Name: Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi Leishmania donovani Amastigotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Keşfedin, Leishmania donovani amastigotlarına karşı hücre içi antileishmanial ilçe tarama için optimize edilmiş parazit kurtarma ve dönüşüm testini. Bu yöntem, THP1 hücreleri kullanarak canlı parazitleri doğru bir şekilde ölçer ve yeni ilaç geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NCNPR-USDA-ARS Bilimsel sözleşmesi No 58-6408-2-0009; US Army Medical araştırma ve Materyal Komutanlığı tarafından CDMRP hibe Ödül # W81XWH-09-2-0093.

1. THP1 Hücre Kültürü koruyun ve Altkültür <ol><li> Bir% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de RPMI-1640 ortamı içinde THP1 hücreleri (% 10 FBS ve pH 7.4 ile) uygun olmalıdır. </li><li> Altkültür hücreleri 1x10 6 hücre / ml aşmasını hücre sayımı önlemek için haftada iki kez. Bu onların dönüşüm yeteneğini korumak için önemlidir. </li></ol> 2. Korumak ve Altkültür Leishmania donovani promastigotlar Kültür <ol><li> L. koruyun RPMI-1640 yılında donovani promastigotlar (S1, Sudan suşu) 26% 10 FBS ile orta (Sodyum Bikarbonat ve Sodyum Piruvat olmadan) ° C </li><li> Altkültür L. donovani 20-25x10 6 promastigotlar / ml.Caution aralığında en yüksek konsantrasyon hücreleri ile, haftada iki kez promastigotlar: Bütün ortam ve çözümler kullanımdan önce oda sıcaklığına getirilmesi gerekmektedir. </li></ol> 3. A 9 tohumlama ve THP1 hücrelerinin farklılaşma6-Mikroplaka ve 16 odası Cam Kültür Slayt. <ol><li> % 10 ısı inaktive FBS ile RPMI-1640 yılında dört günlük bir hücre kültürü 2.5x10 5 hücre / ml (hücre sayısı 10 6 hücre / ml &#39;yi geçmemelidir) ve hücre sayımı ile seyreltilmiş THP1 kültür hazırlayın. Her bir 16-kuyu oda slaydı için her bir 96 kuyulu plaka ve kültür 4 ml kültür 20 ml hazırlandı. </li><li> Forbol 12-miristat seyreltilmiş hücre kültürü süspansiyon 13-asetat (PMA) (THP1 ayrımında) (50 mikrogram / DMSO ml stok 10 μl/20 ml kültür) (seyreltilmiş hücreler kültürde nihai PMA konsantrasyon olmalıdır ekle 25 ng / ml). </li><li> Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay karşılaştırmak için, açık, düz dipli, 96-plaka ve 16 odası, cam, mikroskopik kültürü slayt eşzamanlı deneyleri kurmak. </li><li> Her iyi veya odasına THP1-PMA-tedavili hücrelerde 200 ul dağıtın. </li><li> 96-p inkübehücrelerin hemen hemen tam bir türev sağlamak için% 5&#39;lik CO2 kuluçka makinesi, bir gece boyunca 37 ° C de ilişkilidir ve 16-iyi oda slaytlar. </li></ol> Not: Normalde süspansiyon büyümeye THP1 hücreler, yapışık makrofajlar ayrılır. 4. Leishmania donovani promastigotlar ile dönüştürülmüş THP1 hücrelerinin enfeksiyon <ol><li> Leishmania donovani promastigotlar ile farklılaşmış THP1 hücre kültürü enfeksiyon için, parazitlerin çoğunluğu infektif metacyclic aşaması (uzun silindirik formlar, ~ 5-6 gün eski kültür) olmalıdır. </li><li> Parazit oranı 1:10 THP1 hücre Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Promastigote-Kurtarma-Dönüşüm-Testi hem de enfeksiyon için en uygunudur. </li><li> L. seyreltilmiş bir kültür hazırlayın dan: donovani 2.5x10 6 parazit / ml bir parazit sayısı (parazit oranı = 1:10 THP1 hücreleri) ile promastigotlar% 2 FBS ile RPMI-1640 ortamı içinde bir 5-6 günlük bir kültür. </li><li> Adım 3.5 (THP1 hücre kültürü gece boyunca farklılaşma sonra), ve levhalar oda slaytlar çıkarmak orta kaldırmak ve serum içermeyen RPMI-1640 ortamı ile bir defa hücre kültürleri yıkayın. </li><li> Dikkatli bir şekilde yıkamadan sonra PMA ile tedavi edilen serum içermeyen, sıcak, RPMI-1640 (~ 37 ° C) orta, L. seyreltilmiş 200 ul kültür ile serum içermeyen aracı madde ile yerine THP1 hücreleri donovani promastigotlar (2.5x10 6 parazitler / ml) aşamasında 4,3. Her plaka ve 16-kuyu odası slaytlar THP1 hücreleri olmadan THP1 parazit olmaksızın hücreleri ve parazitlerin kontrol kuyuları ayarlayın. </li><li> THP1 hücre kültürüne parazit ilave edildikten sonra, 37 plaka ve slaytlar inkübe ° C,% 5 parazitler THP1 farklılaşmış hücreleri enfekte izin verecek şekilde 24 saat boyunca CO2. </li></ol> 5. Testi Uyuşturucu / Bileşikleri ile Enfekte makrofajlar Tedavisi <ol><li> TestAmfoterisin B, pentamidin ve tarama için standart anti-leishmanial ilaç olarak Miltefosine. Su ya da DMSO gibi reaktif tabloda belirtilen içinde ilaç / Test bileşiklerinin stok solüsyonları hazırlanır. 6 konsantrasyonlarda her ilaç bileşik sınayın. </li><li> Seri olarak% 2 FBS ile RPMI-1640 ortamı ile yeni bir 96-kuyucuklu levha ya da 2 ml&#39;lik tüp (oda slaytlar için) olarak (1:5) standart ilaç ve test bileşiklerinin seyreltik. Bu plaka ilaçlar / test bileşiği konsantrasyonları nihai konsantrasyonlar 2X vardır. </li><li> L. ile enfekte kültür plakları ve oda slaytlar yıkayınız donovani promastigotlar (adım 4.5 &#39;dan itibaren) serumsuz, RPMI-1640 ortamı ile en az 5 kez. Her kuyu / odasına 100 ul kültür ortamı (% 2 FBS ile RPMI-1640) ekleyin. Birden yıkama olmayan içselleştirilmiş promastigotlar tümüyle kaldırılmasını sağlamak için gereklidir. </li><li> Her iyi veya odasına seri-seyreltilmiş standart anti-leishmanial ilaçlar veya test bileşikleri 100 ul orta ekleyin. Enfeksiyonu ayarlamated THP1 hücreler her plaka / kamara slayt eşzamanlı ilaçlar olmadan denetler. </li><li> 37 plakaları ve oda slaytlar inkübe ° C, 48 saat boyunca% 5 CO2. </li></ol> 6. Odası Slayt Boyama, Floresan Mikroskop Görüntüleme ve Görüntü Analiz Enfeksiyon miktarının ve İlaç Tedavi Etkisi <ol><li> 48 saat inkübasyondan sonra, serum içermeyen RPMI-1640 ortamı ile oda kayar 3 kez yıka. Slaytlardan plastik odaları soyun ve 30 saniye süreyle metanol slaytlar daldırarak hücreleri düzeltmek. Kurutma için hava akımı altında biyo-kukuleta slaytlar bırakın. </li><li> (1:2,000) stok (10.000 X) su ile seyrelterek bir SYBR Green I boyama çözüm (5X) hazırlayın. </li><li> I, oda sıcaklığında 15 dakika için çözelti leke seyreltilmiş SYBR Yeşil ile karanlık koşulları altında slaytlar Leke, su ile bir kez yıkama ve kurutma için hava akış altında slaytlar bırakın. </li><li> Stai üzerinde tam bir cam lamel yerleştirinmontaj orta yardımıyla ned slayt. </li><li> THP1 hücrelerin dijital görüntüler yakalayın: enfeksiyon (boş) olmadan, enfeksiyonu olan (kontrol), enfekte hücreleri eşliğinde Nikon Eclipse 90i floresan mikroskop kullanılarak dilüsyondan farklı standart ilaçlar veya test bileşikleri (Şekil 3, 5 ve 6)) ile tedavi NIS eleman AR 3.2 yazılımı tarafından. </li><li> Makrofaj çekirdekleri (büyük) ve parazit çekirdekleri (kinetoplast küçük), Ulusal Sağlık Enstitüleri (geliştirilen bir yayım-mevcut, Java tabanlı görüntü işleme programıdır ImageJ (Şekil 7), kullanarak Kont <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb. info.nih.gov / ij / download</a> ). Başına 100 amastigotes sayısını THP1 hücreleri gibi dönüştürülmüş veri ifade eder. </li></ol> 7. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay: L. Kontrollü lizis donovani Amastigotes ile enfekte makrofajlar<ol><li> Adımdan 96 çukurlu bir mikrolevhadaki yıkanır 5.5 üç serum içermeyen RPMI-1640 kültür ortamı ile kez. </li><li> Farklı konsantrasyonlarda, 30 için% 0.05 SDS tedavi test ayrı deterjanlar arasında sn kontrollü lizis (kurtarıldı parazit &#39;canlılığı minimum kayıpla maksimum hücre lizis) için en uygunudur. </li><li> Son yıkamadan sonra her kuyudan serum içermeyen aracı madde çıkarın ve her bir kuyucuğa RPMI-1640 20 ul (% 0.05 SDS) ekleyin. 