Name: CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Öğrenin, CRISPR/Cas sistemlerinde Cas endonükleaz aktivitesini incelemek için farklı uzunluklarda RNA substratları üretme yöntemlerini. PCR amplifikasyonu, oligonükleotit sentezi ve otoradyografi teknikleriyle CRISPR RNA olgunlaşmasını araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, rekombinant T7 RNA polimeraz ve Şekil 1 türlerinin hazırlanması için Norman Ebelt hazırlanması için Schermuly Jeanette teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) ve Max Planck Topluluğu fonları tarafından finanse edildi.

1. PCR ile uzun ön crRNA substratların Nesil <ol><li> Bir CRISPR küme boşluk bölgeleri hedefleyen Tasarım PCR primerleri. T7 RNA polimeraz ekleme klonlanması için ileri primer ve kısıtlama siteleri (T7RNAP) promoter sekansı (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) iki astarın (pUC19 için örneğin, BamHI ve Hind III, Şek. 2A) bir vektör içine PCR ürünü . Not: T7RNAP transkripsiyonun başlatılması için uygun bir guanidin kalıntı gerektirir. </li><li> PCR ile genomik DNA ilgi öncesi crRNA dizisi Amplify. </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın ve jel istenen bant ayıklayın. Yapışkan uçları (örneğin, BamHI ve HindIII, Şek. 2A) oluşturmak için sınırlama enzimleri ile sindirmek PCR ürünü. Yan ürünler bölünme ortadan kaldırmak için, bir PCR arıtma kiti ile PCR ürünü, üzerine koyulmuştur. </li><li> Bir T4 DNA ligaz içerir ligasyon reaksiyonu, T4 DNA ligaz tamponu ve kurmayarılan PCR ürünü ve karşılık gelen yapışkan uçları dephosphorylated doğrusal pUC vektörünün bir molar oranı 3:1. 16 ° C&#39;da gece boyunca karışım inkübe edin. Standart protokoller tarafından yetkili Escherichia coli DH5α hücrelerine ligasyon karışımı Dönüşümü ve başarılı ligasyonu tanımlamak için mavi beyaz tarama kullanın. </li><li> Bir plazmid hazırlık seti kullanarak beyaz kolonilerden plazmid izole edin. Plazmid sekanslamasıyla pozitif klonları tanımlamak. Alternatif olarak, koloni PCR ile tarama için kullanılabilir olabilir. </li></ol> 2. DNA oligonükleotidler tavlama yoluyla orta öncesi crRNA substratların Nesil <ol><li> İleri Tasarım ve istenilen CRISPR tekrarlama / boşluk dizisi ile oligonükleotidler tersine. Oligonükleotidler bir T7 promotörü RNAP hem de uç kısıtlama siteleri (pUC19 için örneğin, BamHI ve Hind III) &#39;ün sekansı içerir. (Bkz. Şek. 2B Tavlama sonrası bu yapışkan uçları formu sağlamak için oligonükleotidler Terminate </sTrong&gt;). </li><li> T4 polinükleotid kinaz 5 ul (PNK), T4 PNK 10x tampon, 2 ul ATP (10 mM) ve 2 ul ihtiva eden bir ayrı 20uL reaksiyon bölgesindeki her bir oligonükleotid 5&#39;-fosforile 1 nmol. 37 de 1 saat için her bir örnek inkübe ° C. </li><li> İki fosforile oligonükleotidler melezleşme. Fosforlu ileri oligo karışımı (2.2)., Fosforlu ters oligo karışımı (2.2)., Bir 10 ul reaksiyon 10x T4 DNA ligaz tamponu 1 ul 1 ul 1μl birleştirin. 95 az 5 dakika süreyle örneklerin inkübe ° bir ısıtma bloğu veya kaynar suda C, ısı kaynağını kapatın ve oda sıcaklığında (~ 2-3 saat) aşağı karışımı soğumaya bırakın. Not: Bu kritik adımda, yavaş soğutma işlemi her biri tek bir oligonükleotid içindeki yapıların oluşumu ile karşılaştırıldığında, iki oligonükleotidlerin tavlanması yanadır. </li><li> Sindirilir ve dephosphorylated pUC vektör 1μl hibridizasyon karışımı 4 ul, (Arter 0.1 mikrogram /T4 DNA ligazı, 10x T4 DNA ligaz tampon ve bir 20 mikrolitre ligasyon karışımı içinde, 10 mM ATP) ile ul. 16 ° C&#39;da gece boyunca numune inkübe edin. </li><li> Standart protokoller tarafından yetkili Escherichia coli DH5α hücrelerine bağlanan plazmid Dönüşümü ve mavi beyaz tarama kullanır. Plazmid izole ve sindirim (istenilen büyüklükte uçlar için ekrana) ve sonraki plazmid sekanslamasıyla pozitif klonları tanımlamak. </li></ol> 3. Özel RNA oligonükleotid sentezi yoluyla kısa Cas RNA substratların Nesil Tasarım kısa Cas RNA yüzeylerde (örn. tek tekrar dizileri, Şek. 2C) ve özel RNA oligonükleotid sentezi imkanları kullanmaktadır. Not: RNA oligonükleotid belirtilen bir pozisyonu (Şekil 2C) bir deoksiribonükleotid dahil edilmesi, RNA bölünme yerinde kesin olarak belirlemek için kullanılabilir. 