İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Aşağıdaki deneyin genel amacı; tekdüze, üç boyutlu nöroendokrin tümör steroidleri üretmek için kolay ve basit bir yöntem ile bu steroidlerin histolojisini incelemek için HistoGel gömme işlemini gerçekleştirecek basit bir yöntem geliştirmektir. Bu işlem, tek hücre süspansiyonu halindeki insan nöroendokrin tümör hücrelerinin ekildiği 24 kuyucuklu plakaların aeros ile eşit şekilde kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Plaka daha sonra inkübatördeki bir orbital çalkalayıcıda gece boyunca 40 RPM'den düşük bir hızda inkübe edilir ve ardından inkübatördeki sabit bir rafa aktarılır.

Sferoidler üçüncü veya dördüncü güne kadar oluşacaktır; histolojilerini incelemek amacıyla büyümeleri ve bütünlükleri faz kontrast mikroskopisi ile izlenir. Rutin parafin işlemleri öncesinde, 3D steroidler ısıtılmış HistoGel içine gömülür; faz kontrast mikroskopisi sırasında alınan görüntülere dayalı olarak nöroendokrin tümör 3D steroidlerinin büyümesini gösteren sonuçlar elde edilir. 3D steroidlerin histolojisi, 3D steroidlerin parafin blok kesitlerinin H&E ve immünohistokimyasal boyamaları ile analiz edilir.

Bu tekniğin mevcut yönteme göre temel avantajı; basit, kolay, güvenilir ve maliyet etkin olmasıdır. Bu yöntem, nöroendokrin tümör hastaları için terapötik ilaçların hızlı bir şekilde tanımlanmasına yardımcı olarak ilaç keşfi alanındaki araştırmaları kolaylaştırabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, başlangıçta boyutları tekdüze şekilde şekillenmiş 3D steroidler yetiştirirken zorluk çekeceklerdir.

Buradaki temel nokta, 24 kuyucuklu plakalarınızın agros ile eşit şekilde kaplandığından ve ayrıca tek hücre süspansiyonlarınızın iyi dağıldığından ve doğru olduğundan emin olmaktır. 3D steroidlerin histolojisini anlamak için paren işleme ve immünokimyasal boyama yapmamız gerekmektedir. 3D steroidlerin histolojik gömmesi, günün ilerleyen saatlerinde gösterilecek olan kritik adımdır. 24 kuyucuklu plakaları kaplamak için %1'lik augurs hazırlamak amacıyla, 250 ila 500 mililitrelik bir şişede 100 mililitre deiyonize suya bir gram aeros ekleyin ve aerosu sterilize etmek için otoklavlayın.

Şişeyi yaklaşık bir saat boyunca 70 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Aeroslerin 70 °C'ye soğuması için, aeroslerin her zaman steril tutulması gerekir. Bir biyogüvenlik kabininde, bir tekrarlayıcı pipet kullanarak 2 24'ün her kuyucuğuna 200 µL aeros dağıtın.

Bu protokol için düz dipli kuyucuklu plakalar kullanın. Faz kontrastlı mikroskop altında görüntüleme yapılabildiği sürece her türlü 24 kuyucuklu düz dipli plaka uygun olacaktır; aerozollerin kuyucuğu eşit şekilde kaplamasını sağlamak için onları kuyucuk içinde döndürün. Sferoidlerin tutarlı küresel şekiller oluşturabilmesi için konkav bir yüzey oluşturmaya yönelik 200 µL aerozol kullanımı optimaldir.

Yaklaşık 10 dakika sonra, aeros kaplı 24 kuyucuklu plakalar kullanıma hazır hale gelir. Bu deneyde kullanılan bon one hücreleri, %10 FBS içeren D-M-E-M-F 12 ortamında, 37 °C sıcaklıkta, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, steril bir doku kültürü kabında tutulan insan pankreatik nöroendokrin tümör veya NET hücreleridir. Monolayer bon one hücreleri %70 ila %80 konfluense ulaştığında, biyogüvenlik kabininde tek hücre süspansiyonları hazırlanır.

Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın; bir mililitre tripsin ekleyip 37 °C'de beş dakika inkübe ederek hücreleri kapta yerinden ayırın. Tüm hücrelerin kaptan ayrıldığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin ve ardından tripsine dokuz mililitre büyüme besiyeri ekleyin.

Hücrelerin homojen bir tek hücre süspansiyonu haline gelmesini sağlamak için hücreleri pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı çekin. Hücreleri süzmek için 70 mikronluk bir hücre süzgeci kullanın. Hücre sayımı yaptıktan sonra süzülen hücreleri toplayın ve %10 FBS içeren D-M-E-M-F 12 büyüme ortamında mililitre başına 5.000 hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın.

Ekilecek hücre sayısı, altıncı gündeki sferlerin boyutuna dayanarak ampirik olarak belirlenmelidir. İdeal olarak, 300 ile 400 µm arasında bir sfer çapı elde etmek istersiniz. Bu nedenle, kuyuk başına 200 µL'ye bin hücre ekliyoruz.

Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış 24 kuyucuklu plakaların aeros kaplı her bir kuyucuğuna 200 µL tek hücre süspansiyonu ekleyin ve evaporasyonu önlemek için 24 kuyucuklu plakaları steril sızdırmaz bantla kapatın. Bon one hücreleri içeren aeros kaplı 24 kuyucuklu plakaları, %5 karbon dioksit içeren, 37 °C sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatörde, orbital sarsıcının çok düşük hızındaki ajitasyonunda gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah plakaları sabit bir platforma taşıyın ve kültürlerin inkübatörde büyümesini sağlayın. Her üç günde bir.

Plakaların her bir kuyucuğuna 200 µL büyüme ortamı ekleyin. Fenoid yapıları bozmamak için pipet ucunu kuyucuğun kenarına değdirin ve ortamın duvar boyunca süzülerek kuyucuğa akmasını sağlayın; 24 kuyucuklu plakalardaki OID oluşumunu mikroskop altında izleyin. 3D steroidlerin ilaç tedavisine kültürün altıncı gününde başlanır.

Sferoidlerin çapı yaklaşık 300 ila 400 mikron olduğunda, bu durum altıncı gündeki ilaç tedavisi için sıfırıncı gün olarak kabul edilir. İlaç tedavilerinin her bir kuyucukta 1x son konsantrasyonda olmasını sağlamak için plakaların her kuyucuğu yaklaşık 400 mikrolitre besiyeri içerir; her bir tedavi dozu için istenen konsantrasyonun üç katını hazırlayın, uygun miktardaki ilaç stokunu 15 mililitrelik konik bir tüp içinde 5 mililitre büyüme besiyerinde seyreltin, bu miktar sekiz replika için yeterlidir. 24 kuyucuklu plakaların her satırındaki PHE'ler; vehikül, doz 1, 2, 3, 4 ve 5 olarak karakterize edilir. Her bir 24 kuyucuklu plaka üzerinde her bir tedavi dozu için dört replika bulunmaktadır.

Genellikle 3D phe'ler, her bir tedavi dozu için en az sekiz tekrarlarla sonuçlanacak şekilde en az 2 adet 24 kuyucuklu plaka içerisinde işleme alınır. Tedavi maddesini her bir kuyucuğa eklemeden önce, 3D steroidin yüzme özelliği nedeniyle tavan bandındaki tüm yoğuşmanın kuyucuğa indiğinden emin olmak için 24 kuyucuklu plakaları merkezleterek çöktürün. Santrifüjden sonra her bir kuyucuktaki besiyeri uzaklaştırılmaz.

Sferoidlerin bozulmasını önlemek için, tedavinin her dozundan 200 microliter'ı her bir kuyucuğun duvarı boyunca uygun kuyucuklara dikkatlice ekleyin. 24 kuyucuklu plakaları sızdırmazlık bandı ile kapatın ve kültürleri, hava içinde %5 carbon dioxide içeren 37 degree Celsius sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. İlaç tedavisinden sonra, belirlenen her zaman noktasında 3D steroid kültürlerini faz kontrast mikroskobu ile izleyin.

PHE'ler 10 x objektif ile görüntüleme alanını hızla aştığı için 5 x objektif idealdir. HistoGel öncesindeki her zaman noktasında, her kuyucuktaki steroidin görüntülerini edinin. Gömülmüş net 3D steroidler 24 kuyucuklu plakalardan toplanır ve %10 Formin içinde sabitlenir.

Soğuk HistoGel içeren bir tüpü suyla doldurulmuş bir beherin içine yerleştirin. Beheri mikrodalga fırında bir dakika veya jel tamamen sıvılaşana kadar ısıtın. İşlem süresince tüpü aynı su dolu beherin içinde tutun.

Tek kullanımlık plastik bir pipet kullanarak tüm steroidi bir biyopsi kriyokalıba aktarın. Steroidin biyopsi kriyokalıbının dibine çökmesi için bir dakika bekleyin.

Biyopsi kriyokalıbındaki sıvıyı Kim wipe ile temizlemeye çalışın. Bir kürdan kullanarak steroidi, biyopsi kriyokalıbının alt kısmındaki merkeze çok nazikçe itin. Ardından, steroidin biyopsi kriyokalıbının merkezinde kalmasını sağlamak için Pasteur pipetini çok nazikçe kullanın.

Biyopsi kriyokalıbına ısıtılmış HistoGel'den ince bir tabaka ekleyin. Çok fazla HistoGel eklemeyin. Steroidleri merkezde stabilize edecek kadar eklemeniz yeterlidir.

HistoGel içindeki steroidin oda sıcaklığında bir ila iki dakika veya HistoGel katılaşana kadar beklemesine izin verin. Biyopsi kriyokalıbının geri kalanını ısıtılmış HistoGel ile doldurun ve oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Bu OID'lerin HistoGel bloğunu biyopsi kriyokalıbından çıkarmadan hemen önce.

Kriyo kalıbı bir dakika boyunca buz üzerinde bekletin, ardından sağlam steroid HistoGel bloğunu dışarı çıkarın. Bloğu bir parça biyolojik sargı ile sarın ve bir doku ve biyopsi kasetine yerleştirin. Doku ve biyopsi kasetini %70 ethanol içeren bir kapta saklayın.

Ardından, aeros kodlu 24 kuyucuklu plaklarda büyütüldüğünde, parafin gömme işlemi için rutin doku işleme prosedürleri uygulanır. Farklı nöroendokrin tümör (NET) hücre hatları, burada görüldüğü gibi farklı morfolojiler sergiler. İnsan pankreas NET hücre hattı BON-1 ve insan akciğer NET hücre hattı H727, 3D steroidler oluşturmuştur.

Buna karşılık, qgp bir. İnsan pankreatik net hücreleri, steroid olarak kabul edilmeyen, üzüme benzer büyük gözenekli kütleler sergiler. Agros kaplı 24 kuyucuklu plaka üzerine hücreler ekildikten sonra, çok hücreli steroid oluşumu tipik olarak üçüncü veya dördüncü güne kadar gerçekleşir ve steroidler altıncı güne kadar daha yuvarlak hale gelir.

Besin ve oksijen kısıtlılığı nedeniyle, steroidin yoğun çekirdeğindeki hücreler yaklaşık 10. günde ölmeye başlar ve 17. güne gelindiğinde steroidler parçalanmaya başlar. Büyük boyutları veya bazı durumlarda nekrotik kordonun dışarı atılması nedeniyle, steroidler genellikle 1000 mikron çapına kadar büyüyebilir.

Bu deneyde, histon deasetilaz inhibitörü trikes statin A veya TSA ile tedaviye başlamak için altıncı günkü 3D steroidler başlangıç noktası olarak seçilmiştir. Histon deasetilaz inhibitörlerinin NET hücreleri üzerinde antiproliferatif ve proto etkiler gösterdiği daha önce bildirilmiştir. Bu görüntüler, tedavinin başlangıcında ve 24, 48, 72 ve 96 saat sonrasındaki 3D steroidlerin morfolojisini takip etmektedir.

V, bu durumda DMSO olan araçla (vehicle) yapılan işlemi belirtir. D1'den D5'e kadar olan ifadeler, artan TSA dozlarıyla yapılan işlemleri temsil eder. Her bir bireyin OID boyutu, özel olarak geliştirilmiş bir MATLAB bilgisayar programı ile otomatik olarak tahmin edilmiştir.

Her bir zaman noktasında, TSA tedavisi doz başına en az sekiz sph ölçülmüş ve sonuçlar bu grafikte araç kontrolüne göre çizilmiştir. Tüm TSA dozları, 3D OID'lerde belirli derecede büyüme inhibisyonu göstermiştir. 125 nano molar ve 250 nano molar TSA konsantrasyonlarında, net 3D steroidin histolojisini anlamak amacıyla 3D steroidlerin büyümesi güçlü bir şekilde baskılanmıştır.

17 gün boyunca kültüre edilmiş 3D steroid üzerinden H&E boyama ve immünohistokimyasal boyama gerçekleştirilmiştir. KI 67, çoğalan hücreler için bir marker iken, cleaved caspase three apoptotik hücreler için bir markerdır. Sonuçlar, 3D steroidin dış katman hücrelerinin aktif olarak çoğaldığını, ancak çekirdekteki hücrelerin çoğunlukla nekrotik veya apoptotik olduğunu göstermektedir.

Bu prosedürü takiben, bu 3D steroidlerin hücre canlılığını belirlemek amacıyla hücre titer glow analizi gibi ek analizler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, kanser araştırmalarında terapötik ilaç keşfini kolaylaştıracak yüksek kapasiteli taramalar yapmak için 96 kuyucuklu plakalara genişletilebilir.