Name: Pankreas Adenokarsinom Doku B7-H1 immünohistokimyasal boyanma (PD-L1) parafin Slaytlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Öğrenin pankreas adenokarsinom dokusunda B7-H1 (PD-L1) immünohistokimyasal boyama tekniğini. Parafin kesitlerde antijen geri kazanımı ve DAB renk gelişimi ile immünoterapi stratejileri için tümör mikroçevresini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EB, KMB, ve HX eşit katkıda bulunurlar. Bu çalışmada, gastrointestinal kanserler P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Vakfı, Viragh Vakfı, ASCO Genç Araştırmacı Ödülü, NIH 5T32 CA0090701-28 Eğitim Bursu, Sol Goldman Pankreas Kanseri Merkezi ve Ulusal Pankreas Vakfı NCI SPORE tarafından desteklenmiştir.

B7-H1/PD-L1, bağışıklık düzenleyici bir hücre yüzey proteinlerinin B7 ailesinin bir üyesi, (PD programlanmış ölüm-1, reseptörü ile etkileşim yoluyla hücre-aracılı bağışıklık tepkilerini negatif düzenlenmesi önemli bir rol oynar -1) 1,2. Tümör hücreleri tarafından B7-H1 aşırı ekspresyonu melanom, glioblastom, ve akciğer, meme, kolon, yumurtalık, böbrek ve hücre karsinomları da dahil olmak üzere insan kanserleri, bir dizi belirtildiği gibi, ve anti-tümör zarar gösterilmiştir T- Hücre bağışıklık 3-8. Son zamanlarda, pankreatik adenokarsinoma dokular tarafından B7-H1 ekspresyonu potansiyel bir prognostik belirteçtir 9,10 olarak tespit edilmiştir. Buna ek olarak, pankreas kanseri, bir fare modelinde, B7-H1 blokajı, bir anti-tümör cevabı 11 üretmek için gösterilmiştir. Bu veriler potansiyel bir terapötik hedef olarak B7-H1 önemini göstermektedir. Anti-B7-H1 blokajı antikorlar nedenle birden çok insan için klinik deneylerle test ediliyormelanom ve akciğer, kolon, böbrek, mide ve pankreas 12 kanserleri dahil olmak üzere solid tümörler. Sonunda tedaviler hedefleme B7-H1 yararlanacak hastaların tespit edebilmek için, bu ifade ve B7-H1 ve B7-H1 blokajı antikorlar ile hastanın tedaviye yanıtı lokalizasyonu arasındaki korelasyonu araştırmak için kritik öneme sahiptir. Immünhistokimya ile insan pankreas adenokarsinomu dokularında B7-H1 ekspresyonu incelenmesi bu co-inhibitör sinyal molekülü tümör mikroçevresindeki antitümör bağışıklık baskılanması nasıl katkıda bulunduğunu daha iyi bir anlayış verecektir. Chen ve arkadaşları tarafından geliştirilen anti-B7-H1 monoklonal antikor (klon 5H1) insan neoplastik doku 4,8 çok tip cryosections güvenilir boyama sonuçları üretmek için gösterilmiştir, ancak parafine gömülü slaytlar leke kadar zor olmuştu Son zamanlarda 13-18. Biz, B7-H1 staini geliştirdikpankreatik adenokarsinoma dokuların parafine gömülü slaytlar için ng protokolü. Burada anlatılan B7-H1 boyama protokolü biraz arka plan ile B7-H1 tutarlı membranöz ve sitoplazmik boyanma üretir. 1. De-parafinization <ol><li> Fırınlama 20 dakika süreyle 55 ° C&#39;de kayar. </li><li> 10 dakika için ksilen içinde bir kimyasal Hood, batırmak kayar. </li><li> 10 dakika için taze ksilen içinde Immerse kayar. </li><li> Daldırın 5 dakika için% 100 etanol içinde kayar. </li><li> Daldırın 5 dk için taze% 100 etanol içinde kayar. </li><li> Daldırın 5 dakika için% 95 etanol içinde kayar. </li><li> Daldırın 5 dakika için% 80 etanol içinde kayar. </li><li> Daldırın 5 dk için deiyonize su içinde kayar. </li></ol> 2. Antigen Retrieval <ol><li> Daha sonra 125 ° C&#39;de 30 saniye için Tris-EDTA tampon maddesi (pH 9.0) ve bir düdüklü tencere içinde sıcaklık, 90 ° C 10 sn için sokmak kayar. </li><li> 60 dakika için slaytlar soğumasını bekleyin. </li><li> 5 dakika TBST yılında batırın slaytlar; repeiki kez. </li></ol> 3. Lekelenme <ol><li> Slaytlarda dokusunun etrafında çözümler siliniz. Hidrofobik bir kalem ile doku etrafında bir çember işaretleyin. </li><li> Bir nem odasında slaytlar yerleştirin ve tüm boyama işlemi boyunca slayt üzerinde doku kurumayı önlemek. 5 dakika peroksidaz blok slayt ve inkübe slaytlar üzerinde hidrofobik daire içinde peroksidaz blok Sıra bir damla (tamamen doku alanı kapsayacak şekilde yaklaşık 200 ul veya daha fazla). </li><li> 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. </li><li> BLOK ACE Yeri bir damla 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe tampon engelleme. </li><li> 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe üzerinde Avidin çözüm yeri bir damla. </li><li> 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe üzerinde Biotin çözüm yeri bir damla. </li><li> Sli durulayınTBST ile des, 5 dakika TBST sonra yer. </li><li> Fare anti-B7-H1 monoklonal antikor seyreltme 1:1,000 (klon 5H1) ya da bir fare IgG1 ile slaytlar inkübe 4 de 200 ul TBST içinde κ izotip kontrol ° C&#39;de 22 saat + / için bir gecede - 1 saat. TBST içinde son antikor konsantrasyonu 2.57 ug / ml &#39;dir. </li><li> 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> 30 dakika boyunca bir 1:500 yoğunlukta bir biyotin konjuge sıçan anti-fare IgG1 ikincil antikor (200 ul% 2 keçi serumu içinde çözelti) ile slaytlar inkübe edin. </li><li> 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> Streptavidin-Biotin Complex Sıra bir damla 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe üzerinde (kullanımdan önce en az 30 dakika hazırlıklı olmalıdır). </li><li> 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> 4 dakika için her slayt ve inkübe üzerinde Amplifikasyon Reaktif Sıra bir damla (TBST ile 02:01 seyreltilmiş). </li><li> T ile slaytlar durulayınBST, 5 dk TBST sonra yer. Iki kez tekrarlayın. </li><li> 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe üzerinde Streptavidin-HRP Yeri bir damla. </li><li> 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> Her bir slayt üzerinde bir 3,3-diaminobenzidin damla (DAB) substrat ve kromojen koyun ve 2 dk için renk geliştirmek. </li><li> Hemen renk geliştirme sonra, 1-2 dakika GKD 2 O ile slaytlar yıkayın. </li><li> 90 sn için hematoksilen bir damla ile slaytlar inkübe edin. </li><li> 1-2 dk GKD 2 O ile yıkayın. </li><li> 1-2 dakika sabunlu musluk suyu ile yıkayın. </li><li> 1-2 dk GKD 2 O ile yıkayın. </li></ol> 4. Dehidrasyon ve Montaj <ol><li> 3 dakika için% 80 etanol içinde slaytlar bırakın. </li><li> 3 dakika boyunca% 95 etanol içinde slaytları daldırın. </li><li> 5 dakika için% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. Tekrarlayın. </li><li> 5 dk için ksilen içinde slaytlar bırakın. Tekrarlayın. </li><li> Bir damla eklemeSlayt ve yer lamel Cytoseal 60. </li></ol> Tablo 1&#39;de, yukarıda anlatılan prosedürlerde kullanılan reaktifler listelenmiştir.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Cryosections B7-H1 immünohistokimyasal boyama Kanseri 3,4 çeşitli önceki çalışmalarda rapor edilmiştir. Bununla birlikte, klinik tümör örnekleri genellikle sadece parafine gömülmüş blok şeklinde kullanılabilir. 5H1 monoklonal antikor daha yakın başarıyla renal hücreli karsinom, serviks kanseri, mesane kanseri ve melanom 13-18 gibi parafin tümör dokularının boyama uygulanmıştır. Parafine gömülü 9,19 veya kriyostat diğer monoklonal antikorlar ile pankreatik adenokarsinoma dokuların 20...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> CSA Sistemi </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> Peroksidaz blok, streptavidin-biotin kompleksi, amplifikasyon reaktifi, streptavidin-HRP ve DAB substrat ve kromojen: Aşağıdaki protokolde belirtilen reaktifler içerir </td></tr><tr><td> Avidin / Biotin Engelleme Kiti </td><td> Vektör </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> Blok ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> Biotin anti-fare IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> Fare IgG1 K izotip kontrol </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBS (salin Tris tamponlu), </td><td> Cellgro </td><td> 46-012-CM </td><td> 10xTBS 80 g / L NaCl ve 24.2 g / L tırlar içerir; Yıkama için ddH2O ile 1X seyreltilir; </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1379 </td><td> 1 ml TBST yapmak için 1X TBS 1 L eklendi </td></tr><tr><td> Hedef Alma, 20x </td><td> Celerus Dalga </td><td> 014-3000-000 </td><td> GKD 2 O ile 1x Seyreltilmiş </td></tr><tr><td> 190 Proof Etil Alkol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Proof Etil Alkol </td><td> PHARMO-Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Ksilen </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoksilen </td><td> Richard-Allan Bilimsel </td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Richard-Allan Bilimsel </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> Nem odası </td><td> Sigma </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Reaktifler ve cihazlar. </td></tr></tbody></table>

pankreas adenokarsinom doku b7-h1 immünohistokimyasal boyanma (pd-l1) parafin slaytlar

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, bağışıklık düzenleyici bir hücre yüzey proteinlerinin B7 ailesinin bir üyesi, (PD programlanmış ölüm-1, reseptörü ile etkileşim yoluyla hücre-aracılı bağışıklık tepkilerini negatif düzenlenmesi önemli bir rol oynar -1) 1,2. Tümör hücreleri tarafından B7-H1 aşırı ekspresyonu melanom, glioblastom, ve akciğer, meme, kolon, yumurtalık, böbrek ve hücre karsinomları da dahil olmak üzere insan kanserleri, bir dizi belirtildiği gibi, ve anti-tümör zarar gösterilmiştir T- Hücre bağışıklık 3-8. Son zamanlarda, pankreatik adenokarsinoma dokular tarafından B7-H1 ekspresyonu potansiyel bir prognostik belirteçtir 9,10 olarak tespit edilmiştir. Buna ek olarak, pankreas kanseri, bir fare modelinde, B7-H1 blokajı, bir anti-tümör cevabı 11 üretmek için gösterilmiştir. Bu veriler potansiyel bir terapötik hedef olarak B7-H1 önemini göstermektedir. Anti-B7-H1 blokajı antikorlar nedenle mul için klinik deneylerle test ediliyormelanom ve akciğer, kolon, böbrek, mide ve pankreas kanserleri de dahil olmak üzere 12 tiplemeleriyle insan solid tümörler. Sonunda tedaviler hedefleme B7-H1 yararlanacak hastaların tespit edebilmek için, bu ifade ve B7-H1 ve B7-H1 blokajı antikorlar ile hastanın tedaviye yanıtı lokalizasyonu arasındaki korelasyonu araştırmak için kritik öneme sahiptir. Immünhistokimya ile insan pankreas adenokarsinomu dokularında B7-H1 ekspresyonu incelenmesi bu co-inhibitör sinyal molekülü tümör mikroçevresindeki antitümör bağışıklık baskılanması nasıl katkıda bulunduğunu daha iyi bir anlayış verecektir. Chen ve arkadaşları tarafından geliştirilen anti-B7-H1 monoklonal antikor (klon 5H1) insan neoplastik doku 4,8 çok tip cryosections güvenilir boyama sonuçları üretmek için gösterilmiştir, ancak parafine gömülü slaytlar leke kadar zor olmuştu Son zamanlarda 13-18. Biz dev varpankreatik adenokarsinoma dokuların parafine gömülü slaytlar için kaçtı B7-H1 boyama protokolü. Burada anlatılan B7-H1 boyama protokolü biraz arka plan ile B7-H1 tutarlı membranöz ve sitoplazmik boyanma üretir.