4. In vitro T7 RNA polimeraz transkripsiyon <ol><li> Senin tasarlanmış yapı (1.9. Veya 2.7 &#39;den.) Bir maxiprep plazmid saflaştırma kiti kullanılarak plazmid izole edin. </li><li> Klonlanmış parçası (örneğin Hind III) akış aşağı parçalayarak kısıtlama enzimi ile linearize plazmid. Tam sindirim olun. Not: RNA transkriptinin farklı tanımlanmış bir 3 &#39;terminaline istenirse, tasarlanmış bir yapı HindIII sekans yukarı akış yönünde &quot;run-off&quot; transkripsiyon için ilave bir belirli sınırlandırma bölgesi içermelidir. </li><li> Kloroform (1:1) ekstraksiyon ve etanol yağış: lineerleştirilebilir fenol plazmid arındırın. DEPC işlenmiş steril suda pelet resuspending göre nükleik asitler kurtarma. </li><li> In vitro T7 RNAP içinde bir 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM spermidin, her bir nükleosit trifosfat 4 mM (ATP, CTP, GTP, UTP içeren transkripsiyon karışım kapalı çalışır ayarlama ), 40-100 ug / ml arasında sindirilmişplazmid ve DEPC işlenmiş su içinde 0.1 mg / ml T7 RNAP. 37 C&#39;de 3 saat için inkübe ° C. </li><li> Bir 8 M üre denatüre% 12 poliakrilamid jel (Şekil 3A) üzerinde elde edilen RNA transkriptleri analiz edin. RNA transkriptleri Mono Q anyon değişim kromatografisi yolu ile saflaştırıldı ve 13 DEPC işlenmiş steril suda RNA fraksiyonu ve pelet yeniden süspanse edilmesi ve etanol çökeltme ile geri kazanılabilir. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de saklayın RNA </li></ol> 5. Cas6 endonükleaz tahlil <ol><li> Bir ayarlama Vitro T7 RNAP 20 ul 2 mM ATP azaltılmış miktarda içerir ve ile tamamlanmaktadır (4.4) transkripsiyon karışımı kaçıp 2.5 ul α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Bir denatüre edici 8 M üre,% 12 poliakrilamit jel arasından jel çıkarma yolu ile reaksiyon ürünleri, temizler. Otoradyografi bantları gözünüzde canlandırın. </li><li> İstediğiniz rekombinant Cas proteinler üretin ve arındırmak. Bu örnekte, CClostridium thermocellum dan AS6 ısı çökeltme ve Ni-NTA kromatografi yolu ile saflaştınldı. </li><li> Clostridium thermocellum Cas6 için bir endonükleaz tahlil reaksiyon (örneğin ayarlama, reaksiyon karışımı, 20 mM Hepes (KOH PH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12,000 cpm RNA alt tabaka ve 1 uM enzim içeren ve inkübe edildi 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile). </li><li> 8 M üre, bir% 12 poliakrilamid jel üzerinde reaksiyon karışımı (% 95 formamit ihtiva eden 10 ul + RNA, yükleme tamponu) 5 ul yerleştirin. Otoradyografi elektroforez sonrası parçalanma ürünleri gözünüzde canlandırın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Cas endonükleaz etkinliği analizi için substrat RNA&#39;nın bir örneği Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir. In vitro transkripsiyon reaksiyonunda bir analitik 100 ul 5 ul lik bir örnek yüklendi. RNA üretim verimliliğini Farklı yapıları arasındaki farklılık gösterebileceğini unutmayın. Bazı faktörler tşapka transkripsiyon başlatma için gereken +1 G, transkripsiyon sırasında RNA yapı formasyonu (ii) olasılığı ve üretim için sınırlama alanı (iii) aşağıdaki tercih olup elde edilen RNA miktarı, (i) ilk sıra etki gözlenmiştir run-off bölünme pozisyonunun. RNA endonükleaz aktivite incelemesi hem yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant Cas proteinler (Şekil 3B) ve uygun negatif kontroller gerektirir. İdeal olarak, bu negatif kontrol örneği incelenmiştir Cas endonükleaz reaksiyon mümkün olduğunca az farklıdır. Bu ifade Cas (ve aynı arıtma prosedürü izleyerek) olmadan reaksiyon tamponu ve hücre lizatı ile RNA inkübasyon yoluyla elde edilebilir. İdeal bir negatif kontrol önerilen bölünme sitesinin bir deoksiribonükleotid bir eklenmesidir. Şekil 3C, bir 5 &#39;terminal tekrarı etiketli dizisinin bölünme Clostridium thermocellum Cas6 için gösterilir. Altında<html> aynı koşullar, bu tekrar bir deoksiribonükleotid, -9 pozisyonunda tanıtıldıktan sonra artık bir substrat değildir. Bu yöntem aynı zamanda bölünme sitesinin ilgili bilgi sağlar. Son olarak, bir uzun içten etiketli ön crRNA Cas6 ile parçalanır ve iki yarılma parçaları görülmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> CRISPR / Cas aktivitesi Şekil 1. Şematik gösterimi. Genel CRISPR küme (adaptasyon), bir Cas6 endonükleaz ile küçük crRNAs içine CRISPR dizi transkripsiyonu ve işleme, Cascade kompleksi içine crRNAs alımını ve müdahalesi bir viral DNA dizisi (protospacer) yerleştirilmesini takip crRNA ve protospacer arasındaki tamamlayıcılık esas viral saldırı tekrarladı. Protospacer bitişik motifler (PAM) işareti viral protospacer dizileri. ŞEKIL 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Cas proteinleri RNA substratların Nesil. Düzeni (A) uzun ön crRNA substratlar, (B), orta ön crRNA alt tabakalar ve ön-crRNA üretimi için (C) kısa Cas RNA alt tabakalar üretmek için akışı gösterilmektedir. Örnek dizileri Clostridium thermocellum arasında CRISPR dizisi için sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Şekil 3. