Name: Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Öğrenin, primer insan T hücrelerini piggyBac transposon sistemiyle genetik olarak nasıl modifiye edeceğinizi. Bu viral olmayan yöntem, uzun süreli transgen ekspresyonu sağlayarak immünoterapi araştırmalarında güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SS TBMM Programı aracılığıyla Grad Eğitimi Hibe içine HHMI Med tarafından kısmen desteklenmektedir. MHW Gazi İşleri Bakanlığı bir kariyer geliştirme ödülü ve Dr ve Bayan Harold M. Selzman ve cömert destek kısmen desteklenmektedir. Bu çalışma aynı zamanda NIH lenfoma SPORE hibe P50CA126752 ve NIH R01 DK093660 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Gün 0 1. Insan kanından izole edilmesi PBMC&#39;ler <ol><li> Na-heparin Vacutainer tüpler içine Damara kullanarak taze insan kanı 20 ml toplayın. </li><li> Karışım kan ve 1:1 İleri RPMI 1640 (v / v) oranı kullanılmıştır. </li><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne (25 ° C) 20 ml Lymphoprep orta ekleyin. Lymphoprep üstüne kan RPMI 1.640 karışımı yavaşça tabakası 25-30 ml. </li><li> Frensiz 40 dakika boyunca 400 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1x PBS (25 ° C) 10 ml içine bir pipet kullanarak farklı ve bulanık katmanlar hem toplayın ve 1x PBS ile 50 ml hacim getirmek. </li><li> 10 dakika boyunca 450 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tamamen süpernatant aspire ve Gelişmiş RPMI 1.640 20 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire. 5 ng / ml rhIL-15 ile desteklenmiş tam bir T-hücresi ortamı 10 ml 37 ° C sıcaklıkta önceden ısıtılmış </li><li> 24 çukurlu bir doku kültür kat hücreleri ve plaka sayısını/ iyi tam T-hücresi medyada 2 x 10 6 hücre at ed plaka 5 ng / ml rhIL-15 Çevre kuyuları için steril su ekleyin ile desteklenmiş. 37 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde gece boyunca inkübe ° C,% 5 CO2. </li></ol> 1. Gün 2. T hücrelerinin uyarılması için anti-CD28 ve anti-CD3 antikoru ile kaplama levhaları <ol><li> 1 ug / ml her biri arasında bir konsantrasyonda steril su içinde anti-CD28 ve anti-CD3 antikorları ile seyreltilir. </li><li> Olmayan bir kaplanmış doku kültür 24 kuyulu plakanın kuyularına 5 işaretli her bir 500 ul antikor solüsyonu eklenir. </li><li> Kuyuların dinlenmek için steril su ekleyin. 4 ° C buzdolabında shrink wrap ve yerine plaka sarın. </li></ol> 3. Uyarılmamış T-hücrelerinin Nucleofection <ol><li> 37 Prewarm T-hücresi ortamı ° C ve rhIL-15 5 ng / ml ile takviyesi. Nucleofector çözelti 2,25 ml Nucleofector Ek 1 500 ul ekleyerek komple nucleofector çözeltisi hazırlayın. </li><li> Aliquot 5, ug transpozon (Zeo-PT-CMV-eGFP) ve 1.5 ml mikrofüj tüpüne transposase (pCMV-piggyBac) her Not:. optimal gen aktarımı için transposase ve transpozon DNA miktarını optimize etmek için ve en aza indirmek gerekli olabilir hücresel toksisite. Plazmid isteğe göre yazarlar elde edilebilir. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe 24 gözlü doku kültür plakasının ikinci Hasat PBMC&#39;ler. Hücrelerin say. Flow sitometri süresince kontrol olarak kullanılmak üzere 2 x 10 6 hücre kaydedin. </li><li> 400 xg, 5 dk bir 15 ml tüp ve santrifüj 7-10 x 10 6 hücre ekleme, süpernatant ve parmak hareketiyle pelet aspire. </li><li> Gevşetilmiş hücre peleti, T hücre komple nucleofection çözelti 100 ul ekle. </li><li> Plazmid içeren tüp çözüm hücre karışımı ekleyin. </li><li> Nucleofection küvetin dibine çözüm hücre plazmid karışımı ekleyin. Kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun. </li><li> Pro yardımıyla hücreler NucleofectU-014 gram (uyarılmamış T-hücreleri, insan, <a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a> ). </li><li> Hemen küvetine rhIL-15 ile önceden ısıtılmış medyanın 500 ul ekleyin. RhIL15 ile önceden ısıtılmış medya 1.5 ml içeren 24 kuyulu plakanın bir kuyu için hücre transfer edin. </li><li> 37 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde gece boyunca inkübe ° C,% 5 CO2. </li></ol> 2. Gün 4. T hücreleri belirgin olmayan Uyarım <ol><li> Hasat hücreleri ve hücre sayıları belirler. GFP pozitif hücrelerin sıklığını belirlemek için flow sitometri için 0.5 x 10 6 hücre kenara koyun. Kontrolleri gibi non-transfekte edilmiş PBMC&#39;ler kullanın. </li><li> Olmayan doku kültürü kaplı plaka CD3/28 antikor solüsyonu aspire ve T hücre ortamı ile her yıkayınız. </li><li> Tam CTL medya ml başına 0.5 x 10 6 hücre de nucleofected hücreler süspanse5 ng / ml rhIL-15 ile desteklenmiş. 2.0 ml olmayan bir doku kültür plakasının 4 kuyu içinde nucleofected hücrelerinin her ekleyin. De 5 inci 0.5 x 10 6 sigara nucleofected hücreleri ekleyin. </li><li> 37 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 3 gün süre ile inkübe ° C,% 5 CO2. </li></ol> 5. Gün <ol><li> Kaplı olmayan doku kültür plakasının ikinci uyarılmış T-hücreleri hasat etmek. </li><li> 0.7 bir 24 iyi kaplı doku kültürü plaka hücreleri sayma ve replate x 10 5 ng / ml IL-15 ile 6 hücre / T hücre medya ml. </li></ol> 7. Gün 7. Gen Ekspresyon Analizi <ol><li> Hasat hücreleri, anti-insan CD8 antikor ile leke (aynı zamanda, anti-CD3 ve anti-CD4 kullanabilir) ve% GFP tanımı için akış sitometrisi ile analiz eder. </li></ol> Gün 8 (İsteğe bağlı) 8. T hücrelerinin genişlemesi <ol><li> Transfeksiyondan sonra, 8. günde, T-hücreleri, T replated edilebilir16 daha fazla genişleme için çukur başına 0.7 x 10 6 hücre bir yoğunlukta IL-15 ile hücre ortamı. </li></ol>