B7-H1 başarılı immunhistokimyasal pankreatik adenokarsinoma B7-H1 (kahverengi işaretleri DAB renk geliştirilmesi) heterojen ifadesi gösterecektir. Diğerleri B7-H1 veya B7-H1 (Şekil 2 ve 3) az ifade ya ağırlıklı sitoplazmik ifade var ancak bazı pankreatik adenokarsinoma hücreleri B7-H1 ağırlıklı membranöz ekspresyonu (Şekil 1A) var. Normal pankreatik kanal epitel (Şekil 4) B7-H1 biraz ifade eder. Bir fare IgG1 κ izotip kontrol antikor ile lekelenmesi yerine anti-B7-H1 an...

B7-H1 (PD-L1) ve PD-1 olarak bağlayıcı tümörün mikroçevresindeki önemli bir tümör kaynaklı immünsüpresif sinyal verin. Ifade ve pankreatik adenokarsinoma B7-H1 lokalizasyonu karakterize etmek için immünohistokimyasal boyama tekniği burada tanımlanmıştır.

Pankreas Adenokarsinom Doku B7-H1 immünohistokimyasal boyanma (PD-L1) parafin Slaytlar

İmmün düzenleyici hücre yüzeyi proteinlerinin B7 ailesinin bir üyesi olan B7-H1/PD-L1, hücre aracılı ...'nın negatif regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, insan pankreas adenokarsinom dokusunun parafin kesitlerinde B seven H one PD L one ekspresyonunu değerlendirmek için immünohistokimyasal boyama tekniklerini kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle dilimlenmiş doku kesitlerinden parafinin uzaklaştırılması ve dokuların yeniden hidrate edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, dokuyu boyamak için bir düdüklü tencere kullanımını içeren antijen geri kazanımıdır.Antikor boyama prosedürünü, sinyal amplifikasyonu ve DAB renk geliştirme basamakları takip eder. Son aşamalar ise dokununy dehydrasyonu ve lam üzerine montajıdır. İşlem tamamlandığında.Mikroskopi ve görüntü analizi, membranöz ve sitoplazmik B7-H1'i görselleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, B7-H1'in tümör mikroçevresinde anti-tümör immünitesinin baskılanmasına nasıl katk sağdığına dair daha iyi bir anlayış sunarak, pankreatik endokrinom çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin kriyoseksiyonlar üzerindeki boyama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genellikle daha kolay temin edilen ve daha rahat saklanan parafin gömülü doku kesitlerinin kullanımı için optimize edilmiş olmasıdır.Parafin önceden uzaklaştırılmadan lamlar üzerinde güvenilir antikor boyama yapılamaz. Bu nedenle, parafine gömülmüş dokularla lamları hazırlamak için, önce lamları 55 °C'de 20 dakika boyunca fırınlayın. Ardından, bir kimyasal çeker ocakta, parafini uzaklaştırmak için yedi ardışık kimyasal banyo kullanılır; ilk olarak lamları 10 dakika boyunca ksilen içinde bekletin.Ardından, lamları 10 dakika boyunca ikinci bir taze ksilen banyosuna daldırın. Üçüncü olarak, lamları beş dakika boyunca %100 etanol içinde bekletin. Dördüncü