Sıralama Kök Hücre Tahliller ve Akış Primer Beyin Tümörü Doku İşleme

Bu prosedürün genel amacı, beyin tümörünü başlatan hücreleri in vitro olarak incelemektir. Bu, önce birincil insan tümörlerinin mekanik ve enzimatik olarak ayrıştırılması ve ardından kök hücre serumsuz kültür koşullarında kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki küre oluşumu üç ila beş gün boyunca izlenir.

Tümör küreleri daha sonra tekrar enzimatik olarak sindirilir ve yüzey belirteçleri akış sitometrisi ile değerlendirilir. Son adım, daha fazla karakterizasyon için istenen hücreleri 96 oyuklu plakalara veya PL ızgara slaytlarına ayırmaktır. Sonuç olarak, sıralanan popülasyonun kendi kendini yenileme yeteneği ve diferansiyel gen ekspresyonu, seyreltme analizi ve tek hücreli R-T-P-C-R sınırlandırılarak değerlendirilebilir.

Bu tekniğin toplu tümör analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, beyin tümörünü başlatan hücre veya kanser kök hücre popülasyonlarını prospektif olarak izole etmesidir. Bu yöntem fikri ilk olarak, orijinal olarak normal nöral kök hücreler için kullanılan kültür koşullarını çeşitli insan beyin tümörlerine uyguladığımızda aklımıza geldi ve prosedürü gösteren kök hücre benzeri popülasyonlar için özel olarak seçilen bu kültür yönteminin, doktora sonrası araştırma görevlisi CHITRA AL yüksek lisans öğrencileri Bran Van Manen ve Sarah Nolte olacağını bulduk. ve akış sitometrisi teknisyenimiz Nicole McFarland, hepsi laboratuvarımızdan 15 mililitre yapay beyin omurilik sıvısına veya A BOS'a 200 mikrolitre çözülme liase ekleyerek ve ardından tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirerek başlayın. Bu sırada amonyum klorür çözeltisini de oda sıcaklığına getirin.

Daha sonra beş mililitre A BOS'ta beyin tümörü dokusunun örnek kabına, durulamak için kabı döndürün ve ardından kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için sıvıdan sıkın. Şimdi dokuyu steril 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve dokuyu bulamaç kıvamına getirmek için ince makas ve forseps kullanın. Daha sonra numuneyi 10 mililitrelik normal bir pipet ve forseps kullanarak toplayın ve doku parçalarını ön ısıtma A BOS içeren tüpe aktarın.

Liease ile tüpü 30 RPM ve 37 santigrat derecede bir inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin. Ve 15 dakika sonra, doku lizatını yedi D mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Süzüntüyü oda sıcaklığında 280 GS'de beş dakika döndürün.

Ardından snat'ı dikkatlice çıkarın ve elde edilen peletin boyutunu ve rengini değerlendirin. Daha sonra, peleti bir mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve ardından pelet boyutuna ve kırmızı hücre kontaminasyonuna bağlı olarak uygun miktarda amonyum klorür çözeltisi ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, PBS'de ikinci bir yıkamadan sonra hücreleri döndürün, peleti beş mililitre nöro kök hücre tam ortamında yeniden süspanse edin ve ardından hücre süspansiyonunu ilk birkaç gün için ultra düşük bağlayıcı 60 milimetrelik bir doku kültürü plakasına aktarın.

Kültürleri gerektiği kadar bir ila iki mililitre ortamla doldurun, ortamı yalnızca renk hafif sarıya döndüğünde değiştirin. Tümör kürecik kültürünü 15 mililitrelik konik bir tüpe aktararak başlayın. Plakayı iyice durulamak için iki ila üç mililitre steril PBS ekleyin ve ardından yıkamayı tümör tükürü tüpüne ekleyin.

Hücreleri döndürdükten sonra, snat'ı çıkarın ve peleti bir ila iki mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin ve ardından 10 mikrolitre liase ekleyin. Bu tekniğin bir zorluğu, işleme sırasında katı tümör kök hücrelerinin canlılığını korumaktır. Kültürleme ve sasyon sırasında hücrelerin herhangi bir manipülasyonu, hafif bir dokunuş gerektirir.

Ardından, tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe edin. Üç dakika sonra süspansiyonu çıkarın ve görsel olarak değerlendirin. Birden fazla küme görülürse, hücre kümesini nazikçe yinelemek için 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.

Şimdi hücreleri beş mililitre steril PBS'de yıkayın ve ardından S süpernatanını çıkardıktan sonra, peleti 500 ila 1000 mikrolitre steril PBS artı iki milimolar EDTA içinde yeniden süspanse edin. Son olarak, Trian mavisini kullanarak hücre sayısını ve canlılığını değerlendirdikten sonra, hücre sayısını PBS artı EDTA'da mililitre başına 1 milyon hücreye ayarlayın. Test başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu ayrı ayrı 12 x 75 milimetre akış tüplerine aktararak başlayın.

Uygun antikorları ekledikten sonra, numuneleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, ardından bağlanmamış antikorları tüp başına iki mililitre PBS artı EDTA içinde yıkayın. Şimdi yıkama solüsyonunu boşaltın, tüpleri kurulayın ve ardından hücre peletlerini 300 mikrolitre daha PBS artı EDTA'da yeniden süspanse edin. Daha sonra her tüpe yedi AAD canlılık boyasından 10 mikrolitre ekleyin.

Tüpler buz üzerinde en az 15 dakika inkübe edildikten sonra hücreler akış sitometrik analizi için hazır hale gelir. İleri ve yan dağılım parametrelerini ayarlamak için negatif kontrol örneğini kullandıktan sonra, ilgilenilen hücrelerin etrafına bu temsili üst grafikte gösterilene benzer bir bölge çizin. Negatif hücreleri ilk yirmi yıl içinde yerleştirmek için kullanılan floresan dedektörlerindeki voltajı gerektiği gibi ayarlayın.

Daha sonra, bu temsili üst grafikte gösterilen bölgeye benzer ölü hücrelerin dışlanması için ikinci bir bölge oluşturmak için canlılık boyası yedi A a d kullanın. Ardından, tüm floresan grafiklerine hem saçılma hem de canlı hücre kapılarını uygulayın ve herhangi bir spektral örtüşmeyi çıkarmak için tek boyalı kontrolleri kullanın. Son olarak örnekleri çalıştırın.

Sınırlayıcı seyreltme testine, kuyu başına tek bir hücreye değişen seyreltmede ayrışmış hücreleri, genellikle yedi günlük bir süre boyunca oluşan 200 mikrolitre NSC ortam nöroküresi içeren 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına ayırarak başlayın ve kültürde son yedi gün içinde müteakip küre oluşumunun hızı, tek hücreli R-T-P-C-R için hesaplanabilir. İlgilenilen popülasyonlardan tek hücreleri geniş bir ızgara slaytının reaksiyon bölgelerine ayırdıktan sonra, her reaksiyon bölgesinin merkezine bir mikrolitre ana karışım ekleyin ve ardından her bölgeyi hemen beş mikrolitre tavan çözeltisi ile kaplayın. Ardından, çok hızlı bir slayt döngüleyici kullanarak, slaytı üç sıcaklık döngüsü için inkübe edin.

Ters transkripsiyondan sonra, her reaksiyon bölgesine üç mikrolitre DN a'nın rase içermeyen suyu ekleyin. Daha sonra tüm karışımı her reaksiyon bölgesinden ayrı PCR tüplerine aktarın. Son olarak, gerçek zamanlı ölçüm için numuneleri bir BioRad döngüleyicide çalıştırın.

Bu ilk şekil, glioblastomlu temsili bir hastanın manyetik rezonans görüntüleme taramasını göstermektedir. Ayrışmış tümör hücreleri, nöral yüzey kök hücre belirteçleri, CD 1 33 ve CD 15 ile etiketlenebilir ve bu temsili nokta grafiğinde gösterildiği gibi akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Burada, temsili tek hücreli RTPCR reaksiyonu için amplifikasyon grafiği gösterilmektedir.

Böyle bir çizimden elde edilen CT değerleri, ilgilenilen genlerin nispi ekspresyon seviyelerini hesaplamak için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kök hücre popülasyonlarını zenginleştirmek için birincil beyin tümörü dokusunun enzimatik olarak nasıl ayrıştırılacağını ve kültürleneceğini iyi anlamalısınız. Ayrıca, sınırlayıcı seyreltme analizi veya tek hücreli R-T-P-C-R gerçekleştirerek sıralanmış kök hücre popülasyonlarının kendini yenileme yeteneğini ve diferansiyel gen ekspresyonunu nasıl inceleyeceğinizi de bileceksiniz.