Name: Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Öğrenin, DISC1 protein agregatlarının üretimi ve saflaştırılması yöntemlerini. Bu teknikler, hücre içine invazyon yeteneğini değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanarak nörobiyoloji araştırmalarında uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Düsseldorf Üniversitesi Tıp Fakültesi Forschungskommission bir hibe ile desteklenen CKVB için; Bu çalışma CK ve JPH, DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) için NÖRON-Eranet keşfet (BMBF 01EW1003) tarafından finanse edildi.

1. Aggresome Donör Hücre Hazırlanması: Monomerik Kırmızı Floresan Protein (MRFP) veya Gelişmiş Yeşil floresan proteini (eGFP) etiketli İnsan Tam Boy (FL) DISC1 transfeksiyonu <ol><li> Tohum 1.5 x 10 6/10 cm çanak insan nöroblastom NLF (NSG, Philadelphia Çocuk Hastanesi, Philadelphia) on 10 cm yemekleri hücreleri ve gecede büyümek. NLF hücreleri% 10 ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde kültürlenmiştir FBS, penisilin / Strepomycin, L-Glutamin. Ertesi gün hücreler,% 70-80 konfluense olmalıdır. </li><li> Geçici olarak 15 ug plasmid DNA ile Metafectene transfeksiyon reaktifi (Biontex, Martinsried, Almanya) ile her biri 10 cm tabak transfekte. Kısaca, 10 cm tabak için, 15 ug plazmid DNA ve 30 ul Metafectene, 750 ul Opti-MEM ile karıştırılmış ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. 5 yemekleri pcDNA3.1 MRFP / eGFP-plazmid ile yalnız eGFP etiketli insan (FL) DISC1 ve 5 yemekleri ile transfekte edildi. </li></ol> 2. AggresomeTransfekte Donör Hücrelerden Arındırma Burada açıklanan protokol beyin dokusunda 13 ve büyük agrega ve aggresomes 14 yalıtmak için bir protokol Lewy-Oluşumu arındırmak için bir yöntem bir kombinasyonudur. Zaten mevcut olan yöntemler deterjan kullanımı, hücre-invaziv deneylerde uygulama için deterjan içermeyen protein izolasyon dayandığı için kritik önem taşır. <ol><li> Transfeksiyondan 48 saat sonra, eGFP ve mRFP/eGFP-DISC1 ifade izlemek ve flöresanlı bir mikroskop (Şekil 1) altında aggresomes oluşumu teyit. </li><li> 1X Proteaz önleyici kokteyl eklemek (Roche, Indianapolis, IN) ile bir Precellys24 homojenizör (Bertin teknolojiler, Fransa) kullanılarak hücrelerin bozmak, PBS pH 7.4, 400 ul PBS ile her bir kazıma ile yıkayın hücrelerini. Kısaca, bir 2 ml parçalama tüp 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin ve 10 seramik boncuklar ilave edin. 3 x 60 sn darbeleri ile hücrelerin parçalayıcı. Sürecin mekanik kuvvet olabilir37 Yukarıdaki örnek içindeki sıcaklık artışı ° C nedenle bakım lizis işleminden sonra buz üzerinde örnek chill alınmalıdır. </li><li> Buz üzerinde soğutulur ve 37 hücreleri, 60 dakika boyunca 10 mM MgCl2, 40 U / ml DNase A ve inkübe ° C ekleyin </li><li> % 80 çözeltileri,% 50, PBS, pH 7.4 (10 ml her biri) içinde% 20 sakaroz (w / v) hazırlayın. </li><li> En az% 50,% 20, ardından 2 ml% 80 sakaroz ile başlayarak, bir 15 ml tüp içinde şahin sakaroz eğim hazırlayın. Yavaş degrade dökün ve zaten döktü katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun. 4 at Katman 1000 xg&#39;de 15 dakika degrade ve santrifüj üstüne sindirilmiş lizat ° C. </li><li> Dikkatlice PBS pH 7.4 5 ciltlik bir pipet ve karışımı ile% 50-80 sakkaroz katmanı arasındaki interfaz toplamak. 4 ° C&#39;de 1000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüje Iki ek kat çamaşır tekrarlayın. Bu interfaz yılında aggresomes floresan ve UV ışık altında bir mikroskop gözlenebilir. </li><li> Süpernatantı atın ve250-500 ul PBS pH 7.4 içinde pelet tekrar süspansiyon. Bu topak saflaştırılmış aggresomes (Şekil 2) içerir. </li></ol> 3. MRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes ile Alıcı SH-SY5Y Hücreleri Tedavisi <ol><li> Tohum 5 x 10 4 alıcı SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde yapısal bir 24 de plakanın her steril cam lameller üzerine GFP-DISC1 (598-854) ifade. SH-SY5Y hücre Penisilin / Streptomisin, non-esansiyel amino asitler (NEAA) ve% 10 FBS ile takviye DMEM/F-12 ortamında kültüre edilir. </li><li> 24 saat sonra, her bir kuyunun 10 ul ekleyin ve 48-72 saat süreyle inkübe edin. </li><li> PBS pH 7.4 ile 3 x hücreler yıkanır ve 5 dakika için% 0.04 &#39;Tripan Mavisi ile hücre dışı floresan gidermek. </li><li> Buz üzerinde 10 dakika süreyle PBS pH 7.4 &#39;de% 4 PFA ile hücreleri saptamak, DAPI montaj orta (Invitrogen, ABD) ile Altın uzattığı steril H 2 O ile bir kez yıkayın ve cam slaytlar lamelleri monte edin. </li><li> / Alımını onaylaZ-yığın görüntülerde alıcı hücreler tarafından eksprese işe proteinleri ile kolokalizasyon tarafından dışarıdan uygulanan aggresomes işgali. </li></ol> Ancak, eksojen protein alımını / işgali aslında konak hücrenin protein alımı ile paralel olarak tespit edilemeyebilir. Bizim örneğimizde MRFP etiketli DISC1 aggresomes işe çözünebilir GFP etiketli DISC1 (598-854) konak hücre (bkz. Şekil 3) tarafından ifade edilmiş protein. Resimleri bir Zeiss LSM 510 konfokal-veya Zeiss Axiovision Apotome2 Mikroskop alınmıştır. 