Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, saflaştırılmış disk oluşturmaktır. Alıcı hücreleri istila edebilen bir küme. Bu amaca ulaşmak için iki farklı yöntem ilk yöntemle gösterilecektir.

Floresan protein diski bir füzyon proteini oluşturan azom, NLF insan nöroblastom donör hücrelerinde aşırı eksprese edilir. Hücreler daha sonra PBS ile yıkanır, toplanır ve deterjan kullanılmadan yatırılır. DNA sindirilir ve agro bölgeler bir sükroz gradyan Sistemi kullanılarak saflaştırılır.

Bu yöntemle saflaştırılan agrios, düşük hücre istila verimliliğine sahiptir. Alternatif yaklaşım, e coli'deki bir protein olan rekombinant diskin 5 98 ila 7 85 amino asitlerini aşırı eksprese etmektir. Protein fragmanı daha sonra DITE 5 94 ile etiketlenir, diyalize edilir ve kalan bağlanmamış boya multimerik diskini uzaklaştıran bir NI NTA matrisi kullanılarak saflaştırılır.

Bu yöntemle üretilen bir fragman, konak hücre istilasını değerlendirmek için yüksek bir hücre istilası verimliliğine sahiptir. Saflaştırılmış floresan protein diski, bir risom veya etiketli rekombinant disk. Bir fragman, ilgilenilen alıcı hücrelerle inkübe edilir.

Daha sonra hücre dışı floresansı söndürmek için trian mavisi eklenir ve invazyon konfokal mikroskopi ile görselleştirilir. Şimdiye kadar, protein agregasyonu şizofreni gibi kronik akıl hastalıklarının tanınan bir özelliği olmamıştır. Şizofrenide bozulan bir proteinin aday hücre olduğu durumlarda, protein agregatlarının invazivliği, protein doğrulama hastalıkları için ayırt edici bir özelliktir.

Burada iki yöntemle birinci disk protein agregatlarının hücreye invaziv olduğunu ve dolayısıyla birinci disk ile ilişkili bozuklukların veya birinci disk nöropatilerinin protein doğrulama bozuklukları olduğunu gösteriyoruz. İki yöntem ilk olarak tam uzunlukta diskin saflaştırılması, bir ASOS'un nöroblastom hücre hatlarından saflaştırılması ve ikincisi bir C terminal multimerik diskin ekspresyonudur. E coli'de bir fragmanın yanı sıra floresan boya ile saflaştırma ve etiketleme.

İlk yöntem, saflaştırılmış mikrozomları alan hücrelerin yalnızca oh% 0.3'ünün düşük verimli bir hücre istilasına yol açarken, saf rekombinant protein fragmanı, maruz kalan hücrelerin% 20'sine kadarını enfekte eder. Burada tarif edilen yöntemler, akrozom oluşumunun veya multimerik montajın ikna edici bir şekilde gösterildiği diğer proteinlere aktarılabilir olmalıdır. 10 10 santimetrelik yemeklerin her birinde.

Takviye edilmiş RPMI 1640 ortamında altı insan nöroblastomu ve LF hücresine 1,5 kez 10 kez tohumlayın ve gece boyunca büyütün. Ertesi gün hücreler %70 ila 80 oranında birleşik, PC DNA 3.1 MRFP ve EGFP ile transfeksiyon için beş tabak, sadece EGFP plazmidi ile transfeksiyon için bir ve beş etiketli insan tam uzunlukta disk olmalıdır. Her 10 santimetrelik çanak için, 15 mikrogram plazmit DNA'yı 30 mikrolitre etkileyen ve 750 mikrolitreyi birleştirin.

Opti MEM'i bir mikro santrifüj tüpünde ve yukarı ve aşağı pipetleyerek yapar, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri transfekte etmek için, DNA transfeksiyon reaktif çözeltisini ekleyin, hücrelere damla damla hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin% 5 CO 2 transfeksiyondan 48 saat sonra MRFP tam uzunlukta disk bir'in ekspresyonunu izledi ve bir floresan mikroskobu altında agro bölgelerin oluşumunu doğruladı. Bazı hücreler, burada gösterildiği gibi büyük floresan protein inklüzyonu barındırır.

Bu protokol, Lewy cisimciklerini beyin dokusundan saflaştırmak için bir yöntem ile daha büyük agregaları veya agro bölgeleri izole etmek için protokolü birleştirir, çünkü zaten mevcut yöntemler deterjanların kullanımına dayanmaktadır, hücre invazivliği deneylerinde uygulama için deterjan içermeyen proteinin izolasyonu kritik öneme sahiptir. Daha sonra, ortamı PBS ile aspire edin ve proteaz inhibitörü kokteyli içeren 400 mikrolitre PBS ekleyin. Daha sonra hücreleri kazıyın ve iki mililitrelik bir lizis tüpüne bir mililitre hücre süspansiyonu ve 10 seramik boncuk ekleyin.

Bir ön hücre lyse 24 homojenizatör üzerinde üç adet 62. darbe kullanarak hücreleri parçalar. İşlemin mekanik kuvveti, numune içindeki sıcaklığı 37 santigrat derecenin üzerine çıkarabilir. Bu nedenle numuneyi buz üzerinde soğutmaya özen gösterilmelidir Lizis işleminden sonra, hücreleri buz üzerinde soğuttuktan sonra, mililitre DNAA'ya 40 birim 10 milimolar magnezyum klorür ekleyin ve çalkalayarak 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

PBS'de hacim başına %80 ve %50 sükroz ağırlığında 10 mililitre hazırlayın. Daha sonra 15 mililitrelik konik bir tüpte, iki mililitre %80 sakarozdan başlayarak, ardından iki mililitre %50 ve iki mililitre %20 sükroz ile başlayan sakaroz gradyanını hazırlayın. Degradeyi yavaşça dökün ve önceden dökülmüş katmanları rahatsız etmemeye dikkat edin.

Daha sonra, sindirilmiş lizatı gradyanın üzerine koyun ve dört santigrat derecede 1000 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin. Kopma ile,% 50 ila% 80 sükroz tabakası arasındaki arayüzü bir pipetle dikkatlice toplayın ve dört santigrat derecede 1000 kez G'de 15 dakika boyunca beş hacim 15 mililitrelik konik tüp santrifüj ile karıştırın. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve pelet içeren ağrı bölgesini koruyun.

Bu arayüzde yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Tarım bölgeleri floresandır ve son yıkamadan sonra UV ışığı altında mikroskopta görüntülenebilir, süpernatanı atın ve peleti 250 ila 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bu pelet, saflaştırılmış tarım bölgelerini içerir.

SHSY beş Y insan nöroblastom hücresi içeren 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 10 mikrolitre MRFP diski, bir asome süspansiyonu ekleyin. Steril cam kapak kaymaları üzerinde bir C terminalini yapısal olarak eksprese eden çözünür GFP diski ve inkübasyonu takiben 48 ila 72 saat inkübe edilir. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve hücre dışı floresansı beş dakika boyunca% 0.04 trian mavisi ile söndürün.

Ardından trian mavisini çıkarmak için PBS ile yıkayın. Ardından, çanağı buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri sabitlemek için 10 dakika boyunca %4 PFA ve PBS ekleyin. Daha sonra bir kez steril su ile yıkayın ve kapak fişlerini DPI montaj ortamı ile uzun süreli altın ile cam slaytlara monte edin.

Ekzojen istilasında alımını onaylayın. Zack görüntülerinde alıcı hücreler tarafından eksprese edilen işe alınmış proteinlerle kolokalizasyon yoluyla uygulanan aggro bölgeleri. Bu Zack, derinliği yaklaşık altı mikrometreyi kapsar.

200 nanometrelik adımlarla çekilmiş 24 resim. Kırmızı ile gösterilen bir ağrı bölgesi olan MRFP diskinin floresansı, sitozolik GFPC terminal diskini harekete geçirir. Yeşil kolokalizasyonla gösterilen bir fragman sarı olarak ortaya çıkar ve ağrı bölgelerinin alıcı sitozole girdiğini ve daha önce çözünen disk bir proteini işe aldığını gösterir.

Protokolün bu bölümünde, insan disklerinden biri DITE 5 94 ile etiketlenecektir. Bu D, ek immün boyamaya ihtiyaç duymadan rekombinant proteinin doğrudan izlenmesine izin verir. Ekteki belgede tarif edildiği gibi hazırlanan proteini, bir ila 2000 seyreltmede iki litre PBS'de üç kez diyalize ederek ışın merkaptoetanolünden serbest bırakarak başlayın.

Bir miligram diski etiketlemenin yanında, biri DITE 5 94 IDE ile, PBS'de mililitre başına bir miligram proteini çözün ve serbest TH gruplarını geri kazanmak için beş milimolar TCEP ekleyin, reaksiyona 20 mikrolitre DMF çözünmüş boya ekleyin ve moleküler ağırlığı 10 olan bir SLI diyaliz kaseti kullanarak oda sıcaklığında iki saat inkübe edin, 000. Daltonlar, proteini PBS'de her seferinde iki saat boyunca bire 2000 oranında üç kez diyalize eder. Etiketli proteinin saflığını daha da arttırmanın yanında.

Bir NI NTA sütunu üzerinde tıslama etiketi tabanlı bir afinite saflaştırması gerçekleştirilir. Bir mililitre NI NTA matrisini 10 mililitre ile yıkayın. PBS daha sonra etiketli diyaliz proteinini kolona uygular ve kolonun üzerinden geçmesine izin verir.

Proteinin NTA matrisine bağlanması nedeniyle çözelti yavaş yavaş mavi renginin bir kısmını kaybedecek, etiketlenmemiş serbest boya akışında kalacaktır. Protein çözeltisi girildikten sonra. Kolon, proteini elüte etmek için kolonu 20 mililitre PBS ile üç kez yıkayın, kolona 500 milimolar ole içeren iki mililitre PBS ekleyin.

Valfi yavaş hıza ayarlayın ve N NI NTA sütunundaki renkli bandı izlerken damla damla elüte yapın. Bahsetmek gerekirse, elüatın bu renkli fraksiyonu, etiketli bir rekombinant protein içerir, EIT'yi bir SLI diyaliz kasetine aktarır ve diyalizden sonra iki litre içinde her biri iki saat boyunca bir ila 2000'lik bir seyreltmede EIT'yi üç kez 10 milimolar NAPI'ye diyalize eder. EIT'yi steril bir 0.45 mikrometre şırınga filtresinden geçirin, ardından beş kez 100 mikrolitrelik numuneler ayırın ve sıvı nitrojen içinde dondurun.

Toplam protein miktarı, her 100 mikrolitrelik alikotta mililitre başına 0.5 ila bir mikrogram olmalıdır. Proteinin invazivliğini değerlendirmek için, alıcı SH SY beş Y insan nöroblastom hücresi içeren 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna mililitre başına beş ila 10 mikrogram etiketli rekombinant disk bir protein içeren ortam ekleyin. Steril cam kapak kızakları üzerinde çözünür GFP etiket diski bir C terminalini yapısal olarak ifade eden 48 ila 72 saat inkübe edilir.

Hücre dışı floresan söndürün, hücreleri ağrı bölgesi için yapıldığı gibi düzeltin ve monte edin, tedavi edilen hücreler, Zack Imaging tarafından eksojen olarak uygulanan rekombinant proteinin istilasını doğrular. Etiketli protein alındığında, konfokal mikroskopi ile oluşturulan görüntülerde alıcı hücrelerin çevresi içinde tespit edilir. Bu Zack, 220 nanometrelik 24 adımda yaklaşık beş mikrometre derinliği kapsar.

Burada, kırmızı ile gösterilen 5 98 ila 7 85 numaralı rekombinant disk bir fragmanı, diskin invazivliğini belirlemek için yeşil ile gösterilen çözünür C terminali GFP etiketli diski ifade eden alıcı hücreler tarafından alınır. MRFP etiketli tam uzunlukta diskten oluşan bir protein agregalı agro bölge, NLF hücrelerinden saflaştırıldı ve burada gösterildiği gibi bu fotoğrafta tarif edildiği gibi alıcı SH, SY beş Y hücresine uygulandı. A-M-R-F-P etiketli disk bir akrozom, bir insan nöroblastomunu istila etti, SH, SY, çözünür GFP etiketli beş Y hücresi, C terminal diski, bir.

Ayrıca, MRFP etiketli disk bir asome, burada gösterildiği gibi çözünür GFP disk bir'i eksprese eden SH SY beş Y nöroblastom hücresine DIA ışığının invazivliğini belirlemek için çözünür GFP etiketli disk bir'i çözünmez agregalara dahil edebildi. Kırmızı ile gösterilen rekombinant disk bir protein malterleri, alıcı hücreyi istila etti, sarı noktalar, çözünür GFP etiketli C terminal diskinin, rekombinant olarak etiketlenmiş agregalara bir alımını gösterir, biri e coli'den eksprese edilir ve saflaştırılır, ayrıca multimerik protein stereotaktik olarak bir sıçanın medial prefrontal korteksine enjekte edildiğinde in vivo olarak nöronlara hücre invazivdi. Zack görüntüleme, nöronal çekirdeğe karşı bir antikorla boyanmış sıçan kortikal nöronunda rekombinant disk bir proteinin varlığını doğrular.

Hücre istilasını incelemek için birinci disk agregaları oluşturmak için size iki yöntem gösterdik. Bu yöntemlerden herhangi birini kullanarak, yabancı DNA'nın transfeksiyonu ile rekombinant gen ekspresyonunun potansiyel olarak kafa karıştırıcı değişkenleri olmadan disk bir agregat alımının hücresel etkilerini araştırabiliriz. Bu teknikler, disk bir protein patolojisinin biyolojik etkilerini araştırmak için uygulanabilir in vitro hücrelerde ve in vivo olarak intraserebral inokülasyon veya hayvan modellerinde başka bir uygulama ile.

Bu tekniklerin, her bir proteine uyarlanan protokolde küçük değişikliklerle sonunda diğer protein agregatlarına da aktarılabileceğinden eminiz. Bu prosedürü yaparken, konfokal mikroskopi görüntülerinin özenli analizi için zaman ayırdığınızdan emin olun.