyonunu tetikler. Bu hidrojel yüksek pH ve sıcaklık-stabil, organik solventler ile uyumlu ve...

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

Hücre yapışkanlığı, biyomalzeme araştırmaları ve doku mühendisliğindeki birçok yaklaşımın anahtarıdır. Peptitler ile önemli polimer PTFE'nin yüzey modifikasyonu için ıslak kimya kullanılarak adım adım bir teknik sunulmaktadır.

Geliştirilmiş Hücre yapışma Politetrafloroetilen Islak Kimya ve Peptit İmmobilizasyonu

Bu makale, bağımsız filmlerde ve emprenye edilmiş membranlarda hidrojeller hazırlamak ve su taşıma özellikleri de dahil olmak üzere fiziksel özelliklerini karakterize etmek için pratik yöntemleri bildirmektedir.

Su Arıtma Membranlar olarak Zehirli Özelliklere Sahip Hidrojeller Sentezi

Hızlı ve iyon-seçici tuzdan arındırma radyoaktif iyot birkaç sulu çözümler için verimli bir yöntem altın nano tanecikleri immobilize selüloz asetat Membran filtreler kullanılarak tanımlanır.

Radyoaktif iyot anyon altın nano tanecikleri gömülü membran filtre kullanarak, seçici tuzdan arındırma için verimli bir yöntem

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Geniş bir değiştirilmemiş gözenekli üzerinde intergrown, polikristalin metal organik framework zarları sentezi için basit, tekrarlanabilir ve çok yönlü bir yaklaşım ve gözenekli olmayan destekler sunulmaktadır.

Elektroforetik kristalizasyon Ultrathin yüksek performanslı Metal organik Framework membranlar

Flash NanoPrecipitation (FNP) polimer çekirdek-kabuk nano tanecikleri üretmek için ölçeklenebilir bir yaklaşımdır. Laboratuvar ölçekli formülasyonları hidrofobik veya hidrofilik therapeutics Kapsülleme için açıklanmıştır.

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

Fumarilasetoasetik hidrolaz etki alanı içeren proteinlerin ifade ve arıtma örnekleri ( E. coli, FPLC ifadesi) ile açıklanmıştır. Arıtılmış proteinler kristalizasyon ve antikor üretimi için kullanılır ve enzim asdında istihdam edilir. Seçilen fotometrik asdalar, oxaloasetat dekarboksilaz ve acylpyruvate hydrolase olarak FAHD1 Multi-functionality görüntülemek için sunulmaktadır.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Bu çalışmada nanopartikül karakterizasyonu takip nanoliposome hazırlık için ince lipid film yöntemi kullanılarak klasik hidrasyon açıklanır. A 47 kDa-hidrofilik ve küresel protein, tarin, başarıyla istikrarı artırmak için bir strateji olarak kapsüllenir, hızlı açıklık önlemek, ve kontrollü salınımı teşvik. Bu yöntem hidrofobik moleküllerkapsülasyonuna adapte edilebilir.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Bu çalışma, membran proteini TWIK ile ilişkili asite duyarlı K+ kanal 2'nin (Görev 2) nanodisklere yeniden yapılandırılması prosedürünü özetlemektedir. Başarılı montaj, iyi tanımlanmış iki boyutlu sınıf ortalamaları elde eden tek parçacıklı kriyoelektron mikroskopi ile doğrulandı.

Nanodisklerde Membran Proteinlerini Stabilize Etme Tekniği

Bu protokol, sürdürülebilir metal-organik çerçeve/polimer karışık matriks zarlarının üretimi için tekrarlanabilir bir metodolojiyi ve elektrokimyasal empedans spektroskopisi kullanılarak değişken sıcaklık ve nem altında düzlem içi proton iletkenliğinin doğru ölçülmesini açıklar; bu yöntem proton değişim membran yakıt hücreleri (PEMFC) için faydalı olabilir.

Elektrokimyasal empedans spektroskopisiyle MOF tabanlı karışık matriks zarlarında proton iletkenliğinin ölçülmesi

Keşfedin enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik tuz-modifiye Nafion membran sentezi. Bu yöntem, enzim aktivite testlerinde kararlılığı artırarak biyokimyasal uygulamalarda verimliliği yükseltir.

Enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik Tuz-modifiye Nafion

Daha fazla video keşfet