Enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için hidrofobik Tuz-modifiye Nafion

Bu prosedürün genel amacı, hücre içi enzim immobilizasyonu ve stabilizasyonu için bir polimer sentezlemektir. Bunu gerçekleştirmek için öncelikle, nafion süspansiyonunu cheal amonyum bromür tuzu ile birleştirin ve nafionun protonlanmış formunu amonyum tuzları ile değiştirmek için karışımı vorteksleyin. İkinci adım, karışımı bir tartım kabına dökerek ve çözücülerin buharlaşmasını sağlayarak sonuçta oluşan polimeri kurutmaktır.

Ardından, fazla tuzu uzaklaştırmak için polimeri deiyonize suda 12 ila 24 saat boyunca bekletin. Tuz ekstraksiyonunun ardından, polimeri suyla durulayın ve ardından polimerin evaporasyon yoluyla tamamen kurumasını sağlayın. Son adım, polimeri temiz bir tüpe aktarmak ve enzim immobilizasyonunda kullanmak üzere çözücü içinde yeniden süspande etmektir. Nihayetinde, bu hücre içi enzim immobilizasyon polimeri, aktivite analizlerinde enzimlerin stabilitesini artırmak için kullanılır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, prosedür son derece basit göründüğü için zorlanacaklardır; ancak kurutma prosedürü, fonksiyonel bir polimerin üretimi için kritiktir. Prosedürün uygulaması, laboratuvarımdaki bir lisansüstü öğrenci tarafından gösterilecektir. Nafion'un Nerium amonyum tuzları ile modifikasyonu prosedürüne başlamak için, nafion polimerindeki sülfonik asit gruplarına kıyasla üç kat molar fazlalıkta alkil amonyum bromür tuzu ölçün.

Alk amonyum bromür tuzunu cam bir viyale hızlıca aktarın. Nafion'un çözelti içinde homojen bir şekilde süspande olduğundan emin olmak için %5 ağırlık/hacim oranındaki nafion süspansiyon şişesini yaklaşık 30 saniye boyunca çalkalayın. Yeniden süspande edilen nafiondan iki mililitre pipetle çekin ve AGU amonyum bromür tuzu içeren cam viyale ekleyin.

Viyalı 900 RPM'de 10 ila 15 dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, viskoz çözeltiyi plastik bir tartım kabına dökün ve viyalde kalan artık çözeltiyi bir pipet yardımıyla tartım kabına aktarın. Bu örnekte, çözücülerin tartım kabından tamamen uçması için tartım kabı kısmen kapatılmış ve altı saatten fazla sürecek bir buharlaşma hızında gerçekleşmesi amacıyla laboratuvar tezgahında bırakılmıştır.

Tüm çözücünün uygun buharlaşma hızında tamamen buharlaşması, burada gösterildiği gibi tartım kabının dibinde sarı veya kahverengi şeffaf bir film tabakası bırakmalıdır. Çözücü çok hızlı buharlaşırsa, şeffaf bir film yerine polimerin misel hücresel yapısının bozulduğunu gösteren kabuksu veya kristal yapılı bir materyal oluşacaktır. Çözücü buharlaşması çok yavaş olursa veya amonyum tuzunun çok uzun süre reaksiyona girmesine ve çok fazla su buharı tutmasına izin verilirse, ya yapışkan turuncu bir jel ya da beyaz kristal yapılı bir materyal oluşacaktır.

Her iki durumda da prosedür yeniden başlatılmalıdır. Tüm solvent uygun buharlaşma hızında buharlaştıktan sonra, tartım tepsisini 10 ila 20 mililitre 18 mega ohm santimetre deiyonize su ile doldurup üzerini kapatın ve fazla alkil amonyum bromür tuzlarını ve HBR'yi uzaklaştırmak için 12 ila 24 saat boyunca bekletin. 12 ila 24 saat sonra, suyu pipetle çekin ve tepsiyi dolduracak kadar deiyonize su ekleyin. Polimer filmin herhangi bir kısmının kaybını önlemek için pipetleme işlemini her zaman filmden uzağa doğru yapmaya dikkat edin.

Durulama işlemlerinden sonra toplam üç kez durulayın. Polimer tamamen kuruyana kadar tartım kabını ağzı açık şekilde bekletin. Tamamen kuruduğunda, polimer şeffaf ve biraz kırılgan bir plastik film şeklinde olmalıdır.

Buna karşılık, düzgün kurutulmamış polimerlerin, burada gösterildiği gibi tuz ekstraksiyonundan sonra çok farklı bir görünümü olacaktır. Kurumuş filmi bir spatula yardımıyla tartım kabından dikkatlice çıkarın ve temiz bir cam şişeye aktarın. İki mililitre etanol ve üç adet seramik karıştırma boncuğu ekleyip, polimer film tamamen yeniden süspanse olana kadar veya dört saat boyunca vorteksleyin.

Alkil amonyum modifiyeli nathe on çözeltisi artık enzim immobilizasyonu için kullanıma hazırdır. İmmobilize edilecek enzim kuru formdaysa, bir mikro santrifüj tüpüne 1 mg enzim tartın ve 1 mg/mL enzim çözeltisi oluşturmak için 1 mL 100 mM pH 7 fosfat tamponu ekleyin. 1 mg/mL'lik enzim çözeltisinden 120 µL'yi yeni bir tüpe aktarın.

60 µL ALK amonyum modifiyeli nafion çözeltisi ekleyin ve 10 saniye boyunca vorteksleyin. Eğer bu karışımın yüksek sayıda tekrar için ölçeği artırılacaksa, enzim ile polimer çözeltisi oranı ikiye bir olarak tutulmalıdır. Son olarak, enzim polimer çözeltisinden 60 µL'yi üç ayrı bir santimetrekarelik küvetin her birinin tabanına pipetleyin ve gece boyunca kurumaya bırakın.

