İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Bu prosedürün genel amacı, içe doğru doğrultucu potasyum kanallarının aktivitesini modüle eden yeni bileşikleri keşfetmektir. Bu, tetrasiklin ile indüklenebilir, HK 2 9 3 hücrelerinin ilk kaplaması ile gerçekleştirilir ve 384 oyuklu bir plakaya ilgilenilen bir KIR kanalını ifade eder. İkinci adım, hücrelere flu in two adlı floresan talyum raportör boya ile yüklenmektir.

Daha sonra, dahil edilmemiş boya hücrelerden yıkanır ve bir araç kontrolü veya test bileşikleri içeren tahlil tamponu ile değiştirilir. Son adım, talyum akışını başlatmak için kuyucuklara bir uyarı tamponunun eklenmesidir. Sonuç olarak, talyum iyonlarının KIR kanalı boyunca hareketini değiştiren bileşikleri tanımlamak için bir floresan plaka okuyucu kullanılır. Fakir.

Bu yöntemin manuel yama kelepçesi elektrofizyolojisi gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, araştırmacının aynı anda yüzlerce deney ve günde binlerce deney gerçekleştirmesini sağlamasıdır. Bu yöntem, Araştırmacının, içe doğru doğrultucu potasyum kanallarının modülatörlerini keşfetmek için binlerce küçük molekülden oluşan kütüphaneleri taramasına olanak tanır: Talyum akısı deneyinden bir gün önce, hücreleri ayırın ve ekteki el yazmasında açıklandığı gibi hücre süspansiyonunun yoğunluğunu nicelleştirin. Daha sonra, bir BD saf kaplama Amin kaplı 384 oyuklu plakanın her bir oyuğunda ilgilenilen bir KIR kanal geni ile stabil bir şekilde transfekte edilmiş% 10 diyalize edilmiş FBS plakası 20, 000 monoklonal hücre içeren BH ortamını bir termo çok damla kombi veya çok kanallı bir pipetleyici kullanarak kullanın, ertesi gün, hücrelerin yapışık olduğundan ve kuyucukların dibine eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında inceleyin.

Ardından, hücre kültürü ortamını HBSS testi ile değiştirmek için bir ELX 4 0 5 mikroplaka yıkayıcı kullanın. Kuyucuk başına 20 mikrolitre tamponlayın. Bundan sonra, 50 mikrogram gribi 100 mikrolitre susuz DMSO'da iki toz halinde çözmek için tüpü kısaca santrifüjleyerek fluları 02:00 D yükleme solüsyonunda hazırlayın.

Şimdi boyaya hacim başına %20 ağırlıkça 50 mikrolitre onic F1 27 DMSO çözeltisi ekleyin. Hafifçe pipetleyerek karıştırın. Daha sonra saat 02:00'de 150 mikrolitre grip ekleyin, onic F1 27 ila 35 mililitre HBSS testi yapın, tamponlayın ve hafifçe karıştırın.

Daha sonra, zaten 20 mikrolitre HBSS testi içeren her bir oyuğa 20 mikrolitre boya yükleme tamponu ekleyin. Arabellek. Hücreler boya ile yüklenirken hücreleri oda sıcaklığında yaklaşık bir saat inkübe edin. 0.5 gram sodyum bikarbonatı 50 mililitre beş x talyum uyaran tamponunda taze olarak çözerek bir talyum uyarı plakası hazırlayın.

Daha sonra, hücreler saat 2: 00'de grip ile yüklendikten sonra, polipropilen 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre çözelti ekleyin. Plakayı bir ELX 4 0 5 mikroplaka yıkayıcı ile yıkayın. Daha sonra, 20 mikrolitre veya 40 mikrolitre HBSS testi ekleyin. Her bir kuyucuğa geri tamponlayın ve plaka artık deneyler için hazırdır.

Talyum ve hücre plakalarını bir Hema Matsu fonksiyonel ilaç tarama sistemine veya entegre sıvı dağıtım özelliklerine sahip eşdeğer kinetik görüntüleme plakası okuyucusuna yükleyin ve grip oh four gibi floresein bazlı boyalar için uygun filtreleri kullanın. Bundan sonra, 40 mikrolitre HBSS tahlil tamponu içeren hücre plakasının karşılık gelen kuyucuklarına 10 mikrolitre beş X Talyum serisi eklemek için tek bir ekleme protokolü oluşturun. Ardından, temel floresansı en az 10 saniye boyunca bir hertz örnekleme frekansında kaydedin.

Kuyudan kuyuya floresan, optimum hücre kaplaması, yıkama ve d yükleme koşulları oluşturulduktan sonra plaka boyunca düzgün ve stabil olmalıdır. Bu arada, talyum uyaran tamponunu her bir kuyucuğa aynı anda eklemek için entegre 384 kanallı pipetleyiciyi kullanın ve talyumun neden olduğu floresan artışının hızı ve zirvesi çevrimdışı analiz için yakalanacak şekilde kayda en az iki dakika devam edin. Bir sonraki deney serisinde, 384 kuyulu bir plakanın her bir sütununun ve sırasının her bir oyuğuna bir kontrol inhibitörü kaplayarak tahlilin tekdüzeliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirin ve diğer kuyucuklara bir araç kontrolü olarak DMSO ekleyin.