<ol><li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses%3A+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156(1989).</li>
<li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397(1995).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473(2005).</li>
<li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115(2009).</li>
<li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707(2010).</li>
<li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139(2007).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826(2009).</li>
<li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427(2010).</li>
<li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , In Press (2011).</li>
<li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531(2011).</li>
<li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531(2010).</li>
<li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837(2009).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133(2011).</li>
<li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells%3A+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239(2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305(2010).</li>
<li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan yöntem, primer insan T hücrelerinin kararlı transgen değiştirilmesini sağlar. Biz daha önce bir muhabir gen (en fazla 4 hafta), olmayan bir immünojenik intihar gen, evlatlık immünoterapi için bir kimerik antijen reseptör (100 günden fazla) için, ifade T hücreleri değiştirmek için piggyBac transpozon sisteminin kullanımını test ettik ve immünsüpresif ilaçlar 7,13-15 direnç mühendisi. Evlatlık immünoterapi ve diğer uygulamalar için T hücrelerinin Sigara viral modifikasyonu retroviral t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Gelişmiş RPMI 1.640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Fetal Bovine Serum </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX-I Ek </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan IL-15 Rekombinant Protein </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> EndoFree Plazmid Maxi Seti </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> İnsan T Hücre Nucleofector Takımı </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Güney Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD3 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-insan CD28 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Peki Doku Kültürü Tedavi Plakalı </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Peki Dışı Doku Kültürü Tabak Tedavi </td><td> BD Falcon </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Komple T hücre ortam bileşimi 1x Gelişmiş RPMI 1.640 % 5 ısıyla inaktive Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