Polimer film içindeki enzimin stabilitesi, gösterildiği üzere enzimatik aktivite analizleri ile değerlendirilebilir. Bu analize başlamak için, modifiye nafion polimeri ve NAD bağımlı dehidrogenaz enzimi ile döküm yapılmış küvete şu reaktifleri ekleyin: 1,3 ml 50 mM sodyum pirofosfat, 1,5 ml taze hazırlanmış 15 mM nikotinamid adenin dinükleotit veya NAD ve 0,1 ml su.

Küveti, 340 nanometre dalga boyuna ayarlanmış bir UV-görünür bölge spektrofotometresine yerleştirin ve cihazı sıfırlayın. Spektrometre küvetine 0,1 mililitre etanol ekleyin ve çözeltiyile pipetle beş kez nazikçe çekip bırakarak reaktifleri karıştırın; kör örnek için 0,1 mililitre etanol yerine ek su kullanın. Reaktifler küvete eklendikten beş dakika sonra, 340 nanometredeki absorbansı kaydedin.

Reaktifler qve'ye eklendikten 20 dakika sonra absorbansı tekrar kaydedin; immobilize edilmiş pq'nun enzimatik spesifik aktivitesini belirlemek için aktivite hesaplamalarında kullanılabilecek bir eğim elde etmek amacıyla bu iki veri noktası grafikleştirilecektir. Bağımlı dehidrogenazlar, modifiye nafion polimeri ve PQQ bağımlı dehidrogenaz ile birlikte dökülmüş olan qve içine şu reaktifleri pipetleyin: 1,5 mililitre sodyum fosfat ve 200 mikrolitre 600 mikromolar pH metilsülfat veya PMS.

Küveti 600 nanometre dalga boyuna ayarlanmış bir UV- görünür bölge spektrofotometresine yerleştirin ve sıfırlayın. Spektrometrenin yanına, boş örnek için 700 µL 2,6-diklorofenol indofenol (DCIP) ile 200 µL ilgili substratın karışımından 100 µL ekleyin. Reaktifleri, çözeltiyi pipetle beş kez nazikçe çekip bırakarak karıştırın.

İlgili substrat yerine 200 µL su kullanın. Reaktifler eklendikten beş dakika sonra, 600 nm'deki absorbansı kaydedin.

Bu analize başlamak için reaktifleri ekledikten 20 dakika sonra absorbansı tekrar kaydedin. Modifiye nafion polimeri ve glukoz oksidaz ile birlikte dökülmüş Q VET'e şunları içeren 2 mL'lik bir çözelti ekleyin: 0,2 molar para hidroksibenzoik asit, %0,02 sodyum azid, 128 ünite peroksidaz, 0,3 milimolar 4-aminoantipirin, 1 molar potasyum fosfat ve 50 milimolar glukoz.

Beş kez pipetleyerek çözeltiyi hazırlayın. Cuvette'i 510 nanometre dalga boyuna ayarlanmış bir UV-görünür spektrofotometreye yerleştirin. Reaktifler cuvette eklendikten beş dakika sonra.

510 nanometredeki absorbansı kaydedin. Ardından, reaktiflerin eklenmesinden 20 dakika sonra absorbansı tekrar kaydedin. Bu tablo, immobilize edilmiş ve seçilmiş modifiye nafion polimerlerinin NAD bağımlı glikoz dehidrogenaz aktivitesi analiz sonuçlarını göstermektedir.

İmmobilize edilmiş NAD bağımlı glukoz dehidrogenazın, enzim ve tampon çözeltiden daha düşük spesifik aktiviteye sahip olduğu gözlemlenmiştir. Bunun nedeni, polimer membranların büyük moleküllerin taşınımını azaltmasıdır; analiz için substrat olan glukoz küçük olsa da, ko-enzim NAD'ın membrandan içeri ve dışarı difüze olması gerekir. NAD bağımlı dehidrogenaz için, polimer içindeki immobilizasyondan kaynaklanan taşınım kısıtlaması, gözlemlenen enzimatik aktiviteyi düşürmektedir.

Sıradaki tablo, immobilize edilmiş ve seçilmiş modifiye nafion polimerlerinin PQQ bağımlı glikoz dehidrogenaz aktivitesine ilişkin analiz sonuçlarını göstermektedir. Burada, çoğu nafion film üzerine immobilize edilen enzimlerin, enzim ve tampon çözeltiye kıyasla daha yüksek aktivite sergilediğini belirtmek önemlidir. PQQ bağımlı glikoz dehidrogenaz membranla ilişkili bir protein olduğundan, hidrofobik modifiye miseller nafion, aktif PQQ bağımlı glikoz dehidrogenazı stabilize etmek için tampona göre membrana daha benzer bir ortam sağlayarak enzimin aktivitesini artırır.

Son olarak, glukoz oksidaz spesifik aktivitesinin temsili analiz sonuçları verilmiştir. İmmobilize edilmiş ve seçilmiş modifiye nafion polimerleri bu tabloda gösterilmektedir. Her bir polimerin üç enzimin her biriyle yapılan enzimatik analizleri, serbest enzime ve solüsyona kıyasla göreli spesifik aktivitedeki eğilimlerin, enzim sisteminin bir fonksiyonu olduğunu göstermektedir.

Sonuç olarak, her enzim için gereken kesin polimerin optimize edilmesi gerekir. Bu prosedürü uygularken, kurutma adımının bu özel işlem için kritik olduğunu unutmamak önemlidir.