4. Rekombinant DISC1 Üretimi (598-785) Bir önceki yayında biz öz-örgütlenme alanlarının varlığına dayalı öz-etkileşim için çeşitli DISC1 protein parçalarının yeteneği analiz. Tüm protein arasında insan DISC1 (598-785) (Şekil 4) güçlü multimerization eğilimi 4 görüntülenen test parçaladı. Bu nedenle, insan DISC1 (598-785) (Resim pET15b içine klonlandıvagen, Madison, Wisconsin) olarak ifade E. 6-histidin etiketi bir N-terminal içeren, coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, ABD), ve 4 açıklandığı gibi 8 mol / l üre denatüre edici koşullar altında saflaştınldı. Kısaca, protokol aşağıda verilmiştir. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli bir OD 600 5mM 5 mM-arginin-HCl, MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml kloramfenikol içeren yukarı 2 x 500 ml 2YT içinde büyütülmüştür: 0.6-0.8 ve DISC1 (598-785) ifade endüklenmiştir 1 mM IPTG ile. </li><li> DISC1 (598-785) 37 ° C &#39;de 4 saat boyunca ifade edildi ifade santrifüjleme ile hasat bakteriler tarafından sona erdirildi. </li><li> Bakteri pelet, 50 ml TE tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA) artı 2 mM PMSF,% 1 TX-100, 250 ug / ml lizozim, 20 mM MgCl2 ve 400 U/50 ml içinde tekrar süspanse eridiği sağlamak için DNase I, reaksiyon hafif karıştırma ile oda sıcaklığında 30 dakika süre ile inkübe edildi. </li><li> Β-mercapt 10 mM ekleBaşka bir 30 dakika boyunca oethanol (ME) ve 500 mM NaCI ve inkübe. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 20.000 g&#39;de bakteri inklüzyon gövdelerinin aşağı Spin </li><li> Yeniden süspanse pelet 50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M üre, 10 mM β-ME ve 4, 30 dakika boyunca 20.000 g&#39;de sentrifüjleme ile artıkları kaldırmak ° C ihtiva eden 50 ml tampon içinde ekstraksiyon </li><li> Ekstraksiyon tamponu ile Ni-NTA agaroz matrisi yıkayın. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle Ni-NTA matris ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş precleared protein ekstresi inkübe edin. </li><li> 12 mM imidazol içeren ekstraksiyon tamponu ile Ni-NTA matrisi yıkayın. </li><li> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M üre, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA ve β-ME 10 mM ihtiva eden 15 ml elüsyon tamponu ile yavaş yavaş protein Zehir. </li><li> Β-ME 10 mM PBS, pH 7.4 ile adım adım protein Dialyze. </li></ol> 1 L bakteriyel başlangıç ​​kültürü kaynaktan rekombinant DISC1 (598-785) prot 50 mg&#39;a kadar izole etmek mümkündürein. α-sinüklein refolding Için, α-sinüklein, rekombinant protein 500 mg (Sigma-Aldrich, USA) ile deneyler 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda PBS içinde çözüldü. Oligomerler elde etmek için, refolding 37 gece boyunca gerçekleştirildi ° C gibi daha önceki bir yayında 10 tanımlanmıştır. 5. DyLight594 ile Rekombinant DISC1 (598-785) Etiketleme <ol><li> Önceki sonraki etiketleme süreci, DISC1 (598-785) proteini β-ME kurtulmuş oldu. Bu nedenle, protein 1:2,000 bir seyreltme PBS pH 7,4-3 kez diyaliz edilir. </li><li> Etiket 1 üreticinin talimatlarına göre DyLight 594 maleimid (Thermo Scientific, USA) mg DISC1 (598-785). Kısaca, PBS pH 7.4 içinde 1 mg / ml protein çözülür ve serbest tiyol gruplarının geri kazanmak için 5 mM TCEP ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe etmek ve reaksiyon DMF boya çözünmüş 20 ul ekle. </li><li> PBS pH protein 3 x Dialyze2 1:2000 oranında 7.4 her biri HR. </li></ol> İlave etiketli protein saflık artırmak için bir His 6-etiketli bir Ni-NTA sütunu gerçekleştirilir üzerinde afiniteyle saflaştırılması bazlı. <ol start="4"><li> 10 ml PBS pH 7.4 ile 1 ml Ni-NTA matris (Qiagen, Almanya) yıkayın. </li><li> Sütun etiketli, diyalizlenmiş protein uygulayın ve yavaşça sütunu üzerinde çalışmasına izin. </li><li> 3 x 20 ml PBS, pH 7.4 ile yıkanır protein </li><li> Eluat hacmini azaltmak için Ni-NTA sütun üzerindeki renkli bant izlerken PBS pH 7.4, 500 mM imidazol damla damla ile protein Zehir. </li><li> 2 saat için her bir 1:2000 seyreltme bir 10 mM NAPI pH 7.4 ile arındırıldı ve 3 x Dialyze. </li><li> Eluat, sıvı azot içinde 5 x 100 ul örnekleri ve ek dondurucuda kısım filtreler.