primer insan t hücrelerinin piggybac transposon sistem modifikasyon

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac transpozon sistemi başlangıçta lahana lüper güve 1,2 türetilen, doğal olarak aktiftir. Bu non-viral bir sistem en sık bir piggyBac transposase enzim ve gen transfer aktivitesi için gerekli olan ters çevrilmiş tekrar elemanları arasında ilgi gen (ler) i barındıran bir transpozon plazmid ifade ile plazmitler kullanılarak, plazmid bazlı olup. PiggyBac aracılık gen transferi yoluyla transposase ilgi hedef hücre (ler) in genom içine entegre transpozon bölüm vasıtasıyla bir &quot;kesme ve yapıştırma&quot; mekanizması. piggyBac 3-5 memeli böcek 1,2, geniş bir çeşitlilik içinde verimli gen dağıtım aktivite göstermiş, ve etmiştir 7,8 primer insan T-hücreleri de dahil olmak üzere insan cells6. Son zamanlarda, bir hiperaktif piggyBac transposase gen aktarım verimliliği 9,10 geliştirmeye oluşturuldu. İnsan T lenfositleri klinik Intere taşımaktadırKanser 11 evlatlık immünoterapi için st. Unutmayın ki, Sleeping beauty transpozon sistemi kullanılarak insan T hücrelerinin transpozon değişiklik içeren ilk klinik deneme 12 onaylandı. Biz daha önce insan T hücrelerinin genetik modifikasyonu için bir non-viral metodoloji olarak piggyBac yararlılığını değerlendirdik. Bir raportör gen ve bir imünojenik olmayan indüklenebilir intihar geni 7 ile insan T hücrelerinin genetik modifikasyonu olarak etkin olduğu piggyBac bulundu. Genomik entegrasyon siteleri Analizi 13 içine veya bilinen proto-onkogenler yakın entegrasyon için tercih eksikliği saptandı. Bu tümör antijen HER2 karşı yöneltilmiş bir kimerik antijen reseptörü taşımak için gen değiştirme sitotoksik T lenfositleri üzerinde piggyBac kullanılır ve gen ile modifiye edilmiş T hücreleri ortotopik bir fare modelinde in vitro ve in vivo HER2-pozitif tümör hücre öldürme aracılı hedef olduğunu buldu 14. Ayrıca piggyBac kullanılmıştırrapamisinin 15 kullanılmaktadır kanser tedavilerinde yararlı olacaktır rapamisin karşı dirençli insan T-hücreleri, elde edilmektedir. Burada, genetik olarak primer insan T-hücreleri değiştirmek için piggyBac kullanılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür, gen modifikasyonu, ve T hücrelerinin aktivasyonunu takiben insan kanı alınan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izolasyonu içerir. Bu rapor amacı için, T-hücreleri akış sitometrisi ile gen ekspresyonu analizi ve ölçümü için bir raportör gen (eGFP) ile modifiye edildi. PiggyBac ilgi genlerinin çeşitli insan T-hücreleri değiştirmek için de kullanılabilir. , Tümör antijenleri 14 ile T hücreleri yönlendirmek için piggyBac kullanılmış olmasına rağmen, aynı zamanda, gerekirse 7 geninin değiştirilmiş hücreleri ortadan kaldırmak için bir indüklenebilir emniyet şalteri eklemek için piggyBac kullanılmıştır. PiggyBac arasında büyük kargo kapasitesi de gen transferi sağladıBüyük bir rapamisin dirençli mTOR molekülü (15 kb) 15. Bu nedenle, bu amaç için çok çeşitli primer insan T-hücrelerinin kararlı gen değiştirme için bir non-viral bir yöntem sunulmaktadır.

Genetik olarak bir raportör gen (eGFP) ile insan T lenfositleri değiştirilmesinde adımları gösteren bir şematik Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bu plazmid yazarların istek üzerine mevcuttur. Bir muhabir gen (eGFP) ile genetik olarak değiştirilmiş insan T lenfositlerinde adımları gösteren bir schemtic Şekil 2&#39;de showin olduğunu. Onlara, bölmek genişletin ve kültürü yaymak için almak için T hücrelerini aktive etmek gereklidir. Modifiye insan T hücreleri daha sonra kül...

Bu genetik olarak non-viral kullanılarak bir transgen ile primer insan T-hücreleri değiştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transpozon sistemi. T hücreleri ile değiştirilmiş<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transpozon sistemi sergi kararlı transgen ifadesi.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

piggyBac transpozon sistemi, başlangıçta lahanakurtu güvesinden türetilmiş olan, doğal olarak aktif bir sistemdir1,2. Bu non-viral sistem plazmit tabanlıdır, çoğu...

Bu prosedürün genel amacı, viral olmayan bir transpozon sistemi ile primer insan T hücrelerini stabil bir şekilde genetik olarak modifiye etmektir. Öncelikle insan kanı toplanır ve ardından periferik kan mononükleer hücreleri izole edilir; daha sonra pbmc'ler, piggyback transpozon sistemi ve EGFP gibi ilgilenilen bir transgen ile nuklefe edilir. Sonrasında, T hücreleri kültürde proliferasyon için stimüle edilir.Ardından, T hücrelerini transgen ekspresyonu için analiz edin. Nihayetinde, piggyback transpozon sistemi ile modifiye edilen T hücrelerinde stabil transgen ekspresyonunu göstermek için akış sitometrisi analizi kullanılır. İnsan T hücrelerinin plazmid transfeksiyonunun aksine, transpozonlar transgenleri uzun süreli ekspresyon için stabil bir şekilde entegre etme avantajına sahiptir.Buradaki püf noktası, izolasyon sırasında ve nükleofeksiyon sonrasında P BMC'lerin işlenmesinde çok spesifik bir protokole uymaktır; farklı genleri eksprese eden kültürlenmiş insan stabil hücre hatları oluşturmak için ilk olarak bu yöntemi uyguladık. Bu yaklaşım, T-hücrelerinin daha iyi çalışmasını sağlamak için nasıl modifiye edilebileceği gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Prosedürü, laboratuvarımdan mezun bir öğrenci olan Sunon ve Saha, venipunkiyon kullanarak uygulamalı olarak gösterecektir.20 mililitre taze insan kanını sodyum heparinli vakuteyner tüplerine toplayın. Kanı, gelişmiş RPMI 1640 medyumu ile bire bir oranda karıştırın. Ardından, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 20 mililitre lympho prep medyumu ekleyin.Seyreltilmiş kandan 25 ila 30 mililitreyi, lympho prep üzerine yavaşça katmanlar halinde ekleyin ve frenleme olmadan 400 ×g'de 40 dakika boyunca santrifüjleyin. Hem belirgin hem de bulanık katmanları oda sıcaklığındaki 10 mililitre PBS içine aktarın. Toplam hacmi PPBS ile 50 mililitreye tamamlayın.Ardından hücreleri 450 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek hasat edin, süpernatanı tamamen aspire edin, ardından santrifüj sonrası hücreleri bir kez 20 mL advanced RPMI ile yıkayın. Hücre peletini, mililitre başına beş ng rekombinant insan IL 15 ile desteklenmiş 10 mL complete T-hücre medyumunda süspanse edin. Hücreleri sayın ve ardından 24 kuyucuklu doku kültürü kaplı plakaya, kuyucuk başına 2 × 10⁶ hücre olacak şekilde ekin.Ardından, çevredeki tüm kuyucuklara steril su ekleyin. P BMC'leri 37 °C ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Anti CD 28 ve anti CD 3 antikorlarını steril su ile 1 µg/mL konsantrasyona seyreltin.Kaplanmamış 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının işaretlenmiş beş kuyucuğuna, her bir antikor çözeltisinden 500 µL ekleyin. Ardından, geri kalan kuyucuklara steril su ekleyin. Plağı sarın ve 4 °C'de bekletin.T-hücresi besiyerini 37 °C'de ön ısıtmaya tabi tutun ve mililitre başına beş nanogram rekombinant insan IL 15 ile takviye edin. Ayrıca taze komple nükleo efektör çözeltisi hazırlayın. Şimdi, 1,5 ml'lik bir santrifüj tüpüne beşer mikrogram transposon ve transpose A alıkote edin.Optimal gen iletimi için transpoze A ve transpozon DNA miktarını optimize etmek gerekebilir. Hücresel toksisiteyi minimize etmek için, 24 kuyucuklu doku kültürü plağındaki PBM CS'yi 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Hücreleri saydıktan sonra, akış sitometrisi sırasında kontrol olarak kullanmak üzere 2 × 10⁶ P BMC'yi ayırın.Ardından, 15 mililitrelik bir tüpe yedi ile 10 milyon arasında hücre ekleyin ve 400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini parmağınızla hafifçe tıklatarak gevşetin. Gevşemiş hücre peletine 100 µL T-hücresi komple nucle affection solüsyonu ekleyin.Şimdi çözelti hücre karışımını plazmidlere ekleyin. Ardından, çözelti hücre plazmid karışımını nükleofeksiyon küvetinin altına ekleyin. Herhangi bir hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Hücreleri U-014 programını kullanarak nükleofekte edin.Uyarılmamış insan T hücreleri için, hücreleri 1,5 mililitre önceden ısıtılmış medya ve R-H-I-I-L 15 içeren bir kuyucuğa aktarın; etkilenmiş uyarılmamış T hücrelerini bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Hücreleri topladıktan sonra hücre sayılarını belirleyin; GFP pozitif hücrelerin frekansının akış sitometrisi ile belirlenmesi için kontrol olarak 0,5 × 10⁶ transfekte edilmemiş PBMC ayırın. Ardından, doku kültürü kaplanmamış plaka üzerindeki CD 3 28 antikor solüsyonunu aspire edin ve her kuyucuğu T hücresi medyası ile durulayıp yeniden süspande edin.Nükleus etkilenmiş hücreler 0,5 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonundaydı. 5 ng/mL RH IL 15 ile desteklenmiş tam CTL medyumu içerisinde, doku kültürü uygun olmayan plakanın dört kuyucuğuna nükleus etkilenmiş hücrelerden 2,0 mL ekleyin.0,5 x 10⁶ nükleer olmayan etkilenmiş hücre ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında üç gün boyunca inkübe edin.Beşinci günde, stimüle edilmiş T hücrelerini kaplanmamış doku kültürü plağından hasat edin. Ardından, 5 ng/mL IL 15 içeren T hücresi besiyerinde, 0,7 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyonda 24 kuyucuklu kaplanmış bir doku kültürü plağına aktarın. Hücreleri hasat ettikten sonra, % GFP ekspresyonu için CD8, CD3 veya CD4 ile immün boyama yapın; T hücrelerinin ekspansiyonu gerekiyorsa hücre preparasyonlarını akış sitometrisi ile analiz edin.Ardından sekizinci günde, transfeksiyondan sonra, insan T hücrelerinin piggyback aracılı gen modifikasyonu için IL 15 içeren T hücresi besiyerinde, kuyu başına 0,7 × 10⁶ hücre yoğunluğunda hücreleri ekimleyin. Primer insan hücreleri iki plazmid ile transfekte edilir. Transpozaz plazmidi, bir CMV promotörü altında piggyback proteinin konstitütif ekspresyonunu sağlar.Transpoz plazmiti, GFP raporlayıcısını ve gen transferi için gerekli olan piggyback ters tekrarlarını içerir. Piggyback transpozon sistemi ile modifiye edilen T hücrelerinde stabil GFP transgen ekspresyonu, FACS analizi ile incelenebilir. Burada hücreler, PC konjugeli anti-CD8 ile boyanmış ve birinci günde EGFP ve APC floresansı açısından analiz edilmiştir.EGFP ekspresyonu, CD8 pozitif hücrelerin %76,4'ünde tespit edilmiştir. Birinci gün ile yedinci gün arasındaki EGFP ekspresyonundaki azalma, muhtemelen tüm transfekte hücrelerin transpozon DNA'sının stabil entegrasyonunu gerçekleştirmemesinden kaynaklanmaktadır. Artık PBMC'lerin nasıl izole edileceği ve genlerin nasıl stabil bir şekilde aktarılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bunları piggyback transpozon sistemi ile modifiye edin. Flebotomi gerçekleştirirken steril teknik kullanmayı unutmayın. Hücre canlılığını korumak için hızlı çalışın.Bu prosedürün ardından, T hücrelerinin antijen spesifisitesini belirlemek amacıyla T hücresi sitotoksisite testi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Gelecekteki deneyler, kanser ve fareler için T hücresi tabanlı immünoterapide transpozonların kullanımını araştıracaktır.

piggybac-transposon-system-modification-of-primary-human-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Bu video, soya özgü transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonu ile PiggyBac transpozon sistemi ile insan iPSC'lerinin transfeksiyonu yoluyla motor nöronlar üretme prosedürünü göstermektedir.

İnsan iPSC'lerinde PiggyBac Transpozon Aracılı Gen Düzenleme: PiggyBac Transpozon Sistemi Kullanılarak İnsan iPSC'lerine İlgilenilen Geni Entegre Etme Prosedürü

Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu...

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

Bu çalışmada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretiyoruz.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Hücre etkinliğinin infüzyon çalışmaları için yeterli sayıda ilgi genlerinin mükemmel bir şekilde ifade edilen hücreleri veren rhesus makak periferik kan mononükleer hücrelerinin transdüksiyonu ve genişlemesi için 9 günlük bir protokol özetliyoruz.

Merkezi Bellek Fenotip Bakımı ile Dokuz Günde Primer T Hücrelerinin Transdüksiyonu ve Genişlemesi

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.

Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.

Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Homoloji aracılı uç birleştirme (HMEJ) DNA onarım yolu yoluyla birincil insan T hücrelerinde büyük, multisistronik yapıların yüksek verimli hedefli knock-in'ini elde etmek için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu cGMP'ye uyarlanabilir protokolle tasarlanan T hücreleri, mükemmel hücre genişlemesi, sitotoksisite ve sitokin üretimini korur.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Öğrenin, primer insan T hücrelerini piggyBac transposon sistemiyle genetik olarak nasıl modifiye edeceğinizi. Bu viral olmayan yöntem, uzun süreli transgen ekspresyonu sağlayarak immünoterapi araştırmalarında güçlü bir platform sunar.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

Daha fazla video keşfet