Çok kanallı bir pipetleyici kullanın. Hedef KIR kanalının bir inhibitörünü daha önce kuyu başına 80 mikrolitre ve %0.1 DMSO aracında 384 kuyulu bir polipropilen plakaya pipetleyerek bileşik DMSO plakası yapın. Bu, A kuyusu bir'den başlayarak ve B kuyusu iki'ye alternatif olarak bilinen bir inhibitör eklenerek yapılır ve bu şekilde B 24 kuyusuna kadar devam eder.

Bu prosedürü DMSO kuyusundan başlayarak, B kuyusundan başlayarak ve bu şekilde A 24 kuyusuna kadar tekrarlayın. Şimdi hücreyi, bileşik ve talyum uyaran plakalarını plaka okuyucuya yükleyin. Ardından, 20 mikrolitre HBSS tahlil tamponu içeren hücre plakasının karşılık gelen kuyucuklarına iki X konsantrasyonlu bileşik serisinden 20 mikrolitre eklemek için iki ekleme protokolü oluşturun.

Bileşikleri hücre plakasına ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakikaya kadar inkübe edin. Başlangıç griplerini en az 10 saniye boyunca iki floresan olarak kaydedin. Daha sonra hücre plakasının her bir oyuğuna 10 mikrolitre beş x talyum tamponu ekleyin.

Sonuçların tekrarlanabilirliğini belirlemek için deneyi takip eden üç günde tekrarlayın. Z prime için bir değer hesaplamak için DMSO ve ilaçla tedavi edilen hücrelerde talyum akışını kullanın. İki kuyu popülasyonu arasındaki kuyudan kuyuya değişkenliğin istatistiksel bir ölçüsü, P ve N'nin ortalamalarına ve standart sapmalarına dayalı olarak bu formülü kullanarak Z asalını hesaplar, burada P engellenmemiş akı değeridir ve N tamamen engellenmiş akı değeridir.

Üç ayrı günde 0,5'e eşit veya daha büyük ZPrime değerlerine sahip bir testin, yüksek verimli tarama için uygun olduğu kabul edilir. Bu şekiller, farklı deney türlerinde kullanılan hücre kaplama haritalarının bazı örnekleridir. İndüklenmemiş veya tetrasiklin ile indüklenmiş hücreler içeren kuyucukların konumları farklı renklerde belirtilmiştir.

Bu şekil, tahlil geliştirme ve bileşik taraması için en uygun talyum konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan kaynak plakası haritasını göstermektedir. Renk gradyanı, %100 ila %0.002 talyum arasında değişen üç katlı seyreltme serisini temsil eder ve burada, düşük ila yüksek talyum akı değerlerini gösteren, soğuktan sıcağa renklere sahip temsili bir floresan yoğunluk haritası verilmiştir. Burada gösterilen hücre kaplama haritası, talyum CRC'ye dört parametreli lojistik fonksiyonun uymasıyla %15 talyumun EEC 80 değerini belirlemek için kullanılır.

Bu şekil, bir testin DMSO toleransını belirlemek için kullanılan kaynak plakası haritasını göstermektedir. Birinci ve 24 numaralı sütunlar yalnızca tahlil tamponu içerirken, renk gradyanı %10 ila %0.01 DMSO arasında değişen iki katlı seyreltme serisini gösterir ve burada daha koyu mavi ile gösterilen düşük talyum akı değerlerine sahip temsili bir floresan yoğunluk haritası verilmiştir. Belirtilen DMSO konsantrasyonlarını içeren kuyulardan kaydedilen ortalama talyum akışı değerleri burada özetlenmiştir.

Şimdi bu şekil, bir KIR kanalının bilinen inhibitörleri için konsantrasyon tepki eğrileri oluşturmak için kullanılan kaynak plakası haritasını göstermektedir. Her bileşik farklı bir renkle gösterilir ve tipik olarak üç katlı bir seyreltme serisi olarak kaplanır. Burada temsili bir floresan yoğunluk haritası gösterilmiştir ve bu şekil, geliştirilmesi ve optimizasyonundan sonra talyum akısı by-in inhibitörünün doza bağlı inhibisyonunu göstermektedir.

Talyum akısı testi, çeşitli rutin farmakoloji tahlillerini gerçekleştirmek için de kullanılabilir. Talyum akı deneyi, daha önce voltaj ve bağlanmış potasyum kanalları, seçici olmayan katyon kanalları ve hatta potasyum taşıyıcıları ile kullanım için uyarlanmıştır. Tellium ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven kullanımı ve uygun atık bertarafı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.