İnteger steril 0.45 mikron şırınga kullanın. Her bir 100 ul alikot içinde 1 ug / ml - protein olarak toplam miktarı 0.5 olmalıdır. </li></ol> isteğe concentrtirme adım <ol start="10"><li> Stereotaktik sıçan enjeksiyonlar için, proteinin bir hız-vac (Eppendorf Concentrator 5301) 10 kat konsantre edildi. Nihai tampon durum 100 mM NAPI idi. </li></ol> α-sinüklein Etiketleme Rekombinant α-sinüklein bir etiketleme ve arıtma (Ni-NTA sütunu) DISC1 (598-785) ile paralel olarak yapılmıştır. Toplam başlangıç ​​malzemesi 500 mg yerine DISC1 (598-785) için 1 mg idi. 6. Etiketli Rekombinant DISC1 (598-785) Protein Alıcı SH-SY5Y Hücreleri Tedavisi <ol><li> Tohum 5x10 4 alıcı SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde yapısal bir 24 de plakanın her steril cam lameller üzerine GFP-DISC1 (598-854) ifade. </li><li> 5-10 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, hücre kültür ortamına etiketli protein ekleyin ve 48-72 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> PBS pH 7.4 ile 3 x hücreler yıkanır ve ektraksiyonu gidermek5 dakika için% 0.04 &#39;Tripan Mavisi ile ellular floresan. </li><li> Buz üzerinde 10 dakika süreyle PBS pH 7.4 &#39;de% 4 PFA ile hücreleri saptamak, DAPI montaj orta (Invitrogen, ABD) ile Altın uzattığı steril H 2 O ile bir kez yıkayın ve cam slaytlar lamelleri monte edin. </li><li> Lazer konfokal mikroskobu ile üretilen Z-yığın görüntülerde alıcı hücreler tarafından eksprese işe proteinleri ile kolokalizasyon tarafından rekombinant protein uygulanan eksojen alımı / işgali onaylayın. Ancak, endojen protein alımı esasen konak hücrenin protein işgali ile paralel olarak tespit edilemeyebilir, Z-yığın görüntüleri hala protein invaziv onaylayabilirsiniz. </li></ol> Bizim örneğimizde rec de. DISC1 (598-785) * en azından kısmen acemi içinde çözünür DISC1 (598-854) konak hücre (Şekil 5A bakınız) tarafından ifade edilmiş protein GFP-etiketli. Rekombinant α-sinüklein işgali ama hiçbir işe için (Şekil 5B) gösterilmiştir. Resimler çekildibir Zeiss LSM 510 konfokal-ya da bir Zeiss mikroskobu Axiovision Apotome2. Konsantre bir enjeksiyon ile bile hayvanın perfüzyon sonra tespit edilebilir enjeksiyon yeri etrafında protein yayılmasında Mpfc sonuçlara DISC1 (598-785) * işaretli (2.5 ug / ul arasında yaklaşık 4 ul), Bir rodamin filterset ile PBS pH 7.4 &#39;de% 4 PFA. Bizim örneğimizde DISC1 (598-785) nöron ayrı bir numara tarafından alınır ve Z-yığın görüntüleme (Şekil 6) ile izlenebilir. Genel olarak, burada kullanılan olanlardan daha sonra diğer proteinlerin enjeksiyon ister istemez hücre istilası yol açmaz. Işgali olayı protein niteliği üzerinde esasen bağlıdır, yine temiz bir arıtma daha fazla analiz için bir ön koşuldur. 7. Temsilcisi Sonuçlar NLF hücrelerinden rekombinant FL DISC1-eGFP saflaştırılmış oluşan Aggresomes alıcı SH-SY5Y ce işgaldüşük verimlilik de lls (yaklaşık% 0.3 5) olarak konfokal mikroskobu (Şekil 3) ile ko tarafından görülebilir. Önceden bildirildiği gibi, DISC1 (598-785) ifade ve E. arınmış coli multimerler 4 pozitif kontrol (Şekil 5B) olarak paralel olarak kullanıldığı α-sinüklein ile benzer yaklaşık olarak% 20 5 (Şekil 5A) ve bir verimle eşit olarak hücre-invaziv oluşturmuştur. Etiketli rekombinant DISC1 (598-785) ifade ve E. arınmış multimerik proteini stereotaksi bir sıçan prefrontal korteks (; Pum, Bader, Huston, Korth, yayınlanmamış Şekil 6) enjekte edildiğinde coli da hücre-invaziv in vivo nöron oldu. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. NLF nöroblastom hücrelerinde geçici FP-DISC1 (kırmızı) ifade. Kırmızı floresan aggresomes dete olabilir,hücre içindeki cted. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Bir sükroz degrade arıtma sonrası DISC1 aggresomes MRFP etiketli saflaştırılmış. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Istila aggresomes Floresan resmi. MRFP etiketli flDISC1 aggresomes SH-SY5Y nöroblastom hücreleri ile saflaştırılmış ve inkübe edildi eksprese çözünebilir GFP etiketli DISC1 (598-854). Etiketli aggresomes bir tutulum bir Lazer Tarama mikroskobu (Zeiss LSM 510) Z-yığın görüntüleme ile izlenir. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Rec SEC-profili. S704 ve C704 tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) içeren DISC1 (598-785). Her iki değişken sıralanmıştır oligomerizasyonun bir bozulma ve yüksek moleküler ağırlıklı mult oluşumunu göstermekimers (kırmızı ok). Bu resim Leliveld ark yayın., Biyokimya 2009 değiştirilir. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Invaziv DyLight-etiketli rekombinant DISC1 (598-785) Floresan Z-yığın resim. Çözünür GFP-DISC1 (598-854) ifade eden SH-SY5Y nöroblastoma hücre etiketli ile inkübe edildi, 5 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda yeniden birleştirici protein. (A) Kırmızı agrega rec işgali gösterir. DISC1 (598-785) protein ve sarı noktalar agrega içine çözünür GFP-DISC1 (598-854) bir işe göstermektedir. (B) Rekombinant α-sinüklein (kırmızı) yaklaşık% 20 oranında bir sıklık ile işe alım olmadan hücreleri işgal etti. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Immünofloresan resmienjekte etiketli, rekombinant DISC1 (598-785) proteini. Z-yığın görüntüleme rec varlığını teyit eder. Nöronal çekirdeklerin (Neun, yeşil) karşı bir antikor ile boyandı sıçan kortikal nöronlarda DISC1 (598-785) proteini.

<ol><li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li>
<li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li>
<li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+%28640-854%29+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li>
<li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level%3A+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li>
<li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li>
<li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li>
<li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li>
<li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li>
<li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li>
<li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li>
<li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li>
<li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li>
<li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCopathies%3A+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada, bir transfekte edilmiş nöroblastoma hücre çizgisi, bunların hazırlanması ve bir rekombinant protein DISC1 tür etiketleme ve in vitro ve in vivo olarak alıcı hücrelerin hücre istilası deneylerde uygulama mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes saflaştırılması açıklanmıştır. Yerli mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes arıtılması Lewy cismi benzeri yapılar ve büyük agrega 13, 14 yalıtmak için protokoller geliştirildi, fakat deterjan kullanımını önlemek için ve oluşabilecek hücre invazyonu yanlış pozitif riskini en aza indirmek için güncellenmiştir deterjan kolaylaştırılmış membran penetrasyonu nedeniyle. Bir olası gelecek iyileşme daha fazla aggresomes tamamen ayrı kalan membranları ve hücre iskeleti ile sonikasyon ile aggresomes saflığını arttırmak için de olabilir. Artan genel saflık olarak, büyük aggresomes ma için kaydedilen toplam işgal olayların sayısınıy 5 artırılacak. Önerdiğimiz 3 fazlı sukroz sınırlı tanımı diğer protein türlerinden aggresomes için yeterli olup olmadığı test edilmelidir, bu anlamda protokol burada özetlenen bireysel optimizasyon için bir başlangıç ​​noktası olarak kabul edilmelidir. Saflaştırılmış aggresomes sakkaroz izleri önemli ölçüde genel verimi azaltmak etmedi ortadan kaldırmak için bizim eller, ek yıkama adımları (deterjansız) oldukça sağlam olduğunu kanıtladı. Önceki bir yayında bu DISC1 bir oligomer montaj C-terminali 4 (Şekil 4) farklı multimerization etki bağlı olduğunu tanımlanmıştır. Biz, E., rekombinant çözünür ifade için bu parça seçtik coli ve sonraki ve Ni-NTA saflaştırılması. Onun multimerization izlemek ve α-sinüklein gibi tarif hücre-invaziv proteini ile hücre invazivlik karşılaştırmak için, biz floresan boya DyLight594 ile DISC1 (598-785) etiketli ve kıyaslaeşit olarak etiketlenmiş α-sinüklein bu ile hücre-invaziv. Rekombinant DISC1 parçasının hücre-invaziv ölçüde doğal, tam uzunlukta DISC1 aggresomes, muhtemelen daha küçük boyutlu ve daha yüksek bir saflık derecesi ile karşılaştırıldığında çıkarıldı. Yine, saflıkta hücre-invaziv belirleyici bir rol oynadığı görülmektedir. Bizim örneğimizde invaziv aggresomes Birleştirilerek bir çözünür, yani hücre dağınık şeklinde ifade edildi hedef hücre hattı çözünür homolog protein işe. Bu Z-yığın görüntüleme yoluyla alıcı hücre sınırı içinde invaziv aggresomes ve rekombinant proteinlerin ko sağlar beri alıcı hücre hattı bir floresan proteini (örneğin GFP veya TÇ) ifadesi bir avantajdır. Hücre-invaziv DISC1 aggresomes ve multimerik parçaları ifade ve E. arınmış coli DISC1, DI ilgili bir proteinin konformasyon hastalıkların tanımlayıcı bir özelliği olabilirSC1opathies 15. Çekim Trouble: Sukroz gradient saflaştırma sonrasında Düşük aggresome verim: Bu protokol tanıtılan sukroz gradient eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes ile iyi çalışır. Diğer proteinlerden oluşan Aggresomes değişken boyutlarda olabilir, bu nedenle sakaroz konsantrasyonları diğer kullanıcılar tarafından optimize edilmesi gerekmektedir. Rekombinant protein Yetersiz saflaştırılması: Rekombinant protein arıtma işlemi herhangi bir bakteri kirletici maddeler de protokol sonraki adımda etiketlenir. Bulaşmayı önlemek için, SDS-PAGE ile protein çalıştırın ve rekombinant proteini Coomassie-Blue ile boyanarak saf, en az% 95 olduğunu onaylayın. Yüksek kalite ve verimi sağlamak için, her bir ayrı protokol protein için optimize edilmelidir. Düşük etiketleme efRekombinant proteinlerin ficiency: Serbest SH grupları içeren herhangi bir kontaminasyondan proteinin etkili etiketleme azalacaktır. Bu nedenle, kapsamlı diyaliz ve Ni-NTA bazlı saflaştırma zorunludur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ismi </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Orta konak hücre hattı bağlıdır. En uygun alıcı hücre çizgisi kullanıcı tarafından belirlenmelidir. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Orta alıcı hücre hattı bağlıdır. En uygun alıcı hücre çizgisi kullanıcı tarafından belirlenmelidir. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Diğer transfeksiyon reaktifleri de işe yarayabilir ama bizim protokolü ile test edilmiştir. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agaroz </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Deneyler Qiagen gelen Ni_NTA agaroz ile yapıldı, diğer tedarikçiler de çalışmak gerekir. </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Aggresomes arınma sürecinde RNaz ücretsiz DNaz için gerek yoktur. </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serum içermeyen aracı madde olarak iyi çalışır </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> SH-SY5Y ve NLF orta Ek </td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino-asitler (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> SH-SY5Y orta Ek </td></tr><tr><td> Tripan Mavi 0.4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Toksik reaktifi </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46608 </td><td> Stabil tiyoeter bağları oluşturmak için sistein reaktif boya azalır. Ayrıca diğer renkler mevcuttur. </td></tr><tr><td> DAPI ile Altın uzatmak </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Bu antifade sıvı mountant elimizde üstün sonuçlar verdi. </td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör Kokteyl </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> 100X çözüm için 500 ul H 2 O 1 masa çözülür. </td></tr><tr><td> Sentetik bir-sinüklein </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Refold metin olarak tanımlanmıştır. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Belirli reaktiflerin Tablo. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Teknolojileri </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Biz diğer mekanik homojen test değilBunun dışındaki nizers. Diğer deterjan ücretsiz homojenleştirme metodu yanı işe yarayabilir, ancak bu protokol için test edilmemiştir. </td></tr><tr><td> 5301 Yoğunlaştırıcı (Speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Protein konsantre olmak varsa Sadece gerekli. </td></tr><tr><td> LSM 510 ve Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Üreticilerin katalog bak </td><td> Hem mikroskoplar Z-yığın görüntüleme gerçekleştirmek için yeteneği barındırırlar. Bu işgal olaylar katı ve ciddi bir değerlendirme için bir ön koşuldur. </td></tr><tr><td> Hücre kültürü plastik malzemeden </td><td> Nunc </td><td> 10 cm yemekler # 172958, 24-kuyucuğu # 142475 </td><td> Farklı plastik malzemenin kullanımı, rekombinant protein ya da aggresomes ve plastik yüzeylerin etkileşim etkileyebilir. Biz burada açıklanan dışındaki malzemelerin test etmedim. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Özel malzeme ve ekipman Tablo. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Numara </td><td> Tampon adı </td><td> içerik </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Bakteriyel büyüme ortamının </td><td> 16 g / l Bacto Tripton, MgSO4 5mM 10 g / l Bacto maya özü, 5 g / l NaCI, 5 mM-arginin-HCl, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml kloramfenikol </td><td> OD 600 bakteriler büyümek: 0.6-0.8 1 mM IPTG ile ifade neden. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bakteriyel tabanda tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF,% 1 TX-100, 250 ug / ml lizozim, 20 mM MgCl2 ve 400 ml DNase I U/50 </td><td> Ove 1 L bakteriyel pelet Resupend50 ml tampon içinde yeniden süspanse rnight kültürü. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein ekstraksiyon tamponu </td><td> 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M üre, 10 mM B-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA sütunu yıkama tamponu </td><td> 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M üre, 10 mM B-ME, 12 mM imidazol </td><td> 12 mM imidazol ile Modifiye ekstraksiyon tampon eklendi. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA sütunu elüsyon tampon </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M üre, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA ve 10 mM B-ME </td><td> Işlem tampon maddesi daha sonra diyaliz edilir, 10 mM B-ME, içerir. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0.2 g / l KCI, 1.44 g / l Na 2 HPO 4, 0.24 g / l KH 2 PO 4, pH 7.4 &#39;e ayarlamak </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Tampon Etiketleme </td><td> PBS 5 mM TCEP içeren </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tarifleri Tablo. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

hücre-invaziv disc1 protein türlerinin Üretimi, saflaştırılması, ve karakterizasyonu

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein toplama Alzheimer hastalığı (Aβ, tau) nörodejeneratif hastalıklarda, örneğin, gibi kronik ve dejeneratif beyin koşulların bir genel ayırt edici olarak görülen, Parkinson Hastalığı (α-sinüklein), Huntington hastalığı (poliglutamin, huntingtin), ve diğerleri. Protein agregasyonu rahatsız proteostasis sonucu oluştuğu düşünülmektedir, doğan ve katlanan proteinlerin yıkımı arasındaki dengesizlik yani. Not, aynı protein ailesel formları arasında ender türevleri mutant bu hastalıklar dağınık formlar toplanmış bulunur. Şizofreni birçok durumda kalıcı ve geri dönüşümsüz bilişsel açığı ile birlikte gider kronik ilerleyici beyin hastalığıdır. Aday gen yaklaşımı, biz bozulması-in-şizofreni 1 (DISC1), kronik ruhsal hastalığı 1, 2 bağlantı ile bir İskoç aile klonlanmış bir genin, brai çözünmez büyüklükler bulunamadı araştırdıkn şizofreni 3 sporadik olgular. SMRI CC kullanarak, CMD ile vakaların yaklaşık% 20&#39;sinde belirlendi ancak biyokimyasal fraksiyonasyonu sonrası nörodejeneratif hastalıklar ile değil normal kontrollerde veya hasta sarkosyl çözülmeyen DISC1 immünreaktivitesi. In vitro sonraki çalışmalar DISC1, toplama eğilimi hastalığı ile ilişkili polimorfizmi S704C 4 etkilendiğini ortaya koydu ve in vitro üretilen DISC1 aggresomes Aβ 6 için gösterilen olmuştu ne benzer 5, tau 7-9, α hücre-invaziv olduğu -sinüklein 10, poliglutamin 11 veya SOD1 agregalar 12. Bu bulgular bize CMD olguların en azından bir alt kümesi, toplanan DISC1 olan proteinin konformasyon bozuklukları olabileceğini teklif istenir. İşte biz memeli hücrelerinde DISC1 aggresomes oluşturmak nasıl açıklar, bir sukroz degrade onları arındırmak ve hücre-invaziv Studi için bunları kullanmakes. Benzer şekilde, biz sadece bir multimerik C-terminal DISC1 fragmanı, etiket üretmek ve hücre invaziv çalışmalar için arınmak anlatılmaktadır. DISC1 yeniden birleştirici multimerler kullanılarak bir benzer bir şekilde etiketlenmiş sentetik α-sinüklein fragmanı için olduğu gibi benzer hücre invaziv elde edin. Ayrıca stereotaktik alıcı hayvanların beyin içine enjekte edildiğinde bu fragman, in vivo alınır olduğunu göstermektedir.

Hücre kültüründen hücre içi, sitoplazmik tam uzunluklu protein DISC1 aggresomes ve bir etiketlenmiş, multimerik DISC1 rekombinant protein parçasının üretimi, saflaştırılması ve hücre istilası<em&gt; E. coli</em&gt; Tarif edilmektedir. Hücre invazivlik hücre kültürü ve nöronlar için alıcı hücreler için gösterilir<em&gt; In vivo</em&gt; Stereotaktik beyin inokülasyon sonrası.