30 sn için çalkalanır ve plaka her bir kuyucuğa (% 10 FBS) ile RPMI-1640 180 ul komple ekleyin. </li><li> Promastigotlar kurtularak amastigotes dönüşüm için 48 saat için 26 ° C sıcaklıkta inkübe plakaları. </li></ol> 8. Dönüştürülmüş Promastigote Kantitatif Analiz (alamarBlue assay) <ol><li> 26, bir 48 saat inkübasyondan sonra ° C, bütün canlı kurtarılmış amastigotes promastigotlar (Şekil 1B) dönüştürülür. 96-p her oyuğuna alamarBlue 10 ul eklelates. </li><li> 26 ° C&#39;da gece boyunca plaka inkübe edin. </li><li> Gecede inkübasyondan sonra, 544 nm eksitasyon, 590nm emisyon bir Fluostar Galaxy fluorimeter (BMG Lab Technologies) standart floresan plakaları okuyun. </li><li> ExcelFit (Şekil 7-9) ile işlem IC bu eğriler 50 / IC 90 değerleri (Tablo 1) ile doz tepki eğrileri (ilaç ya da test bileşiğinin konsantrasyon yüzde büyüme vs) hazırlayın. </li></ol> 9. Parazitler Oranı THP1 Hücrelerinin Standardizasyon <ol><li> Testin duyarlılığı belirlemek için parazit oranı THP1 hücreleri standartlaştırın. Not: Düşük / parazitler numaraları / yüksek enfeksiyon duyarlılığı ve tarama seçicilik ile tehlikeye atabilir. </li><li> Protokol kullanılması dışında fark (bölüm 3 ve 4) THP1 hücreleri tohumlama ve Leishmania promastigote enfeksiyon için yukarıda tarif izleyerek parazit oranı THP1 hücreleri standardize1:1.25, 1:2.5, 1:5 ve 1:10 gibi parazitler THP1 hücrelerin erent oranları. </li><li> 16 kamaralı slayt (görüntü analizi için) ve 96-plaka (parazit-kurtarma tahlil için) parazit kurtarma ve görüntü analizi testleri karşılaştırmak formatlarda hem deney hazırla. </li></ol> 10. Kontrollü hücre lizis için ayrı deterjanlar Standardizasyon <ol><li> Bu deneyin temel amacı anlamlı kurtarıldı amastigote parazitlerin canlılığı etkilemeden tamamlandı / maksimum THP1 hücreleri lizis ulaşmak için THP1 hücrelerin kontrollü lizis protokolü optimize etmektir. </li><li> Farklı konsantrasyonları ile muamele farklı süreler (Şekil 2) bu tür Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 ve SDS gibi değişik deterjanlar test edin. </li><li> Parazit oranı THP1 hücreleri 1:10 &#39;dur ve diğer koşullar, yukarıda bölüm 1-8 kadar benzerdir. </li><li> Farklı tedavi süresi için% 0.05 SDS tedavi daha test edins daha kontrollü hücre lizis optimize etmek. </li></ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Control+of+the+leishmaniasis%3A+report+of+a+meeting+of+the+WHO+Expert+Committee+on+the+Control+of+Leishmaniasis%22">Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis</a>. Xii, Geneva. 22-26 (2010).</li>
<li>Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+scenario+of+drug+development+for+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Current scenario of drug development for leishmaniasis.</a> Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).</li>
<li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Resistance+in+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug Resistance in Leishmaniasis.</a> Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).</li>
<li>Mikus, J., Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+colorimetric+method+to+screen+drug+cytotoxicity+against+Leishmania+using+the+dye+AlamarBlue%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue.</a> Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).</li>
<li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Axenic+Amastigote+System+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">An Axenic Amastigote System for Drug Screening.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).</li>
<li>Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+anti-leishmanial+drugs+against+Leishmania+donovani+is+host+cell+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).</li>
<li>Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antileishmanial+activity+and+immune+modulatory+effects+of+tannins+and+related+compounds+on+Leishmania+parasitized+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells.</a> Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).</li>
<li>Maia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+five+different+types+of+macrophages+by+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum.</a> Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).</li>
<li>Neal, R. A., Croft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+for+determining+the+activity+of+compounds+against+the+intracellular+amastigote+form+of+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani.</a> J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).</li>
<li>Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+staining+procedures+for+the+flow+cytometric+analysis+of+U-937+cells+infected+with+different+Leishmania-species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species.</a> J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).</li>
<li>Giorgio, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Detection+of+Leishmania+Parasites+in+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%3A+Application+to+Antileishmanial-Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).</li>
<li>Mandal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+Leishmania+donovani+clinical+isolates+against+drug+using+a+colorimetric+%CE%B2+Lactamase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay.</a> Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).</li>
<li>Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+assay+for+Leishmania+amazonensis+promastigotes+expressing+multimeric+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein.</a> Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).</li>
<li>Buckner, F. S., Wilson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+screening+compounds+against+Leishmania+Amastigote+Grown+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages.</a> Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).</li>
<li>Sereno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+Leishmania+cell+based+drug-screening+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures.</a> Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).</li>
<li>Gupta, S., Nishi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+leishmaniasis%3A+experimental+models+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery.</a> Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).</li>
