Bağırsak Manipülasyon bir Standart Model Analizleri: Kemirgenler Barsak Motilite ve Gut Duvar İnflamasyon İşlevsel Değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, bir kemirgen modelinde postoperatif ileusun gelişimini ve çözülmesini incelemek için intestinal manipülasyon gerçekleştirmektir; bu, iki nemli pamuklu aplikatör arasında ince bağırsağın standart manipülasyonu ile sağlanır. Ardından, postoperatif motiliteyi ölçmek için gastrointestinal ve kolonik transit analiz edilir. Daha sonra, inflamasyon seviyelerini incelemek amacıyla ince bağırsak muscularis externa'sının histokimyasal analizi ve organ kültürü gerçekleştirilir.

Nötrofil granülositlerin me'ye güçlü bir şekilde infiltre olduğunu ve me kültürlerinde aşırı nitrik oksit üretimi gerçekleştiğini, bunun da gastrointestinal ve kolonik transit sürelerinde gecikmelere yol açtığını gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu yöntem, postoperatif ileus gelişimine ve çözümüne dair temel soruların yanıtlanmasına, ayrıca potansiyel profilaksi veya tedavilerin araştırılmasına yardımcı olabilir. Prosedürü laboratuvarımızdan teknisyen Mario Lewison gösterecektir. Erkek bir fareye oksijen içinde %0,8 ila %1 isoflurane uyguladıktan sonra, hayvanı sırtüstü pozisyona getirin ve ekstremiteleri sabitlemek için yapışkan bant kullanın.

Derin sedasyonu test etmek için hafif bir ağrı stimülasyonu uygulayın. Ardından, iki santimetre uzunluğunda bir median laparotomi gerçekleştirin. Sonrasında, karnı açık tutmak için iki adet steril ekartör yerleştirin ve ince bağırsağı dikkatlice sola doğru dışarı çıkararak ıslak pamuklu gazlı bez üzerine yerleştirin.

İki adet nemli pamuklu aplikatör kullanarak, aplikatörleri pori'den sekuma doğru eş zamanlı olarak yuvarlayarak tüm ince bağırsağın lüminal içeriğini boşaltın. İskemi veya mekanik obstrüksiyonu önlemek için bağırsağı bükmeden periton boşluğuna geri yerleştirin ve iki kat sürekli 5.0 poliamid emilmeyen sütürler kullanarak kapatın. Abdominal insizyonu kapatın.

Hayvanı bir ısıtıcı lambanın altına yerleştirin ve anesteziden ayılana kadar gözlemleyin. Ardından fareyi kafesine geri koyun ve yiyecek ile suya erişimini sağlayın. Ertesi gün.

Fare tamamen anestezi edildikten sonra, başını dikkatlice hiperekstansiyona getirin ve dili dışarı çekmek için küt uçlu pens kullanın; bir mililitrelik şırıngayı en az 100 µL floresein işaretli dekstran ile doldurun. Şırıngayı bir arter kateterine bağlayın ve kateteri bir gastrik tüp olarak dikkatlice mideye yerleştirin. 100 µL FITC dekstranı hızlıca enjekte edin ve kateteri geri çekin.

Hayvanın kendisini toplamasına izin verin ve 90 dakika bekleyin. 90 dakikanın ardından fareyi ötanize edin ve mide ile rektum arasındaki tüm gastrointestinal sistemi çıkarın. İnce bağırsakları, germemeye dikkat ederek bir polistiren ped üzerine yerleştirin.

Ardından, ince bağırsağın ve kolonun toplam uzunluğunu ölçün. Bağırsağı polistiren pede sabitlemek için kanüller kullanın. İnce bağırsağı 10 eşit segmente, kolonu ise üç eşit segmente ayırın.

Bağırsak belirlenen noktalardan kesildikten sonra, bölümleri bir mililitre Krebs-Henseleit bikarbonat tamponu (KHB) ile bir kez yıkayın. Bölümleri ardışık olarak etiketlenmiş iki mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri güçlü bir şekilde vorteksleyip santrifüjleyin. Ardından süpernatantı temiz, numaralandırılmış 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.

Analize kadar dört derece Celsius'ta karanlıkta saklayın. Ardından pipetleme işlemini gerçekleştirin. Her bir süpernatanttan yüz mikrolitrelik duble alikotları siyah 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve hayvanı haftalık olarak anesteziye aldıktan sonra kolonik transit süresini kontrol etmek için plakayı bir floresan okuyucu ile okuyun.

Bir fistül yerleştirerek kolon açıklığını dikkatle inceleyin. Prob yardımıyla anüsten kolona doğru ilerleyin. Kolonun üç santimetre içine iki milimetrelik bir cam küre yerleştirin ve probu çıkarın.

Hemen bir zamanlayıcıyı başlatın. Fareyi şeffaf bir kafese yerleştirin ve topun dışarı atılması için geçen süreyi izleyin. Orta kolon örneklerinin histokimyasal analizi için.

Bağırsaktan doku segmentleri kestikten ve bunları silikon dolgulu bir kapta soğuk KHB içine daldırdıktan sonra, mezenteri kaba sabitlemek için böcek iğneleri kullanın. Segmentleri mezenterik sınırı boyunca kesin ve dokuyu uzunluğunun ve genişliğinin %120'sine kadar gerin. Mezenterden başlayarak dokuyu iğnelerle mekanik olarak sabitleyin.

Muscularis externayı veya me'yi tunica mucosa'dan ayırın. Örnekleri, kültüre yönelik bu protokolün yazılı kısmına göre tespit edin ve boyayın. Me.

Bağırsak manipülasyon prosedüründen 24 saat sonra, ince bağırsağın tamamını rezeke edin ve penisilin G ve streptomisin içeren soğuk KHB içine yerleştirin. Bağırsağı üç santimetrelik uzunluklarda kesin ve her bir segmenti ince makaslar kullanarak silikon kaplı bir cam lam üzerine iğneleyin. Mezenteri çıkarın ve bağırsağı keskin penslerle bir nodding iğne üzerine kaydırın.

Nemli bir pamuklu aplikatör kullanarak ME'yi nazikçe kaldırın. Onu submukozadan sıyırın ve soğuk KHB artı PS içerisine yerleştirin. Ardından, ME şeritlerini iki ila dört milimetrelik parçalar halinde kesin ve 30 dakika boyunca buz gibi soğuk KHB artı PS içerisinde inkübe edin. Örneği birkaç kez durulayın.

Ardından, yaklaşık 50 ila 60 mg dokuyu, 500 µL DMEM içeren steril bir 24 kuyucuklu plakaya aktarın. Dokuyu 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında 24 saat inkübe edin. Süpernatantı toplayın ve 1000 RCF'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, sitokin veya nitrik oksit ölçümleri için örneği sıvı azot içinde şoklayarak dondurun. Son olarak, temiz bir kağıt mendil yardımıyla kas dokusunu 30 saniye boyunca kurulayın ve ardından tartın. Postoperatif ileusun şiddetini değerlendirmek için en önemli parametre, gastrointestinal transitin (GIT) in vivo olarak incelenmesidir.

Bu şekil, ameliyattan 24 saat sonra tedavi edilmemiş kontrollerde ve intestinal manipülasyon uygulanmış farelerde FITC dekstranın gastrointestinal yol boyunca tipik dağılımını göstermektedir. Burada görüldüğü üzere, sham operasyon yapılan hayvanlar, geometrik merkezi sekumda hesaplanan normal bir GİT göstermiştir. Im, proksimal jejunumda GİT'te belirgin bir gecikmeye yol açarken, cam küre kullanılarak yapılan kolonik motilite analizinde, sham operasyon yapılan fareler küreyi 48 ila 200 saniye içinde dışarı atmış, Im ise inflamasyonu ölçmek için ekskresyon süresini 470 ila 775 saniyeye uzatmıştır.

ME içindeki lökosit seviyeleri, burada görüldüğü gibi histokimya veya immünohistokimya kullanılarak analiz edildi. Kontrol farelerinde az sayıda polimorfnükleer nötrofil gözlemlenirken, ince bağırsak inflamasyonu bunların güçlü infiltrasyonuna yol açtı. Hücrelerden salınan birçok inflamatuar mediyatörün dokuda tespit edilmesi zordur.

Lizat organ kültürleri, kültürdeki inflamatuar belirteçlerin saptanmasına olanak tanır. Süpernatant, POI'de temsilci bir medyatör olan ve gastrointestinal sistemde temel bir inhibitör nörotransmitter olan nitrik oksittir veya nno'dur. Bu şekil, me içerisinde nno'nun saptanamadığını göstermektedir.

Organ kültürü, kontrol süpernatantları ve sham ameliyatı yapılan farelerde bazal nno seviyeleri gözlemlendi. Buna karşılık, intestinal manipülasyon uygulanmış farelerin kültürleri, 24 saatlik inkübasyonun ardından anlamlı derecede daha fazla nno üretti. Bu intestinal manipülasyon tekniği, doğru şekilde uygulandığında 15 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, farelerde postoperatif ileusun nasıl indükleneceği ve şiddetinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.