olarak, lamları bir kez daha taze %100 etanol içinde beş dakika boyunca bekletin.Beşinci olarak, lamları beş dakika boyunca %95 etanol içinde bekletin. Altıncı olarak, lamları beş dakika boyunca %80 etanol içinde bekletin. Son olarak, lamları beş dakika boyunca deiyonize su ile yıkayarak temizleyin.Parafin uzaklaştırıldıktan sonra, bir sonraki adım olarak antijenin erişilebilir hale getirilmesi gerekir. Öncelikle, lamları Tris EDTA tamponuna daldırın. Ardından lamları, iki aşamalı bir programla düdüklü tencerede ısıtın.İlk olarak, lamları 125 °C'de 30 saniye boyunca ısıtın. İkinci olarak, 90 °C'de 10 saniye boyunca ısıtın. Ardından, lamları oda sıcaklığına soğumaları için kenara ayırın.Lamların bir saat boyunca soğumasını bekledikten sonra, lamları her banyoda beş dakika olmak üzere iki kez TBST ile yıkayın. Lamlar artık boyanabilir. İşleme, dokunun etrafındaki TBST solüsyonunu emici kâğıtla kurulayarak ve ardından dokunun etrafını hidrofobik bir kalemle daire içine alarak başlayın.Bu prosedür boyunca, lamları nemlendirilmiş bir oda içerisinde tutarak dokunun kurumasını önleyin. Banyo yapılmadığı zamanlarda, lam üzerindeki hidrofobik dairenin içerisine bir damla peroksidaz blok yerleştirin. Beş dakika bekleyin ve peroksidazı TBST ile durulayın.Ardından lamları beş dakika boyunca TBST içinde bekletin. Lamları çözeltiden çıkarın ve fazla TBST'yi nazikçe silkeleyerek uzaklaştırın. Şimdi her lamın üzerine bir damla CE bloklama tamponu damlatın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Lamları bir durulama işlemiyle ve beş dakikalık bir TBST banyosuyla temizleyin. Ardından, her lamın üzerine bir damla Vidan solüsyonu damlatın ve 15 dakika bekleyin. AVADON'u aynı TBST durulama ve banyo rejimiyle uzaklaştırın.Şimdi biotin uygulayın. Beş dakika bekleyin ve lamları tekrar TBST ile temizleyin. Ardından lamları, fare monoklonal antikorunun veya bir kontrol antikorunun seyreltilmiş çözeltisi ile inkübe edin.Antikorların konjuge olması için TBST içerisinde dört derece sıcaklıkta 22 saat bekletin. Ertesi gün, lamları daha önce olduğu gibi üç kez TBST ile yıkayın. Her yıkama işlemi, TBST ile durulamayı ve beş dakikalık bir banyoyu içerir.Primer antikoru yıkarken bu üçlü yıkama rejimi ilerleyen aşamalarda birkaç kez tekrarlanır. STR titin Bio ITIN kompleks çözeltisini hazırlayın. Bu çözelti, kullanılmadan en az 30 dakika önce hazırlanmalıdır.Şimdi lamları, keçi serumu çözeltisi içindeki biyotin konjugatlı keçi anti-US sekonder antikoru ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında, DAB substrat KROMOJEN çözeltisini hazırlamak için DACO kit talimatlarını izleyin. Çözelti, karanlıkta dört derecede sekiz saate kadar saklanabilir.