Name: İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Keşfedin, içte düzeltici potasyum kanallarının modülatörlerini yüksek throughput talyum floresans analizi ile nasıl tarayacağınızı. Bu yöntem, yeni ilaç adaylarının hızlı keşfi için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık hibe 1R21NS073097-01 ve 1R01DK082884 (JSD) ve National Institutes hibe PIER11VCTR Vakfı National Institutes of fon tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Veri işlem: Bir kez veri analizi, ortak bir denemede, F 0 başında başlangıç ​​değerinin her bir kuyunun floresan tepki, F, normalize içerir toplanır. Bu genellikle &quot;statik oran&quot; olarak adlandırılır ve &quot;F / F 0&quot; sembolize edilir. F 0 İndikatör boya hakim olduğu durumlarda statik oranı operasyonu büyük ölçüde, aydınlatma, sinyal toplama disuniformities gibi birçok faktörler düzeltecektir ve hücre sayısı. Plan uygun statik oranını h...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetrasiklin-indüklenebilir ifade vektörü </td></tr><tr><td> T-Rex-HEK293 hücrelerine </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetrasiklin-indüklenebilir hücre hattı </td></tr><tr><td> Lipofektamin LTX / Artı Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfeksiyon reaktifi </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biyolojik </td><td> S11550 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> Higromisin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Hücre kültürü ortamı </td></tr><tr><td> Ücretsiz HBSS-divalent </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Hücre yıkama </td></tr><tr><td> Tripsin-% 0.25 &#39; </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Hücre ayrışma </td></tr><tr><td> Tetrasiklin-HCI </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> İndüksiyon reaktifi </td></tr><tr><td> Diyalizlenmiş FBS </td><td> ATLANTA Biyolojik </td><td> S12650 </td><td> Kaplama medya </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Floresan boya </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Boya yükleme </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tahlil tampon </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tahlil tampon </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> D-Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> Talyum sülfat </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + uyarıcı tampon </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Çözücü </td></tr><tr><td> Sekiz kanallı elektronik pipet </td><td> BIOHIT </td><td> E300 </td><td> 384 Hücre kaplama -kuyucuğu </td></tr><tr><td> BD PureCoat amin kaplı 384 oyuklu plakalar </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Assay mikroplaklar </td></tr><tr><td> Echo 384-Eh polipropilen mikroplak (384PP) nitelikli </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Bileşik kaynağı mikroplaklar </td></tr><tr><td> 384-iyi polipropilen mikroplaklar </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Kombi reaktif dağıtıcı </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 mikroplak yıkayıcı </td><td> Biotek </td><td> ELx405HT </td><td> Otomatik hücre yıkama </td></tr><tr><td> Sıvı işleyici Echo </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo otomatik sıvı taşıma platformu </td><td> Agilent Technologies </td><td> Standart model </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetik görüntüleme plaka okuyucu </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Materyal ve Reaktifler listesi.

İçte düzeltici potasyum kanallarının küçük moleküllü modülatörler için yüksek throughput eleme

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Içe doğrultucu potasyum (Kir) kanal aile Özgül üyeleri hipertansiyon, atriyal fibrilasyon, ve ağrı 1,2 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları için ilaç hedefleri öne vardır. Çoğunlukla, ancak, onların terapötik potansiyeli hatta temel fizyolojik fonksiyonlarını anlamak doğru ilerleme iyi farmakolojik araçların eksikliği yavaşlatıldı. Nitekim, dahilde doğrultucu ailesinin moleküler farmakoloji kadar nanomolar-afinite ve yüksek selektif peptid toksin modülatörleri sayısı 3 keşfedilmiş olan voltaj bağımlı potasyum (Kv) kanalları, S4 süperailesinin gerisinde kalmıştır. Arı zehiri tertiapin toksin ve bunun türevleri 4,5 Kir1.1 ve Kir3 kanallarının potent inhibitörleri olan, fakat peptidler deneysel tedavi edici olarak hem de sınırlı kullanımlı bunların antijenik özelliklere ve zayıf biyo-, metabolik stabilite ve doku penetrans bağlıdır. Güçlü bir geliştirmeve gelişmiş farmakolojik özellikleri ile seçici küçük moleküllü probları tam fizyoloji ve Kir kanallar terapötik potansiyelini anlamak için bir anahtar olacaktır. Akademik bilim adamları daha iyi farmakoloji 6 ihtiyacı moleküler hedefler ve sinyal yolları için prob keşif kampanyalar başlatmak için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Moleküler Kütüphaneler Sondalar Üretim Merkezi Ağ (MLPCN) (NIH) Ortak Fon fırsatlar yaratmıştır. MLPCN araştırmacılar sanayi ölçekli tarama merkezleri ve tıbbi kimya ve bilişim genler ve gen ağlarının işlevi aydınlatmak için küçük-molekül probları geliştirmeniz için size destek erişim sağlar. MLPCN giriş kazanıyor kritik adım yüksek çıktılı tarama (HTS) için müsait bir sağlam hedef veya yol özgü testinin gelişmedir. Burada, bir floresans tabanlı talyum (Tl +) akı assa nasıl geliştirileceğini açıklaryüksek verimli tarama bileşik 7,8,9,10 Kir için kanal işlevi y. tahlil geçirgenlik K + K + türdeş Tl + için kanal gözenek dayanmaktadır. Ticari olarak kullanılan floresan Tl + raportör boya gözenek içinden Tl transmembran akı + tespit etmek için kullanılır. BTC, FluoZin-2, 7,8 ve FluxOR: Tl + akı deneyleri için uygun olan, en az üç ticari olarak temin boyalar bulunmaktadır. Bu protokol, FluoZin-2 kullanılarak analiz gelişimi açıklanmaktadır. Aslında gelişmiş ve çinko göstergesi olarak pazarlanan rağmen, FluoZin-2 sergiler Tl üzerine floresans emisyon + bağlayıcı bir sağlam ve doza bağımlı artış. Biz FluxOR 7,8 sunulmuştu ve böylece 9,10 yapmaya devam etmişlerdir önce FluoZin-2 ile çalışmaya başladı. Ancak, test geliştirme adımları her üç boyalar için temelde aynıdır, ve kullanıcılar kendi özel n için en uygun olan boya belirlemelidireeds. Biz de MLPCN giriş için dikkate alınması gereken ulaşmış olmalıdır test performans kriterleri tartışacağız. Tl + kolayca en K + kanalları nüfuz bu yana, tahlil en K + kanal hedeflerine uyarlanabilir olmalıdır.

Bir tetrasiklin-indüklenebilir ifade sisteminin kullanımı endojen ve faiz Kir kanalıyla Tl + akı ayırmak için uygun bir iç kontrol sağlar. Şekil 1, deney farklı türde kullanılan hücre kaplama haritaları bazı örnekler. Uninduced ya da tetrasiklin ile indüklenen hücre içeren kuyu konumları farklı renk ile gösterilmiştir. Şekil 2A analiz gelişimi ve Bileşik elemesi için optimum Tl + konsantrasyonu belirlemek için kullanılan kaynak plaka haritasını gösterir. Renk degra...

Içe doğru doğrultucu potasyum (Kir), yüksek verim Bileşik elemesi için kanal aktivitesini ölçmek için nicel bir floresan deneyi geliştirilmesi ve doğrulanması için yöntemler sunulmaktadır.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

İçeride doğrultucu potasyum (Kir) kanal ailesinin belirli üyelerinin, hipertansiyon dahil olmak üzere çeşitli bozukluklar için ilaç hedefi olduğu varsayılmaktadır, ...

Bu prosedürün genel amacı, içeri doğru doğrultucu potasyum kanallarının aktivitesini modüle eden yeni bileşikler keşfetmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen bir KIR kanalını eksprese eden tetrasiklin indüklenebilir HK 2 9 3 hücrelerinin bir 384 kuyucuklu plakaya ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücrelerin flu in two adlı floresan talyum raporlayıcı boya ile yüklenmesidir.Ardından, hücrelerdeki bağlanmamış boya yıkanır ve yerine taşıyıcı kontrol veya test bileşikleri içeren analiz tamponu eklenir. Son adım, talyum akışını başlatmak için kuyucuklara stimülasyon tamponu eklenmesidir. Son olarak, KIR kanalı üzerinden talyum iyonlarının hareketini değiştiren bileşikleri belirlemek için bir floresan plaka okuyucu kullanılır.Kötü.Bu yöntemin manuel patch clamp elektrofizyolojisi gibi mevcut tekniklere karşı temel avantajı, araştırmacının aynı anda yüzlerce ve günde binlerce deney gerçekleştirmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, araştırmacının içeriye doğru doğrultucu potasyum kanalı modülatörlerini keşfetmek için binlerce küçük molekül içeren kütüphaneleri taramasına imkan verir. Talyum akışı deneyinden bir gün önce, hücreleri disosiye edin ve beraberindeki makalede açıklandığı şekilde hücre süspansiyonunun yoğunluğunu belirleyin. Ardından, %10 diyalize edilmiş FBS içeren BH ortamı kullanarak, her bir kuyucuğa ilgilenilen bir KIR kanalı geni ile stabil olarak transfekte edilmiş 20.000 monoklonal hücreyi, bir thermo multi drop combi veya çok kanallı pipet yardımıyla BD pure coat Amin kaplı 384 kuyucuklu plakaya ekleyin. Ertesi gün, hücrelerin yapışık olduğundan ve kuyucukların tabanına eşit şekilde dağıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında inceleyin.Ardından, hücre kültürü ortamını kuyu başına 20 µL HBSS analiz tamponu ile değiştirmek için bir ELX 4 0 5 mikroplaka yıkama cihazı kullanın. Bundan sonra, 50 µg flus in two tozunu 100 µL susuz DMSO içinde çözmek için tüpü kısa bir süre santrifüj ederek 2:00 AM D yükleme solüsyonundaki flusları hazırlayın.Şimdi boyaya 50 µL %20 ağırlık/hacim onic F1 27 DMSO çözeltisi ekleyin. Nazikçe pipetleyerek karıştırın. Ardından, 35 mL HBSS analiz tamponuna 150 µL flus in 2:00 AM onic F1 27 ekleyin ve nazikçe karıştırın.Ardından, halihazırda 20 µL HBSS assay.Buffer içeren her bir kuyucuğa 20 µL boya yükleme tamponu ekleyin. Hücreler boya ile yüklenirken hücreleri oda sıcaklığında yaklaşık bir saat inkübe edin. 0,5 g sodyum bikarbonatı 50 mL beş x talyum stimülasyon tamponu içinde taze olarak çözerek bir talyum stimülasyon plakası hazırlayın.Ardından, çözeltiden 50 µL'yi polipropilen 384 kuyuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa ekleyin. Hücreler flus ile yüklendikten 2:00 saat sonra, plakayı bir ELX 4 0 5 mikroplaka yıkayıcı ile yıkayın. Daha sonra, her kuyucuğa 20 µL veya 40 µL HBSS assay tamponu ekleyin; plaka artık deneyler için hazırdır.Talyum ve hücre plaklarını, entegre sıvı dağıtım özelliklerine sahip bir Hema Matsu fonksiyonel ilaç tarama sistemi veya eşdeğer bir kinetik görüntüleme plaka okuyucusuna yerleştirin ve flu oh four gibi floresein tabanlı boyalar için uygun filtreleri kullanın. Ardından, 40 µL HBSS analiz tamponu içeren hücre plağının ilgili kuyucuklarına 10 µL 5X Talyum serisi eklemek için tek seferlik bir ekleme protokolü oluşturun. Daha sonra, en az 10 saniye boyunca 1 Hz örnekleme frekansında bazal floresan değerini kaydedin.Optimal hücre ekimi, yıkama ve yükleme koşulları belirlendikten sonra, plak boyunca kuyucuklar arası floresan değerleri tekdüze ve stabil olmalıdır. Bu sırada, her kuyucuğa talyum uyaran tamponunu aynı anda eklemek için entegre 384 kanallı pipetleyiciyi kullanın ve talyumla indüklenen floresan artışının hızı ve zirve noktası çevrimdışı analiz için kaydedilebilmesi amacıyla kayda en az iki dakika daha devam edin. Deneylerin bir sonraki serisinde, 384 kuyucuklu bir plakanın her sütun ve satırındaki her iki kuyucuktan birine kontrol inhibitörü ekleyerek ve diğer kuyucuklara taşıyıcı kontrol olarak DMSO ekleyerek assay'in tekdüzeliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirin.Çok kanallı pipet kullanın. Hedef KIR kanalının önceden belirlenmiş konsantrasyondaki inhibitörünü her kuyuya 80 µL ve %0,1 DMSO taşıyıcı olacak şekilde 384 kuyucuklu polipropilen bir plakaya pipetleyerek bileşik DMSO plağını hazırlayın. Bu işlem, bilinen bir inhibitörün A1 kuyusundan başlanarak B2 kuyusuna ve bu şekilde B24 kuyusuna kadar dönüşümlü olarak eklenmesiyle gerçekleştirilir.Bu prosedürü, B1 kuyucuğundan başlayarak A24 kuyucuğuna kadar DMSO ile tekrarlayın. Şimdi hücre, bileşik ve talyum stimülasyon plakalarını plaka okuyucuya yerleştirin. Ardından, 20 µL HBSS assay tamponu içeren hücre plağının ilgili kuyucuklarına, 2X konsantrasyondaki bileşik serisinden 20 µL eklemek için bir ekleme protokolü oluşturun.Bileşikleri hücre plağına ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakikaya kadar inkübe edin. İki floresan için bazal akışları en az 10 saniye boyunca kaydedin. Ardından, hücre plağının her kuyucuğuna 10 µL beş katlı talyum tamponu ekleyin.Sonuçların tekrarlanabilirliğini belirlemek için deneyi art arda üç gün boyunca tekrarlayın. Z prime değerini hesaplamak için DMSO içindeki talyum akışını ve ilaçla işlem görmüş hücreleri kullanın. İki kuyu popülasyonu arasındaki kuyudan kuyuya değişkenliğin istatistiksel bir ölçüsü olan Z prime değerini, P'nin inhibe edilmemiş akış değeri ve N'nin tam inhibe edilmiş akış değeri olduğu varsayılarak, P ve N'nin ortalamaları ile standart sapmalarına dayanan şu formül kullanılarak hesaplayın.Üç ayrı günde ZPrime değerleri 0,5'e eşit veya 0,5'ten büyük olan bir analiz, yüksek kapasiteli tarama için uygun kabul edilir. Bu şekiller, farklı deney türlerinde kullanılan hücre ekim haritalarına bazı örneklerdir. İndüklenmemiş veya tetrasiklin ile indüklenmiş hücreler içeren kuyucukların konumları farklı renklerle belirtilmiştir.Bu şekil, analiz geliştirme ve bileşik taraması için optimal talyum konsantrasyonunu belirlemek amacıyla kullanılan kaynak plaka haritasını göstermektedir. Renk gradyanı, %100'den %0,002 talyuma kadar uzanan üç katlı dilüsyon serisini temsil eder ve burada, düşükten yükseğe talyum akı değerlerini belirten, soğuktan sıcağa renklerle gösterilen temsili bir floresans yoğunluk haritası yer almaktadır. Talyum CRC'ye dört parametreli lojistik fonksiyonun uydurulduğu burada gösterilen hücre ekim haritası, %15 talyum olan bir EEC 80 değerini belirlemek için kullanılır.Bu şekil, bir deneyin DMSO toleransını belirlemek için kullanılan kaynak plaka haritasını göstermektedir. Birinci ve 24. sütunlar yalnızca deney tamponu içerirken, renk gradyanı %10'dan 0,01% DMSO'ya kadar uzanan iki katlı dilüsyon serisini belirtmektedir; burada düşük talyum akı değerlerinin daha koyu mavi ile gösterildiği temsili bir floresan yoğunluk haritası yer almaktadır. Belirtilen DMSO konsantrasyonlarını içeren kuyucuklardan kaydedilen ortalama talyum akı değerleri burada özetlenmiştir.Şu anki şekil, bir KIR kanalının bilinen inhibitörleri için konsantrasyon yanıt eğrileri oluşturmak amacıyla kullanılan kaynak plaka haritasını göstermektedir. Her bileşik farklı bir renkle belirtilmiştir ve tipik olarak üç katlı dilüsyon serisi şeklinde plakalanmıştır. Burada temsili bir floresan yoğunluk haritası gösterilmekte olup, bu şekil, geliştirme ve optimizasyon sonrası inhibitör tarafından talyum akışının doza bağlı inhibisyonunu göstermektedir.Talyum akımı analizi, çeşitli rutin farmakoloji analizlerini gerçekleştirmek için de kullanılabilir. Talyum akımı analizi daha önce voltaj ve ligasyon bağımlı potasyum kanalları, seçici olmayan katyon kanalları ve hatta potasyum taşıyıcıları ile kullanım için uyarlanmıştır. Talyum ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür uygulanırken eldiven kullanımı ve uygun atık bertarafı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

G-protein bağımlı içe düzeltici K ile etkileşim ilaçların belirlenmesi için gerçek zamanlı tarama...

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

Optik biosensor teknikleri canlı hücrelerin içindeki plazma zarının hemen yakınındaki kütlesinde değişiklikleri algılar ve bir tek hücre ve hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları takip izin verebilir. Bu protokol, bu yaklaşımı kullanarak sağlam hücrelerdeki G-protein bağlı reseptörler ile potasyum kanallarının modülasyonu algılanmasını anlatacağız.

G-protein bağlı reseptörler ile Potasyum kanallarının modülasyonunu Algılama Label içermeyen optik Biyosensör kullanımı

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

HCN kanalları ve bunların yardımcı alt birimi arasındaki etkileşim Majör Depresif Bozukluk bir tedavi hedefi olarak tespit edilmiştir. Burada, bu protein-protein etkileşimi, küçük molekül inhibitörleri belirlemek için bir floresan polarizasyon tabanlı bir yöntem sunulmuştur.

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

Mevcut protokol, nöronal K-Cl ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı blotlama tekniğinin uygulanmasını vurgulamaktadır. Protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de batı lekelenmesi yoluyla KCC2 fosforilasyonunun araştırılmasını açıklamaktadır. Ayrıca, KCC2 etkinliğini doğrulamak için ek yöntemler bu metinde kısaca vurgulanmıştır.

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

İyon kanallarının farmakolojik olarak hedeflenmesi, solid tümörlerin tedavisinde umut verici bir yaklaşımdır. Kanser hücrelerinde iyon kanalı fonksiyonunu karakterize etmek ve iyon kanalı modülatörlerinin kanser canlılığı üzerindeki etkilerini test etmek için ayrıntılı protokoller sağlanmıştır.

Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Keşfedin, içte düzeltici potasyum kanallarının modülatörlerini yüksek throughput talyum floresans analizi ile nasıl tarayacağınızı. Bu yöntem, yeni ilaç adaylarının hızlı keşfi için güvenilir bir araç sunar.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Daha fazla video keşfet