<li>Roy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+Infections+in+macrophages+and+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Makrofaj-amastigote modellere dayalı anti-leishmanial ilaç tarama için kullanılabilecek birkaç yöntem vardır. Tahliller ana hayvanlardan yani peritoneal eksuda hücreleri (PEC), periferik kan monosit hücrelerinde (PBMC) toplanan makrofajlar ile yapılabilir 6 ya da kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) veya fare gibi monositik hücre hatları (J774 ve RAW264.7 ) 7 ve insan (THP1, U937, HL-60) 8 monositik hücreleri. Konak hücreler bölünerek kullanmak testleri, parazit ve konak hücre sayısı hem de ilaç aktivitesi karıştırıcı etkisi dikkate alınmasının sağlanması gerekmektedir. Bu tür fareler ve sıçanlar gibi çeşitli kaynaklardan toplanan farklılaşmış birincil makrofajlar doğada olmayan bölünmesi, ancak bu hücre hazırlıkları homojen hücre popülasyonlarının olmayabilir. Monositik hücre-kaynaklı hücre hatları doğal olarak homojen olan ve makrofaj-amastigote bazlı tarama için iyi bir modeldir. Farklı monositik hücre hatları dışında, sorumluluk yönünrentiated THP1 hücrelerinin (insan akut monositik lösemi hücre hattı) olmayan bir bölme monolayer oluştururlar ve primer izole makrofajlara cazip bir alternatif sunabilir. Makrofaj-amastigote tabanlı tarama çeşitli şekillerde yapılabilir. 9 sayma doğrudan hücre ve parazit dayalı klasik mikroskopik değerlendirme emek yoğundur. Otomasyon yokluğu Bu testin yararlılığı sınırlar. Hücrelerinin sayımı zaman alıcı ve bir boyama işlemi ile parazit hayatiyetinin saptanması bu yana IC 50 değerleri arasında yanlış tayin verebilir zordur. Birçok flüoresan boyalar ve monoklonal antikorlar akış sitometrik deneyleri 10, 11 için hesaplanan olabilir, bu testler aynı zamanda bağlı olarak tek bir gün için ilaç muamele zaman aralığının daha az hassaslık ve sınırlama ile sınırlıdır. Hücre içi amastigotes 12,13,14 büyümesi miktarının belirlenmesi için çeşitli haberci gen deneyleri bulunmaktadır. Bir otomated tarama muhabiri genleri kullanarak mümkün olabilir, ancak bu ölçümlerin de bazı dezavantajları var. Öncelikle, bu ölçümlerin çoğunluğu ilaç tarama deney için ideal olmayabilir muhabiri genlerin episomal ifadesi, bakımı için ilaç seçimi gerektirir. Muhabir gen tanıtıldı hangi yolu da parazitin fizyolojik özelliklerini etkiler ve tarama üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Raportör gen bir episomal plazmid parçası ise, raportör nispi çıkış yerine ilaç 14 aktivitesine göre transfekte edilen plasmidin kopya sayısı (hücreden hücreye göre değişir) bağlı olabilir. Bununla birlikte, ya da genomik mimari bozarak veya sadece dış raportör proteinlerin 15 varlığı ile biyolojik etkileri olabilir; parazitler raportör gen sağlamak için seçici basınç gerekmez dönüştürülür Bazı raportör parazitleri. Bir raportör gen temelli analizlerde, oradaduyarlılık ve zemin aktivitesi 16 sorunlar. En önemlisi, muhabir gen ifadesi deneyleri, GFP muhabiri gene15 ile özel bir, çok canlı ve ölü hücre içi amastigotes ayırd edemeyebilirler. Lusiferaz muhabiri gen esas Tahliller canlı ve ölü hücre içi amastigotes arasındaki ayırt edebilir, ancak bu testler için substrat ve hücre lizis tamponu büyük ölçekli tarama 17 için pahalıdır. Bu dezavantajları ve makrofaj-amastigote tabanlı önceki tarama testlerinin sınırlamaları aşmak için, bu parazit-kurtarma ve dönüşüm testi geliştirilmiş ve optimize ettik. Bu testte iyi bir homojenlik olması ve konak hücreleri gibi, doğal olmayan bölme vardır THP1 hücreleri, esas alınmaktadır. Burada anlatılan Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay testi intrasellüler amastigotes Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma dayalı test karşılaştırılabilir. Floresan ve DIC mikroskop, dijital imagMakrofaj çekirdekler ve parazit çekirdeklerin sayma diferansiyel için ImageJ tarafından e analizleri, mikroskobik sayım testi rafine var. Floresan ışığı filtreler ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) filtreler altındaki görüntüleri yakalama intrasellüler parazit daha doğru sayma için dijital görüntü kalitesi iyileştirilmiştir. Floresan ve DIC Hem görüntü net makrofaj hücre hatları ve floresan intrasellüler çekirdekleri ile dijital görüntüler elde etmek için birleştirilebilir. Makrofaj çekirdekler ve parazit çekirdekleri ayirt ImageJ ile tanınabilir. Bu nedenle, Sayısal-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay hem otomasyon ve büyük ölçekli tarama uygulaması için potansiyel var. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Analizinde kritik adımlar şunlardır: (a) Leishmania promastigotlar maruz kaldıktan sonra THP1 hücre kültürlerinde tekrarlanan yıkamalar, olmayan stajyer neredeyse tümüyle kaldırılmasını sağlamak içinalized promastigotlar ve SDS ile enfekte THP1 hücreleri (b) kontrollü bir parçalama. Adımları Hem de otomasyon ile kontrol edilebilir ve testin throughput ile ödün vermemelidir. Varsa test ilaç / bileşiklere Leishmania enfekte THP1 hücrelerinin maruz kaldıktan sonra yıkamanın ikinci adım, kalan olmayan içselleştirilmiş parazitleri kaldırır. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay mevcut mikroskobik, muhabir gen ve görüntü analizi testleri üzerinde önemli avantajlar sunuyor. Testi, Basit, sağlam ve tekrarlanabilir olması büyük ölçekli tarama için otomatik olabilir ve bu nedenle yeni anti-leishmanial ilaç keşfi için büyük bileşiklerin kitaplıkları taramasında önemli uygulama olmalıdır. Bundan başka, aynı zamanda in vitro tahlil Leishmania laboratuar izolatlarına, hem de klinik enfektivite değerlendirmek için kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P1585 </td><td> THP1 hücrelerin farklılaşması için gereklidir. </td></tr><tr><td> RPMI-1640 ortamı </td><td> Invitrogen </td><td> 23400021 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-TeK Odası Sürme Sistemi (16 Daire) </td><td> Thermo Scientific Nunc </td><td> 178599 </td><td></td></tr><tr><td> Berrak, Düz Tabanlı, 96-Well Tabaklar </td><td> BD Falcon </td><td> 353075 </td><td> Plakalar 96-kuyucuklu plak deneyi gerçekleştirmek </td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> A4888 </td><td> Standart anti-leishmanial ilaç (2 mg / ml) DMSO içinde çözülür </td></tr><tr><td> Pentamidin izotionat Salt </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P 0547 </td><td> Standart anti-leishmanial ilaç (2 mg / ml) DMSO içinde çözülür </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> EMD Biosciences ABD </td><td> 475841 </td><td> Standart anti-leishmanial ilaç serum içermeyen RPMI-1640 ortamı (taze hazırlamak) (2 mg / ml) içinde çözülür </td></tr><tr><td> Sodyum stiboglukonat </td><td> EMD Biosciences ABD </td><td> 567565 </td><td> Standart anti-leishmanial ilacın% 4 FBS ile RPMI-1640 hazırlamak. (1 mg / ml) </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> L 5750 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Mikroskop </td><td> NIKON </td><td> ECLIPSE 90i </td><td></td></tr><tr><td> Floresans Mikroplaka Okuyucu </td><td> BMG </td><td> Polar Star Galaxy </td><td></td></tr><tr><td> Orta Montaj </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> M 1289 </td><td></td></tr><tr><td> BirlamarBlue </td><td> Abd Serotec </td><td> BUF012 B </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> S 9430 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Fisher Sci. </td><td> 523500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P2256 </td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11050H </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> P6474 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich USA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> NP-40 </td><td> Calbiochem </td&gt; <td> 492016 </td><td></td></tr></tbody></table>

hücre içi karşı antileishmanial tarama için parasite kurtarma ve dönüşüm testi<em&gt; leishmania donovani</emthp1 İnsan akut monositik lösemi hücre hattı&gt; amastigotes

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis çoğunlukla özellikle gelişmekte olan ülkelerde, yoksulların en yoksulları etkileyen, dünyanın en ihmal edilen hastalıklardan biridir. 350 milyondan fazla insan leishmaniasis yakalanma riski olarak kabul edilir ve yaklaşık 2 milyon yeni vaka yılda 1 meydana gelir. Leishmania donovani Visseral leishmaniasis (VL), hastalığın en ölümcül formu etkeni. Leishmaniasis tedavisinde kullanılan ilaçların tercih 2 sınırlıdır; mevcut tedavilerin sınırlı etkinlik sağlar ve tedavi edici dozlarda pek çok zehirlidir. Buna ek olarak, ilk basamak tedavi ilaçların çoğu zaten çoklu ilaç direnci 3 artan nedeniyle programı kaybetti. Anti-leishmanial ilaçların mevcut boru hattı da ciddi tükenmiş. Sürekli çabaları yeni bir anti-leishmanial ilaç keşfi boru hattı zenginleştirmek için gerekli, ve bu çaba in vitro tarama modellerinde uygun mevcudiyetine bağlıdır vardır. in vitro promastigotlar 4 ve axenic amastigotes deneyleri 5 öncelikle Ancak, hücre içi amastigotes ile karşılaştırıldığında, önemli hücre, fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler farklılıklar için uygun olmayabilir anti-leishmanial ilaç taraması için kullanılır. Makrofaj-amastigotes modelleri ile Tahliller leishmaniasis patofizyolojik durumlarda en yakın olarak kabul edilir ve bu nedenle in vitro tarama için en uygun vardır. Ayrılmış, non-bölme insan akut monositik lösemi hücreleri (THP1) izole birincil makrofaj alternatif olarak (bir çekici hale) ve hücre içi amastigotes karşı farklı bileşiklerin anti-leishmanial etkinliğinin test edilmesi için kullanılabilir. Burada, biz saf bileşiklerin taranması ve eşya doğal için Leishmania donovani ile in vitro enfekte farklılaşmış THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm tahlil sunmakucts özü ve hücre içi Leishmania amastigotes karşı etkinliğinin belirlenmesi. Dışı bölme makrofajlar, THP1 hücreleri (1) farklılaşma, L. ile makrofajların (2) enfeksiyonu: tahlil aşağıdaki adımları içerir donovani metacyclic promastigotlar, test ilaç, enfekte makrofajlar (4) kontrollü parçalanması, (5) serbest / amastigotes kurtarma ve promastigotlar canlı amastigotes (6) dönüşümü ile enfekte hücrelerin (3) tedavi. Tahlil promastigotlar dönüşümü yeteneklerini üzerinde minimal etkisi ile canlı intraselüler amastigotes neredeyse komple kurtarma ulaşmak için Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis deterjan tedavisi kullanılarak optimize edildi. Farklı makrofaj: promastigotlar oranları maksimum enfeksiyon elde etmek için test edildi. Enfeksiyon Kantitasyonu canlı dönüşümü yoluyla yapıldı, kurtarılan Leishmania bir alam kendi büyüme promastigotlar ve değerlendirilmesinde amastigotes96-mikroplatelerde arBlue florometrik tahlil. Bu testte, şu anda kullanılmakta mikroskobik, transgenik muhabir gen ve dijital görüntü analizi testleri ile karşılaştırılabilir. Bu testte sağlam ve sadece canlı ve ölü amastigotes ayırd edemeyebilirler muhabiri gen ve görüntü analizi testleri ile karşılaştırıldığında canlı intrasellüler amastigotes ölçer. Ayrıca, tahlil anti-leishmanial ilaç mevcut panel ile doğrulandı ve başarılı bir şekilde büyük ölçekli saf bileşiklerin tarama ve doğal ürün türevleri (Tekwani ve ark. Yayınlanmamış) bir kütüphane ile tatbik edilmiştir.

Bir kantitatif analiz 24, 48, 72 ve 96 saat sonrası ilaç tedavisi için Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Testi hem yapıldı L. doğrudan sayma yöntemi, enfeksiyon donovani-enfekte makrofajlar (THP1 hücreleri), aşağıdaki denklem ile hesaplandı: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054eq1.jpg" /> Amastigotes (amastigotes çekirdeğinin sayma ile belirlenir) / 100 THP1 hücreleri (THP1 hücre çekirdekleri altında sayıldı sayma ile belirlenir) (Şekil 7) ile enfekte olan THP1 hücrelerinin yüzdesi farklı standart veya test bileşiklerinin etkisi incelemek için, daha doğru bir ölçüsüdür transforme bu sayı, doğrudan bileşiklerin genel bir etki ile ilgili olduğu için, bazı önceki kağıtlar de bildirildiği gibi, ya da bir azalma sayesindemakrofaj cells.Infection gelen makrofaj hücreleri veya parazit toplam kaldırma parazitler çeşitli zaman aralıklarında (Şekil 10 ve Tablo 1) için farklı dilüsyonlarda farklı standart ilaçlarla tedavi enfekte THP1 hücrelerin dijital görüntüleri hesaplandı. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi için ise bağıl floresans birimleri (RFU) idi okuması ise okuma-out Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Testi için amastigotes infection/100, THP1 hücreleri dönüştürüldü doğrudan infekte makrofajların kurtarıldı canlı Leishmania amastigotes sayısıyla orantılıdır ve promastigotlar dönüşür. AlamarBlue tahlil rutin Leishmania promastigotlar anti-leishmanial ilaç taraması için kullanılır. Testi başlangıçta standart ve Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis için optimize oldu. Amaç için deterjan tre koşulları optimize etmek için yapıldıKurtarılan amastigotes canlılığı üzerine minimal etki THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis verim, olgunun,. Şekil 1 tam tahlil protokolü bir mikroskopik görünümü gösteriyor. Leishmania amastigotes ile enfekte olan bozulmamış THP1 hücrelerinde Şekil 1A &#39;da görülebilir. Şekil 1B deterjan tedaviden sonra THP1 hücrelerinin lizisi gösterir. Şekil 1C kısmen promastigotlar ve Şekil 1B dönüştürülmüştür Leishmania amastigotes, kurtarılan göstermektedir içine amastigotes hemen hemen tam bir dönüşüm göstermektedir promastigotlar ve sonraki yayılması. Bu dönüştürülmüş promastigotlar büyüme kantitatif alamarBlue eklenmesi ve bir mikroplak okuyucu üzerinde floresans ölçümleri ile izlenebilir. NP-40 (Şekil 2A) ve Triton X-100 (Şekil 2B) ile muamele enfekte THP1 hücreleri lize, fakat aynı zamanda canlılığı etkilemiş veKurtarılan amastigotes dönüşümü. Tween 20 (Şekil 2C) ve Tween 80 (Şekil 2D) ile muamele transforme promastigotlar düşük sayılar ile gösterildiği gibi amastigotes tamamlanmamış bir kurtarma içine çıkan, THP1 hücrelerinin lizisi en uygun yol açmamıştır. 30 sn için% 0.05 SDS (Şekil 2E) ile tedavi Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis vermiştir ve kurtarılan amastigotes canlılığı ve dönüşüm etkilemedi. Diğer optimizasyon sn canlı Leishmania amastigotes (Şekil 2F) en yüksek kurtarma vermiştir 20-30 için% 0.05 SDS ile hücrelerin tedavisinin gösterdi. Sonraki deneylerde, 30% 0.05 SDS ile muamele san kullanılmıştır. SDS tedavisi için prosedür, tek ya da çoklu plakalar için de aynıdır. Birden plaklarda SDS tedavi kanallı pipet ile sütun sütun uygulanmıştır. Serum içermeyen aracı madde tüm 8 levhanın bir sütun kuyuları ve 20 ve mu çıkarıldı,% 0.05 SDS l, sütun 8 kuyu içinde ilave edildi ve% 10 FCS içeren RPMI-1640 ile 30 saniye sonra seyreltildi. Testin ilk standardizasyon sırasında, plaka olmayan içsel promastigotlar için mikroskop altında kontrol edildi. Beş yıkamanın bir asgari standart bileşikler ve üç yıkamalar SDS tedavi adım 7&#39;den önce gerekli olduğu ile enfekte makrofaj hücrelerinin tedavisinde 5 adımda önce parazitlerin giderilmesi için gerekli idi. Bu yüzden, hücreler, 8 kez yıkanmış ve herhangi bir görünür olmayan içsel promastigotlar enfekte THP1 hücrelerinin lizisi kontrol önce kaldı. Sayısal Görüntü Analizi ve Doğrudan Sayma Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin dijital görüntüleri (Şekil 3 SYBR Green I ile boyanma özelliği kinetoplast DNA ile makrofaj çekirdekler ve intraselüler Leishmania çekirdekleri Hem floresan filtreleri altında gözlendi sonra Nikon Eclipse 90i floresan mikroskop yakalandı). Ayrıca, enfekte THP1 hücrelerin görüntüleri de DIC altında ele geçirildi. Görüntüler hem birleşti edildiğinde, intrasellüler amastigotes ile THP1 hücrelerin anahatları (Şekil 4) daha net görüldü. ImageJ yazılımı bu görüntüleri analiz etmek için kullanılmıştır. ImageJ Sağlık (National Institutes of geliştirilen bir kamu alanı, Java tabanlı, görüntü işleme programıdır <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</a> ). ImageJ Java eklentileri ve kaydedilebilir makroları aracılığıyla genişletilebilirlik sağlayan bir açık mimarisi ile dizayn edilmiştir. Özel toplama, analiz ve işleme eklentileri ImageJ built-in editörü ve bir Java derleyicisi kullanılarak geliştirilebilir. ImageJ tarafından THP1 hücrelerin çekirdeklerinde ve parazit çekirdeklerin sayma diferansiyel için, görüntü ImageJ açıldı. Hücre sayacı Yazılımı eklenti Çözümle seçenek bulundu. Görüntü başlatıldı ve hücre sayacı tip 1 THP1 c için seçildiell çekirdek ve hücre sayacı tip 2 parazitin çekirdeği (Şekil 3) için seçildi. Diferansiyel sayma en az 200 THP1 hücre çekirdeğine ve bu THP1 hücre çekirdeğinde mevcut hücre içi amastigotes için yapıldı. Parazit-kurtarma tahlil ve görüntü analiz yöntemi ile karşılaştırılması farklı makrofaj ile THP1 hücreleri enfektivite değerlendirmek için yapılmıştır:. Promastigote oranları: promastigotlar oranları (Şekil 4) Şekil 5, farklı makrofaj de THP1 hücrelerinde diferansiyel enfektivite temsil eder. Her iki yöntem de benzer sonuçlar ve makrofaj gösterdi: 1:10 promastigote oranı optimum ve tekrarlanabilir enfektivite vermiştir. Parasite-rescue/transformation tahlil ve dijital görüntü analizi için koşulları optimize edildiğinde, bu ölçümlerin yarar anti-leishmanial ilaç taraması için değerlendirildi. Leishmania ile enfekte THP1 hücreleri standart bir farklı konsantrasyonları ile tedavi edilmiştiryani nti-leishmanial ilaçlar Amfoterisin B, 24 ile 96 saat arasında değişen farklı zaman aralıkları için pentamidin ve Miltefosine. Parazit için deneme / dönüşüm testi üç nüsha olarak yapıldı kurtarıldı ve sayma yöntemi ile doğrudan hücrelerin deney iki kopya halinde yapıldı. Şekil 6 işlenmemiş ve Leishmania-enfekte bulaşmış bulaşmamış, kontrol, THP1 hücreleri tedavi kontrolü mikroskobik görüntüleri gösterir. Doz tepki eğrileri, parazit-kurtarma ve dönüşüm tahlil (transforme parazitler vs ilaç konsantrasyonu) ve görüntü analizi deneyi (amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı) (Şekil 7-9) elde edildi. Ilaçların IC 50 ExcelFit göre hesaplanmıştır ve Tablo 1&#39;de sunulmaktadır. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay benzer sonuçlar gösterdi. Dijital Görüntü-Analiz-Direk-Sayım-Assay erken 24 zaman noktalarında ve 48 saat ilaç t sırasında daha az uygun olduğureatments, Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay ilaç tedavileri sonrası 24-96 saat boyunca tüm zaman noktalarında bildirilen değerleri ile daha tutarlı sonuçlar gösterirken. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay ile sonuçlarda bu fark Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma ilaç tedavisinin erken dönemlerinde cansız amastigotes varlığı nedeniyle olabilir -Testi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig1.jpg" /> Şekil 1. Leishmania donovani bir mikroskopik görünümü promastigotlar için kurtarma ve dönüşüm amastigotes. A - Leishmania amastigotes ile enfekte Bağlanan THP1 hücreleri, B - kontrollü parçalanması C sonra yapışkan, enfekte THP1 hücreleri - enfekte THP1 makrofaj hücreleri D kurtarıldı amastigotes itibaren Leishmania donovani promastigotlar dönüşenler - tran Büyüme ve çoğalmasformed Leishmania donovani promastigotlar. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig2.jpg" /> Farklı deterjan ile Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerinden amastigotes arasında THP1 hücreleri ve kurtarma lizis Şekil 2. Promastigotlar canlı Leishmania donovani amastigotes ve dönüşümün maksimum kurtarma ulaşmak için enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis optimizasyonu. Analizi. İki deterjan konsantrasyonu (% 0.05 ve% 0.1) ve arıtma için iki zaman dilimi (30 saniye ve 60 saniye) test edilmiştir. RFU = rölatif floresan birimleri. Her bir çubuk yinelenen gözlemler ortalama temsil eder. [A] NP-40 ile tedavi edilen THP1 hücrelerinin lizisi neden olur ve ayrıca kurtarılan amastigote parazitlerin canlılığı etkilenir. [B] Triton X-100 treatment THP1 hücrelerinin lizisi neden olur ve ayrıca kurtarılan amastigote parazitlerin canlılığı etkilenmiş [C] Tween 80 amastigotes kurtarmak için THP1 hücrelerinin lizisi kısmi neden olmuştur. [D] Tween 80 amastigotes kurtarmak için THP1 hücrelerinin lizisi kısmi neden olmuştur. [E ] SDS tedavi THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis neden ve% 0.05 / 30 kurtarıldı amastigotes canlılığı etkilemez vermedi sn. [F 20-30 için% 0.05 SDS] Tedavi sn THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis neden ve yaşayabilir bir parazit kurtarıldı promastigotlar dönüşmek amastigotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig3.jpg" /> Şekil 3,. Leishmani ile in vitro enfekte farklılaşmış bir THP1 hücrelerinin Floresan dijital görüntübir donovani amastigotes. Karakteristik kDNA ayrıca her bir parazit çekirdek ile görülebilir. Makrofaj çekirdeği (mN) (1) ve parazit çekirdekleri (pN) (2) enfeksiyon nicel değerlendirmesi için ImageJ analiz yazılımı tarafından farklı olarak işaretlenmiş ve farklı olarak sayılabilir. Miktar amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı olarak yapıldı. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4054/4054fig4.jpg" /> Şekil 4. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay (alt panel) ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay (üst panel) arasında karşılaştırma. Makrofaj: 1:10 promastigote oranı optimal infeksiyon vermiştir. Hem benzer sonuçlar gösterdi. Parazit-kurtarma denemesi bazı arka plan değerleri gösterdi. Her çubuk gösterileri yinelenen değerleri ortalamasıdır. <img alt="Şekil 5," src = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig5.jpg&quot; /&gt; Şekil 5 farklı THP1 tarafından Leishmania promastigotlar ile enfekte THP1 hücreleri:. Promastigote oranı. Amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı olarak nicel sonuçlar Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. <img alt="Şekil 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig6.jpg" /> Şekil 6. Leishmania donovani ile enfekte THP1 hücrelerin Dijital görüntüler (Floresan + DIC) değişik süreler için standart anti-leishmanial ilaçlarla tedavi sonrasında amastigotes. Sonuçlar amastigotes/100 THP1 hücre sayısı gibi niceliksel ve arıtılmamış kontrollere kıyasla yüzde büyüme hesaplamak ve IC 50 değerlerini belirlemek için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 7" fo: İçerik-width = &quot;4.75in&quot; fo: src = src = &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7.jpg&quot; / &quot;/ files/ftp_upload/4054/4054fig7highres.jpg&quot;&gt; Şekil 7. Karşılaştırılması Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial uyuşturucu taraması (Amophotericin B) Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi. Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC 50 (mg / ml) değerleri Excelfit tarafından doz yanıt eğrisi hesaplanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig7large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 8," fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig8.jpg" /> Şekil 8., Bir Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay Karşılaştırılmasınti-leishmanial uyuşturucu taraması (pentamidin). Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC 50 (mg / ml) değerleri Excelfit tarafından doz yanıt eğrileri hesaplandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig8large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 9" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4054/4054fig9.jpg" /> Şekil 9. Karşılaştırılması Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial uyuşturucu taraması (Mitefosine) için Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi. Infekte makrofajların değişik süreler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC50 (ug / ml) değerleri Excelfit ile doz tepki eğrilerinden yola çıkılarak hesaplanmıştır.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4054/4054fig9large.jpg" target="_blank">Büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> Testi İlaç </td><td colspan="2"> 24 saat bir </td><td colspan="2"> 48 saat bir </td><td colspan="2"> 72 saat bir </td><td colspan="2"> 96 saat bir </td></tr><tr><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td><td> IACA b </td><td> PRTA c </td></tr><tr><td> Amfoterisin B </td><td> 0.24 ± 0.03 </td><td> 0.17 ± 0.01 * </td><td> 0.12 ± 0.04 </td><td> 0.20 ± 0.07 </td><td> 0.06 ± 0.01 </td><td> 0.06 ± 0.01 </td><td> 0.11 ± 0.03 </td><td> 0.10 ± 0.03 </td></tr><tr><td> Pentamidin </td><td> &gt; 10 </td><td> 2.55 ± 1.16 * </td><td> 2.88 &amp; plusmn; 0.58 </td><td> 1.43 ± 0.91 </td><td> 1.24 ± 0.35 </td><td> 1.52 ± 0.16 </td><td> 0.71 ± 0.63 </td><td> 0.98 ± 0.33 </td></tr><tr><td> Miltefosine </td><td> 0.38 ± 0.02 </td><td> 0.19 ± 0.08 * </td><td> 0.24 ± 0.06 </td><td> 0.30 ± 0.08 </td><td> 0.36 ± 0.02 </td><td> 0.16 ± 0.06 </td><td> 0.21 ± 0.15 </td><td> 0.17 ± 0.10 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial ilaç tarama için Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay Karşılaştırılması. Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC 50 (mg / ml) değerleri Excelfit (Şekil 7-9) ile doz yanıt eğrileri hesaplandı bir saati sonrası ilaç tedavisi, b. IACA = Görüntü Analizi ve Doğrudan SaymaAssay; c PRTA = Parazit-Kurtarma ve Dönüşüm Testi. Verilen değerler ug / ml olarak IC 50 (parazit büyüme içinde en az% 50 inhibisyonuna neden olan ilaç konsantrasyonu) olan ve en az üç deneyin ortalaması ± SD vardır. * (&lt;0.05) istatistiksel olarak farklı IACA ile IC50 değerleri karşılaştırıldı.

Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm testi<em&gt; In vitro</em&gt; Ile<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Anti-leishmanial ilaç tarama için optimize edilmiştir. Tahlil THP1 hücreleri, promastigotlar enfeksiyonu, testi ilaçlar, infekte makrofajların kontrollü lizis, amastigotes kurtarılması promastigotlar ve izleme promastigote büyüme dönüşüm ve florometrik tayini ile yayılması ile tedavi farklılaşma içerir.

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Leishmaniasis, ağırlıklı olarak gelişmekte olan ülkelerdeki en yoksul kesimleri etkileyen, dünyanın en çok ihmal edilen hastalıklarından biridir. 350 milyondan fazla...

Burada gösterilen deneysel teknolojinin genel amacı, viseral leishmaniasis etkeni olan Leishmania donovani'nin hücre içi amastigot evresinin büyüme ve proliferasyonuna karşı bileşikleri taramak ve temel hedef olarak leishmaniasis tedavisi için yeni ilaçlar keşfetmektir. İlk olarak, THP-1 insan akut monositik lösemi hücreleri in vitro ortamda yapışkan makrofajlara farklılaştırılır; farklılaştırılmış THP-1 hücreleri daha sonra Leishmania donovani parazitlerinin promastigot formları ile enfekte edilir. Bu işlem, promastigotların THP-1 makrofajlarına invazyonuna, amastigotlara dönüşümlerine ve hücre içi proliferasyonlarına olanak tanır. Ardından, leishmania ile enfekte edilmiş THP-1 makrofajları test bileşiklerine ve standart ilaçlara maruz bırakılır ve ardından kontrollü lizis, amastigotların geri kazanımı, kalıntı amastigotların promastigotlara dönüşümü ve kolormetrik hücre büyüme analizleri ile promastigotların kantifikasyonuna tabi tutulur.Hücre içi am master keçilerin kantifikasyonuna dayalı olarak, test bileşiklerinin ve standart ilaçların hücre içi büyüme ve proliferasyon üzerindeki anti-mani etkisini gösteren elde edilmiş sonuçlar. Lemanis, özellikle dünyanın tropikal bölgelerinde küresel sağlık için büyük bir tehdittir. Bu hastalığı tedavi etmek için daha iyi terapötik profillere sahip yeni ilaçlara acilen ihtiyaç duyulmaktadır.Ulusal Doğal Ürünler Araştırma Merkezi'nde, tropikal paraziter hastalıklar için yeni tedavilerin keşfine yönelik çok yönlü bir program başlattık. Canlı ve ölü MST hücrelerini ayırt edemeyen Rogen ve mikroskobik görüntü analizi deneylerinin aksine, bu SA yalnızca canlı hücre içi MST hücrelerini ölçmektedir. Saf bileşiklerin ve doğal ürün ekstraktlarının taranması ve hücre içi limania'ya karşı etkinliğin belirlenmesi amacıyla, in vitro olarak liman ile enfekte edilmiş farklılaşmış TP one hücrelerini içeren bir parazit kurtarma ve transformasyon deneyi optimize ettik.Bu deneyin ayrıntıları, laboratuvarımdaki araştırma ve geliştirme biyoloğu olan ve bu deneyi gerçekleştiren Bay Ra ile yine laboratuvarımda araştırma ve geliştirme biyoloğu olarak çalışan Bay RA Sahu tarafından gösterilecektir. Analiz dört temel adımdan oluşmaktadır. Birinci adım, THP one hücrelerinin ekilmesi ve terminal diferansiyasyonudur.İkinci adım, farklılaşmış TP one hücrelerinin L. donovani promastigotları ile in vitro enfeksiyonudur. Üçüncü adım, Leishmania ile enfekte edilmiş makrofajların test bileşikleri veya standart ilaçlarla tedavi edilmesidir. Ve dördüncü adım, Leishmania parazit promastigotlarının büyüme ve proliferasyonunun mikroskobik görüntü analizi veya parazit kurtarma ve transformasyon analizleri ile kantifikasyonudur.Dört günlük bir THP-1 makrofaj kültürünü hasat edin ve %10 ısı ile aktive edilmiş FBS ile desteklenmiş RPMI içinde, mililitre başına 2,5 x 10⁵ hücre konsantrasyonunda bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Diferansiyasyonu başlatmak için hücrelere mililitre başına 25 ng PMA ekleyin. Ardından, hücreler ekildiğinde, 200 µL hücre süspansiyonunu bir 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna ve 16 odacıklı bir cam slaydın her odasına aktarın; slaydı ve 96 kuyucuklu plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve hücresel diferansiyasyonun neredeyse tamamen gerçekleşmesi için hücreleri gece boyunca inkübe edin.Enfeksiyon için, çoğu organizmanın enfektif metasiklik evrede olduğu beş ila altı günlük bir ProMaster keçi parazit kültürü kullanın. Kısa jel ile kısa ellipsoid hücrelere sahip, zayıf hareketli ve genellikle rozetler şeklinde bulunan prosiklik evredeki ProMaster keçilerinin aksine, enfektif metasiklik organizmalar uzun silindirik şekilleri ve yüksek motiliteleri ile tanınabilir.Parazitleri hasat edin ve %2 FBS içeren RPMI içerisinde mililitrede 2,5 × 10⁶ parazit içeren bir ProMaster keçi süspansiyonu hazırlayın; 96 kuyucuklu plakayı ve cam lamı işleyerek farklılaşmış THP-1 hücre kültürlerini inkübatörden çıkarın. Eş zamanlı olarak, kültürlerdeki süpernatantı uzaklaştırın, ardından hücreleri önceden ısıtılmış serumsuz besiyeri ekleyerek yıkayın. Serumsuz besiyerini uzaklaştırın ve her kuyucuğa, her bir THP-1 hücresi için 10 parazit oranını sağlayacak şekilde 200 µL ProMaster keçi süspansiyonu ekleyin.Kontrol kuyucukları için, parazit süspansiyonu yerine 200 µL %2 F-P-S-R-P-M-I besiyeri ekleyin. Parazitleri ekledikten sonra, test edilecek ilaç stok çözeltilerinden enfeksiyonun gerçekleşmesini sağlamak için ko-kültürleri 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. %2 F-B-S-R-P-M-I içinde, her bir dilüsyonun konsantrasyonu hedeflenen nihai test konsantrasyonunun iki katı olacak şekilde altı seri 1/5 dilüsyon hazırlayın.Kontrol olarak, amfoterisin B, pentamidin, melter, Fosse ve sodyum stibglukonat gibi standart antimanial ilaçların konsantrasyonları, ilaçlar ko-kültürlere eklenmeden önce kullanılabilir. Plakadaki ve lamdaki TP-1 hücrelerini daha önce açıklandığı şekilde tekrar tekrar yıkayın. İçselleştirilmemiş ProMaster keçilerini uzaklaştırmak için hücreleri en az beş kez yıkayın.Ardından, her bir kuyucuğa veya hazneye 100 µL %2 F-B-S-R-P-M-I ve her bir ilaç çözeltisinden 100 µL ekleyin; ilaç uygulamasının ardından plak ve lamı 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Hazneyi ve lamı serumsuz besiyeri ile üç kez yıkayın.Plastik odacıkları lamdan soyun ve lamı 30 saniye boyunca metanol içinde bekleterek hücreleri sabitleyin. Kuruması için lamı lamine akışlı bir biyotehlike kabinine yerleştirin. Bu sırada beş kat konsantrasyonda bir cyber green çözeltisi hazırlayın.Lam kuruduğunda, hücresel ve parazit DNA'yı boyamak için cyber green içine daldırın. Numuneyi oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Boyama adımından sonra lamı suyla yıkayın ve kurumaya bırakın.Montaj medyumu kullanarak, lamın üzerine bir cam lameli yerleştirin. Ardından örnekleri floresan mikroskobu altında inceleyin ve her bir odacığın görüntülerini yakalayın; enfekte edilmemiş hücrelerde yalnızca makrofaj çekirdeği görünürken, enfekte hücrelerde parazit çekirdekleri ve kanallar hücre sitoplazmasında görülebilir, bu da hücre içi Leishmania parazitlerinin varlığını kanıtlar.Enfeksiyonu nicelendirmek için, parazit kurtarma deneyi için makrofaj çekirdek sayısına oranla am master keçi çekirdek sayısının 100 ile çarpımı olan yüzde enfektiviteyi hesaplamak üzere Image J kullanın. İlk olarak, 96 kuyucuklu plakadaki ko-kültürü, hücreleri lysate etmek için 20 µL %0,05 SDS-RPMI ile serumsuz RPMI besiyeriyle üç kez yıkayın. Her bir kuyucuk için plakayı 30 saniye boyunca sallayın.Ardından her kuyucuğa 180 µL %10 F-B-S-R-P-M-I ekleyin. Kurtarılan ana hücrelerin canlılığı üzerinde herhangi bir etki oluşturmadan, makrofajların kontrollü lizini sağlamak için SDS işlemi süresi 30 saniyeyi geçmemelidir. Kurtarılan görünür ana hücrelerin pro-ana hücrelere transformasyonuna ve proliferasyonuna izin vermek için plakayı 26 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin.Pro master keçilerini niceliksel olarak belirlemek için, 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 10 µL alamar blue ekleyin ve 26 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bu inkübasyonun ardından, plakayı standart bir floresan florimetrede okuyarak canlı parazitleri niceliksel olarak belirleyin. İlaç yokluğunda, enfeksiyon yüzdesi, makrofaj sayısına oranla mevcut olan master keçilerinin sayısıyla birlikte artar.Ayrıca, kurtarma deneyi ile belirlenen hayatta kalan parazit miktarı, artan amfoterisin konsantrasyonları varlığındaki enfeksiyon yüzdesi ile iyi bir korelasyon göstermektedir. B. Kurtarılan parazit sayısı doz bağımlı bir şekilde azalmaktadır. Parazit kurtarma ve transformasyon deneyi, ardışık mikroskobik görüntülerle özetlenebilir.Bu resim, kültürdeki enfekte olmuş sağlam THP-1 hücrelerini göstermektedir. Enfekte olan bu THP-1 hücreleri, canlı amastigotları kurtarmak için kontrollü lizise tabi tutulur. Enfekte THP-1 hücrelerinden kurtarılan canlı amastigotlar, kültürü promastigotlara dönüştürür.Bu transforme edilmiş ProMaster keçileri büyür ve çoğalan kültürler oluşturur. Kültürdeki toplam ProMaster keçisi sayısı, canlı hücre içi oma keçilerinin sayısıyla doğrudan orantılıdır. Bu deney, limania enfekte THV bir hücrelerinin kontrol lisansı için optimize edilmiştir.Amaç, kurtarılan MST kodlarının TY'si üzerinde minimum etki oluştururken, THV bir hücrelerinin lizini neredeyse tamamlayacak şekilde deterjan işlemi koşullarını optimize etmekti. Bu adım, bu analizde oldukça kritiktir. Burada gösterilen parazit kurtarma analizi, deri veya mukokütan leishman asidiniye neden olan farklı linia parazit türlerinin farklı mikro kalp hücre hatlarındaki enfeksiyözlüğünü belirlemek için ve ayrıca farklı lenia saha izolatları veya genetik olarak manipüle edilmiş parazit hücre hatları için de uygulanabilir.Hem SA olarak parazit kurtarma hem de SA olarak görüntü analizi benzer sonuçlar göstermektedir. Bu yöntemler, otomasyon ve geniş ölçekli tarama uygulamaları için potansiyele sahiptir. Merkezimizde bulunan doğal ürün özütlerinin yüksek verimli fraksiyonlaması ile hazırlanan 16.000'den fazla fraksiyonun taranması için bu deneyi başarıyla uyguladık.DIC ve floresein filtreleri altında yakalanan görüntüleri birleştirerek ve enfeksiyonun ImageJ ile kantifikasyonunu gerçekleştirerek görüntü analizini bir deney olarak optimize ettik. ImageJ, başlangıçta NIH'de geliştirilmiş, halka açık, Java tabanlı bir görüntü işleme programıdır. Bu analiz sayesinde, yeni bileşikler içeren birçok doğal ürün fraksiyonu, intestinal yol keşfi için yeni öncü adaylar olarak tanımlanmıştır.

a-parasite-rescue-transformation-assay-for-antileishmanial-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Bu video, makrofajları metasiklik promastigotlarla tedavi ederek Leishmania'nın virülansını araştırır ve bu da hücre içi amastigotların oluşumuyla sonuçlanır. Leishmania'nın virülansının doğrulanması, nükleik asit floresan boya boyası ile elde edilir. Bu içgörü, leishmaniasis için yeni tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Kültürlenmiş Makrofajlarda Leishmania Virülansının Değerlendirilmesi

Bu video, kemik iliği kaynaklı makrofajlardaki (BMM'ler) parazitlerin hücre içi büyümesini ölçmek için bir testi göstermektedir. Makrofaj hücreleri, sırasıyla Leishmania'nın motil ve non-motil invaziv evreleri, metasiklik promastigotlar ve amastigotlar ile enfekte olur. Parazitler makrofajları istila eder, parazitoforöz bir vakuol içinde içselleşir ve içinde çoğalır. Hücre içi parazit büyümesi, makrofaj ve parazit çekirdeklerinin floresan olarak boyanması üzerine bir mikroskop kullanılarak...

Makrofajlarda Parazitin Hücre İçi Büyümesini Ölçmek için Bir İn Vitro Test

Aynı dizide karışık katyonik işlevselliğe sahip peptoidleri sentezlemek için bir protokol sunulmuştur (lizin ve arginin tipi monomerler). Bu bileşiklerin, kutanöz leishmaniasis'e neden olan protozoan parazitler olan Leishmania mexicana'ya karşı daha sonraki testleri de açıklanmaktadır.

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

Burada, Leishmania amazonensisile farelerin kutanöz enfeksiyon değerlendirmek için derlenmiş bir protokol sıyoruz. Bu parazit virülans çalışma için güvenilir bir yöntemdir, enfeksiyona omurgalı konak yanıtı sistemik bir görünüm sağlayan.

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Burada sunulan, gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu bağlanma, sitotoksisite ve sinyalleşmeyi belirlemek için Leishmania majör promastigotlarını kullanan bir protokoldür. Streptolizin O ile bir kavram kanıtı sağlanır. Diğer toksinler, toksin direncinin yeni mekanizmalarını tanımlamak için L. major'da bulunan genetik mutantlardan yararlanmak için de kullanılabilir.

Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

Burada, L. infantum-Luc ile intraperitoneal (IP) veya intragingival (IG) enfekte olmuş altın hamsterlerin biyolüminesan görüntüleme ve PCR ile boylamsal bir değerlendirmesini sunuyoruz. Hamsterlar enfeksiyondan 1 gün sonra (1 dpi), enfeksiyondan 1 hafta sonra (8 dpi) ve enfeksiyondan 3 hafta sonra (22 dpi) değerlendirildi ve 50. dpi ve enfeksiyondan 8 ay sonra ötenazi yapıldı.

In vivo (İn canlı) Leishmania infantum ile Enfekte Hamsterlerin Luciferaz İfade Eden Aksenik Amastigotların Dişeti Aşılaması ile Görüntülenmesi

Keşfedin, Leishmania donovani amastigotlarına karşı hücre içi antileishmanial ilçe tarama için optimize edilmiş parazit kurtarma ve dönüşüm testini. Bu yöntem, THP1 hücreleri kullanarak canlı parazitleri doğru bir şekilde ölçer ve yeni ilaç geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi

Daha fazla video keşfet