İnkübasyonun ardından, TBST ile üç kez yıkama işlemi gerçekleştirin. Ardından, her bir lamın üzerine bir damla strippin biotin kompleksi damlatın. Lamları 15 dakika boyunca inkübe edin ve sonrasında lamları TBST ile üç kez yıkayın.Ardından, her lamın üzerine bir damla amplifikasyon reaktifi uygulayın. Dört dakika bekleyin ve lamları üç kez TBST ile yıkayın. Amplifikasyon reaktifi yıkandıktan sonra, her lama bir damla streptavidin HRP ekleyin ve 15 dakika inkübe edin.Devam etmeden önce bir kez daha üçlü TBST yıkaması yapın. Şimdi prosedürün en hassas adımı gelmektedir. Bir lama, substrat hidrojen peroksit içeren bir damla DAB substrat KROMOJEN ekleyin ve renk gelişimini gözlemlemeye başlayın, DAB substratı.KROMOJEN geliştirme süresi tipik olarak iki dakikadır, ancak optimal boyanmayı sağlamak için geliştirmeyi rutin olarak mikroskop altında izleriz. Her boyama döngüsünde minimum arka plan elde etmek için, pozitif kontrollerimiz olarak önceki bir seriden bir lam ve bir tonsil lamı ekleriz. İşlem tamamlandığında, lamı TBST ile değil, derhal su ile yıkayın.Lamı bir damla hematin ile 90 saniye boyunca inkübe edin. Lamı hemen önce distile deiyonize suyla, ardından sabunlu musluk suyuyla ve son olarak tekrar DD suyla yıkayın. Bu işlemle boyama prosedürü tamamlanmış olur.Tüm lamlar boyandıktan sonra, lamları monte etmeden önce onları susuzlaştırmak için bir etanol serisi kullanın. İlk olarak, lamları üç dakika boyunca %80 etanol içinde bekletin. İkinci olarak, lamları üç dakika boyunca %95 etanol içinde bekletin.Üçüncü ve dördüncü banyolar için slaytları beş dakika boyunca %100 etanol içinde bekletin. Beşinci ve altıncı banyolarda, slaytları beş dakika boyunca ksilen içinde bekletin. Son olarak, her slayta bir damla miktar ekleyin ve bir lamın üzerine kapatma camını nazikçe yerleştirin.Lamlar artık B7-H1 ile mikroskobik immünohistokimyasal boyamaya hazırdır; bu işlem pankreatik adenokarsinomda B7-H1'in heterojen ekspresyonunu göstermiştir. DAB renk geliştirme ile kahverengi olarak görülürler. Bazı pankreatik adenokarsinom hücreleri ağırlıklı olarak membranöz B7-H1 ekspresyonuna sahipken, diğerleri ya ağırlıklı olarak sitoplazmik B7-H1 ekspresyonuna sahiptir ya da çok az B7-H1 ekspresyonu gösterir; normal pankreas kanal epiteli çok az B7-H1 eksprese etmiştir. Anti B7-H1 antikoru yerine fare IgG1 kappa izotip kontrol antikoru ile boyama yapıldığında çok az arka plan boyanması oluşmuştur. Bu teknik bir kez öğrenildiğinde, uygun şekilde uygulandığında 22 saatlik gece boyunca inkübasyon ile iki güne yayılmış yedi saatte gerçekleştirilebilir.Bu teknik, onkoloji alanındaki araştırmacıların diğer malignitelerde B7-H1/PD-L1 sinyal iletimini araştırmalarının önünü açmıştır.

immunohistochemical-staining-b7-h1-pd-l1-on-paraffin-embedded-slides

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video hematoksilen ve eosin (H &amp; E) ve immunohistokimyasal (İHK) kullanarak insan pankreas adacık karakterizasyonu için prosedürleri göstermektedir. Baş, gövde ve kuyruk bölgelerinden Pankreas bölümleri adacık endokrin kompozisyon (insülin, glukagon ve pankreatik polipeptit), hücre çoğaltma (Ki67) ve inflamatuar infiltrasyon (H &amp; E, CD3) belirlemek için H &amp; E ve İHK her ikisi tarafından boyanmış. Unsinat bölge pankreatik polipeptid için İHK kullanarak yerelleştirilmiştir.

İnsan Pankreas Adacıklar için boyama Protokoller

Burada, yöntemleri temizleyerek bir en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı üç boyutlu (3D) kullanarak görüntü insan pankreas bölümlerine pasif mevcut. Bu el yazması insan adacıkları innerve otonomik ve duyusal sinir ağları temel unsurları belirlemek için boyama birden çok ayirt tarafından takip pasif optik takas için bu yordamları gösterir.

İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Fare orthotopic PDAC homografts immunophenotyping deneysel ameliyat tümör IMMUNO-microenvironment profil oluşturma amaçlamaktadır. Tümör ameliyat ile implante orthotopically vardır. Tümör boyutu 200-600 mm3 hasat ve tek hücreli süspansiyonlar, çok bağışıklık marker FACS analizi farklı fluorescently etiketli antikorlar tarafından takip hazırlamak için ayrışmış.

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Ex vivo pankreas adacık çalışmalar diyabet araştırma için önemlidir. Onların yerli 3 boyutlu mimari kültürlü adacıkları çalışmaya varolan zaman alıcı, verimsiz ve az kullanılan tekniklerdir. Bu eser bütün kültürlü adacıkları yüksek kalitede parafin bölümleri oluşturmak için yeni, basit ve etkili bir yöntem açıklanır.

Pankreas adacık parafin kesitler için katıştırma

Detaylı bir iletişim kuralı için bir altı-marker multiplex ayirt panel en iyi duruma getirilmiş ve gerçekleştirilen, daha tutarlı sonuçlar ve daha kısa işlem süresi için bir otomatik stainer kullanarak. Bu yaklaşım doğrudan IMMUNO-Onkoloji araştırmalar amaçlı herhangi bir laboratuvar tarafından adapte edilebilir.

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Burada, biz meme kanseri hücrelerinin basit, daha az invaziv ve ele kolay bir şekilde meme yağ yastığı içine implant için bir protokol mevcut ve bu fare orthotopic meme kanseri model uygun meme yağ yastığı yapısına sahip çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir kanser.

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

In vivo immünfloresans lokalizasyonu (IVIL) yöntemi, in vivo tümör hedeflemesi ve ekzo immünboyama kombinasyonu nu kullanarak canlı organizmalarda onkolojik amaçlarla antikor ve antikor konjugatörlerinin in vivo biyodağılımını incelemek için kullanılabilir. Yöntemler.

Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Bu deneysel protokol, esas olarak tek kanallı antikor inkübasyon koşullarını optimize ederek ve klinik kökenli akciğer kanseri dokularında otofloresan ve kanal karışma problemlerini çözmek için antikorların ve kanalların ayarlarını ayarlayarak bir multipleks immünohistokimya (IHC) boyama yöntemini tanımlar ve optimize eder.

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya

Prostat kanseri başlangıcı, yeni ve yenilikçi insan model sistemler ve yaklaşımlar altında yatan en erken moleküler mekanizmaları umutsuzca ihtiyaç vardır çözülmeye. Insan prostat epitel oluşturmak için pluripotent kök hücre popülasyonlarının ikna etmek için önceden prostat ürogenital sinüs mezenşimin (UGSM) potansiyel prostat araştırma güçlü deneysel bir araçtır.

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Öğrenin pankreas adenokarsinom dokusunda B7-H1 (PD-L1) immünohistokimyasal boyama tekniğini. Parafin kesitlerde antijen geri kazanımı ve DAB renk gelişimi ile immünoterapi stratejileri için tümör mikroçevresini analiz edin.

Pankreas Adenokarsinom Doku B7-H1 immünohistokimyasal boyanma (PD-L1) parafin Slaytlar

Daha fazla video keşfet