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Protein agregasyonu; örneğin Alzheimer hastalığı (Aβ, tau), Parkinson hastalığı (α-sinüklein), Huntington hastalığı (poliglutamin, huntingtin) ve diğer nörodejeneratif hastalıklar gibi kronik, dejeneratif beyin durumlarının genel bir özelliği olarak görülmektedir. Protein agregasyonunun, proteostazın bozulması, yani yanlış katlanmış proteinlerin oluşumu ile yıkımı arasındaki dengesizlik nedeniyle meydana geldiği düşünülmektedir. Dikkat çekici bir nokta olarak, nadir görülen familial formlarda mutant olan aynı proteinlerin, bu hastalıkların sporadik formlarında da agregasyon şeklinde bulunduğu görülmektedir. Şizofreni, çoğu durumda kalıcı ve geri dönüşümsüz bir bilişsel eksiklikle seyreden kronik, progresif bir beyin durumudur. Aday gen yaklaşımıyla, kronik mental hastalıkla ilişkili olarak İskoç bir ailede klonlanan bir gen olan Disrupted-in-schizophrenia 1'in (DISC1), sporadik şizofreni vakalarının beyinlerinde çözünmez agregatlar olarak bulunup bulunmadığını araştırdık. SMRI CC kullanarak, biyokimyasal fraksiyona sonrası, normal kontrollerde veya nörodejeneratif hastalıklı hastalarda değil, ancak KMB'li vakaların yaklaşık %20'sinde sarkozil-çözünmez DISC1 immünoreaktivitesi saptadık. Ardından yapılan in vitro çalışmalar, DISC1'in agregasyon eğiliminin hastalıkla ilişkili S704C polimorfizminden etkilendiğini ve in vitro olarak oluşturulan DISC1 aggresomlarının; Aβ, tau, α-sinüklein, poliglutamin veya SOD1 agregatları için gösterilenlere benzer şekilde hücre-invaziv olduğunu ortaya koymuştur. Bu bulgular bizi, KMB'li vakaların en azından bir alt kümesinin, yani agregasyon göstermiş DISC1'e sahip olanların, protein konformasyon bozuklukları olabileceğini öne sürmeye yöneltmiştir. Burada, memeli hücrelerinde DISC1 aggresomlarını nasıl oluşturduğumuzu, bunları bir sükroz gradyanında nasıl saflaştırdığımızı ve hücre-invazivlik çalışmaları için nasıl kullandığımızı açıklıyoruz. Benzer şekilde, sadece multimerik bir C-terminal DISC1 fragmanı nasıl oluşturduğumuzu, hücre invazivlik çalışmaları için bunu nasıl etiketlediğimizi ve saflaştırdığımızı tanımlıyoruz. Rekombinant DISC1 multimerlerini kullanarak, benzer şekilde etiketlenmiş sentetik bir α-sinüklein fragmanı ile benzer bir hücre invazivliği elde ediyoruz. Ayrıca, bu fragmanın alıcı hayvanların beynine stereotaktik olarak enjekte edildiğinde in vivo olarak alındığını gösteriyoruz.

Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, alıcı hücreleri istila edebilen saflaştırılmış disk agregatları oluşturmaktır. Bu amaca ulaşmak için iki farklı yöntem sunulacak olup, ilk yöntemle uygulama gösterilecektir.Somes oluşturan floresan protein disc one füzyon proteini, NLF insan nöroblastoma donör hücrelerinde aşırı ifade edilir. Hücreler daha sonra PBS ile yıkanır, toplanır ve deterjan kullanılmadan lizize edilir. DNA sindirilir ve sükroz gradyan sistemi kullanılarak agro zonlar saflaştırılır.Bu yöntemle saflaştırılan Agriosların hücre istila verimliliği düşüktür. Alternatif yaklaşım, rekombinant disc one proteininin 5 98 ile 7 85 arasındaki amino asitlerini e coli'de aşırı ifade etmektir. Protein fragmanı daha sonra DITE 5 94 ile işaretlenir,le diyalize edilir ve geri kalan bağlanmamış boyayı ve multimerik disc'i uzaklaştıran bir NI NTA matrisi kullanılarak saflaştırılır.Bu yöntemle üretilen fragmanlar, konak hücre invazyonunu değerlendirmek için yüksek hücre invazyon verimliliğine sahiptir. Saflaştırılmış floresan protein diski, ribozomlar veya işaretlenmiş rekombinant disk kullanılır. Fragmanlar, ilgilenilen alıcı hücrelerle inkübe edilir.Ardından, hücre dışı floresanışı söndürmek için Trian blue eklenir ve invazyon konfokal mikroskopi ile görselleştirilir. Şu ana kadar, protein agregasyonu şizofreni gibi kronik mental hastalıkların tanınmış bir özelliği olmamıştır. Şizofrenide bozulmuş olan bir proteinin adayı olduğu durumda, protein agregatlarının hücresel invazivitesi, protein konformasyon hastalıklarının belirgin bir özelliğidir.Burada, iki yöntemle disc one protein agregatlarının hücre istilacı olduğunu ve dolayısıyla disc one ile ilişkili bozuklukların veya disc one nöropatilerinin protein konformasyonel bozukluklar olduğunu gösteriyoruz. Bu iki yöntemden ilki, nöroblastoma hücre hatlarından tam uzunluktaki disc one ASOS'un saflaştırılması; ikincisi ise, E. coli'de C-terminal multimerik bir disc one fragmanının ekspresyonu ile birlikte saflaştırılması ve floresan boya ile işaretlenmesidir.İlk yöntemle, saflaştırılmış mikrozomları alan hücrelerin yalnızca %0,3'ü gibi düşük bir hücre istilası verimi elde edilirken, saf rekombinant protein fragmanı maruz kalan hücrelerin %20'sine kadar enfekte etmektedir. Burada açıklanan yöntemlerin, akrozom oluşumunun veya multimerik montajın ikna edici şekilde kanıtlandığı diğer proteinlere de aktarılabilir olması beklenmektedir. Her bir 10 santimetrelik kapta.1,5 x 10⁶ insan nöroblastoma ve LF hücresini, desteklenmiş RPMI 1640 ortamına ekleyin ve gece boyunca büyütün. Ertesi gün hücreler %70 ila %80 konfluense ulaşmış olmalıdır; beş kabı PC DNA 3.1 MRFP ve EGFP etiketli insan tam uzunluklu disc 1 ile transfeksiyon için, beş kabı ise yalnızca EGFP plazmidi ile transfeksiyon için etiketleyin. Her 10 cm'lik kap için 15 µg plazmid DNA'sını, 30 µL met afekting ve 750 µL'yi birleştirin.Bir mikro santrifüj tüpündeki Opti MEM, pipetle aşağı yukarı çekilerek karıştırılır ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Ardından hücreleri transfekte etmek için, DNA transfeksiyon reajanı çözeltisi hücrelerin üzerine damla damla eklenir; hücreler 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edilir. Transfeksiyondan 48 saat sonra MRFP tam uzunluklu disc one ekspresyonu izlenmiş ve bir floresan mikroskobu altında aggresom oluşumları doğrulanmıştır. Burada gösterildiği gibi, bazı hücreler yoğun floresan protein inklüzyonları barındırmaktadır.Bu protokol, beyin dokusundan Lewy cisimcikleri saflaştırma yöntemi ile daha büyük agregatların veya agro bölgelerin izole edilme protokolünü birleştirmektedir; mevcut yöntemler deterjan kullanımına dayalı olduğundan, hücre istilası deneylerinde uygulanmak üzere deterjan içermeyen proteinlerin izole edilmesi kritik önem taşır. Ardından, besiyerini aspire edin, PBS ile yıkayın ve protease inhibitör kokteyli içeren 400 µL PBS ekleyin. Daha sonra hücreleri sıyırın; bir mL hücre süspansiyonunu ve 10 adet seramik boncuğu iki mL'lik bir lizis tüpüne ekleyin.Hücreleri, pre-cell lyse 24 homojenizatöründe üç adet 62. pulse ile lizleyin. İşlemin mekanik kuvveti, numune içindeki sıcaklığın 37 °C üzerine çıkmasına neden olabilir. Bu nedenle, numunenin buz üzerinde soğutulmasına dikkat edilmelidir. Liz prosedürünün ardından, hücreleri buz üzerinde soğuttuktan sonra, 10 mM magnezyum klorür ve mililitre başına 40 ünite DNAz ekleyin ve 37 °C'de çalkalayarak 60 dakika inkübe edin.PBS içinde ağırlıkça hacme göre %80, %50 ve %20 oranlarında 10'ar mililitre sakkaroz hazırlayın. Ardından, 15 mililitrelik konik bir tüp içerisinde, önce iki mililitre %80 sakkaroz, ardından iki mililitre %50 ve iki mililitre %20 sakkaroz kullanarak sakkaroz gradyanını hazırlayın. Gradyanı yavaşça dökün ve önceden dökülmüş katmanları bozmamaya dikkat edin.Sindirilmiş lizatı gradyanın üzerine katmanlayın ve 4 °C'de 1000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemi işlemi bittiğinde, %50 ile %80 sükroz tabakası arasındaki ara yüzeyi bir pipetle dikkatlice toplayın ve 15 mL'lik konik bir santrifüj tüpüne aktarıp beş hacim ile karıştırın; ardından 4 °C'de 1000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve agri zonu içeren pelleti saklayın.Bu ara yüzde yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Agri bölgeleri floresan özelliktedir ve son yıkamadan sonra mikroskop altında UV ışığı ile görüntülebilir; süpernatantı atın ve peleti 250 ila 500 microliters PBS içinde yeniden süspande edin. Bu pelet, saflaştırılmış agro bölgeleri içerir.Steril cam lameller üzerinde çözünür GFP disc1 C-terminusunu konstitütif olarak eksprese eden SH-SY5Y insan nöroblastoma hücreleri içeren 24 kuyucuklu bir plağın her kuyucuğuna 10 µL MRFP disc1 asome süspansiyonu ekleyin. İnkübasyonu 48 ila 72 saat boyunca sürdürün. İnkübasyonun ardından hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve hücre dışı floresanışı 0,04% trypan blue ile beş dakika boyunca söndürün.Ardından, triyan mavisini uzaklaştırmak için PBS ile yıkayın. Sonra, kabı buza yerleştirin ve hücreleri sabitlemek için 10 dakika boyunca %4 PFA ve PBS ekleyin. Daha sonra steril su ile bir kez yıkayın ve lamelleri, DPI montaj medyumu içeren prolonged gold ile cam lamlar üzerine monte edin.Z-yığın görüntülerinde, alıcı hücreler tarafından eksprese edilen ve bölgeye çekilen proteinlerle kolokalizasyon yoluyla, dışarıdan uygulanan agrezonların istila sırasındaki alımını doğrulayın. Bu Z-yığın yaklaşık altı mikrometre derinliği kapsar.200 nanometre adımlarla çekilmiş 24 görüntü. Kırmızıyla gösterilen MRFP disk bir agri zonu floresansı,le görülmekte oluple sitozolik GFPC terminal diskini toplar. Yeşil ile gösterilen bir fragmanyla kolokalizasyon sarı olarak görülür ve agri zonlarının alıcı sitozole girdiğini ve önceden çözünür durumda olan disk bir proteinini topladığını gösterir.Protokolün bu bölümünde, human disc one, DITE 5 94 ile işaretlenecektir. Bu D, ek immün boyama gereksinimi olmadan rekombinant proteinin doğrudan izlenmesini sağlar. Eşlik eden belgede açıklanan şekilde hazırlanan proteinin, 1/2000 dilüsyonda iki litre PBS içinde üç kez diyalize edilerek beta-merkaptoetanolden arındırılmasıyla işleme başlayın.Bir miligramlık disk bir'i DITE 5 94 IDE ile etiketleyin; mililitre başına bir miligram proteini PBS içinde çözün ve serbest TH gruplarını geri kazanmak için beş milimolar TCEP ekleyin. Reaksiyona DMF içinde çözünmüş boyadan 20 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. 10.000 Dalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir SLI diyaliz kaseti kullanarak, proteini PBS içinde 1:2000 oranında, her biri iki saat sürecek şekilde üç kez diyalize edin. Ardından, etiketlenmiş proteinin saflığını daha da artırmak için işlemi tekrarlayın.Ni-NTA kolonunda histidin etiketi (his tag) tabanlı bir afinite saflaştırması gerçekleştirilir. Bir mililitre Ni-NTA matrisi, 10 mililitre PBS ile yıkanır; ardından etiketlenmiş ve diyalize edilmiş protein kolona uygulanır ve kolon üzerinden akmaya bırakılır.Proteinin NTA matrisine bağlanması nedeniyle çözelti yavaşça mavi renginin bir kısmını kaybedecek ve işaretlenmemiş serbest boya akış sırasında kalacaktır. Protein çözeltisi kolona girdikten sonra, kolonu üç kez 20 milliliters PBS ile yıkayın; proteini elüye etmek için kolona 500 millimolar imidazole içeren iki milliliters PBS ekleyin.Valfi düşük hıza ayarlayın ve Ni-NTA kolonundaki renkli bandı izleyerek damla damla elüsyon yapın. Elüatın bu renkli fraksiyonu işaretlenmiş rekombinant protein içerir; elüatı bir SLI diyaliz kasetine aktarın ve 2 litre hacimdeki 10 millimolar NAPI içerisinde 1:2000 dilüsyonla, her biri iki saat sürecek şekilde üç kez diyalize edin. Diyaliz sonrası elüatı steril 0.45 mikrometre şırınga filtresinden geçirin, ardından beş adet 100 microliter örneğe ayırarak sıvı azot içerisinde şok dondurun.Her 100 µL'lik alikvotta toplam protein miktarı 0,5 ile 1 µg/mL arasında olmalıdır. Proteinin invaziv kapasitesini değerlendirmek için, steril cam lameller üzerinde çözünür GFP etiketli Disc1 C-terminus'u sürekli olarak eksprese eden alıcı SH SY 5Y insan nöroblastoma hücrelerini içeren 24 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa, 5 ile 10 µg/mL etiketli rekombinant Disc1 proteini içeren besiyeri ekleyin ve 48 ile 72 saat boyunca inkübe edin.Hücre dışı floresansı söndürün ve agri zonu ile işlem görmüş hücrelerde olduğu gibi hücreleri fikse edip mount edin; eksojen olarak uygulanan rekombinant proteinin invazyonunu Z-stack görüntüleme ile doğrulayın. İşaretli protein hücre içine alındığında, konfokal mikroskopi ile oluşturulan görüntülerde alıcı hücrelerin çevresi içerisinde tespit edilir. Bu Z-stack, 220 nanometre'lik 24 adımda yaklaşık beş mikrometre derinliği kapsar.Burada, kırmızıyla gösterilen rekombinant disc one fragman 5 98 ile 7 85, çözünür C-terminal GFP etiketli disc one'in (yeşil ile gösterilen) eksprese edildiği alıcı hücreler tarafından alınarak disc protein agregatlarının invazivliği belirlenmektedir. MRFP etiketli tam uzunluktaki disc one'den oluşan akrozom bölgeleri NLF hücrelerinden saflaştırılmış ve burada gösterildiği üzere bu protokole uygun olarak alıcı SH SY five Y hücrelerine uygulanmıştır. A-M-R-F-P etiketli disc one akrozomu, çözünür GFP etiketli C-terminal disc one eksprese eden bir insan nöroblastoma SH SY five Y hücresini invaze etmiştir.Ayrıca, MRFP etiketli disc one asome, çözünür GFP etiketli disc one'i çözünmez agregatlar içine çekebilmiştir; DIA light işaretli rekombinant disc one'in invazivliğini belirlemek için, burada gösterildiği gibi, çözünür GFP disc one eksprese eden SH SY five Y nöroblastoma hücrelerine uygulanmıştır. Kırmızı ile gösterilen rekombinant disc one protein kümeleri alıcı hücreye invaze olmuştur; sarı noktalar, çözünür GFP etiketli C-terminal disc one'in agregatlar içine çekildiğini göstermektedir. E coli'den eksprese edilen ve saflaştırılan işaretli rekombinant disc one, multimerik protein bir sıçanın medial prefrontal korteksine stereotaktik olarak enjekte edildiğinde in vivo olarak nöronlar için de hücre invaziv özelliği göstermiştir. Z-stack görüntüleme, nöronal çekirdeklere karşı bir antikorla boyanmış sıçan kortikal nöronunda rekombinant disc one proteininin varlığını doğrulamaktadır.Hücre invazyonunu incelemek için disc one agregatları oluşturmaya yönelik iki yöntem göstermiş olduk. Bu yöntemlerden herhangi birini kullanarak, yabancı DNA transfeksiyonu yoluyla rekombinant gen ekspresyonunun neden olabileceği karıştırıcı değişkenler olmaksızın, disc one agregatlarının alınmasının hücresel etkilerini araştırabiliriz. Bu teknikler, disc one protein patolojisinin biyolojik etkilerini in vitro olarak hücrelerde ve in vivo olarak hayvan modellerinde intraserebral inokülasyon veya diğer uygulama yöntemleriyle incelemek için uygulanabilir.Bu tekniklerin, her bir proteine özel olarak uyarlanmış protokollerde yapılacak küçük modifikasyonlarla, zamanla diğer protein agregatlarına da aktarılabileceğine inanıyoruz. Bu prosedürü uygularken, konfokal mikroskopi görüntülerinin titizlikle analiz edilmesi için yeterli zaman ayırdığınızdan emin olun.

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Üç boyutlu hücre dışı matriks içine tümör hücresi invazyonu modelleri daha iyi...

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Rejeneratif uygulamalar için idealdir insan iskelet kası liman birkaç çok-soy öncü nüfus içindeki kan damarları. Intima gelen Miyojenik endotel hücreleri, medya perisitler ve adventisyanın gelen adventisyal hücreler: Bu izolasyon yöntemi, kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla üç multipotent öncü hücre popülasyonlarının eşzamanlı arınma sağlar.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

Mesane kanseri istila yönetim süreçleri biyomarker ve terapötik geliştirme fırsatları temsil eder. Burada hangi 3-b kültür tümör pulcuklarının, hızlandırılmış görüntüleme ve confocal mikroskobu birleştirmek bir mesane kanseri istila modeli mevcut. Bu teknik invaziv işlem özelliklerini tanımlamak için ve terapötik ajanlar süzmek için yararlıdır.

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Dictyostelium discoideum hücre göç, endositoz ve geliştirme gibi karmaşık hücresel süreçler çalışmaya bir popüler bir model organizmadır. Belgili tanımlık yarar organizmanın genetik manipülasyon fizibilite üzerinde bağlıdır. Burada, sıvı ortam kodlamayla hücrelerde varolan sınırlamalar üstesinden Dictyostelium discoideum hücre transfect yöntemleri mevcut.

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.

Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Öğrenin, DISC1 protein agregatlarının üretimi ve saflaştırılması yöntemlerini. Bu teknikler, hücre içine invazyon yeteneğini değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanarak nörobiyoloji araştırmalarında uygulanabilir.

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet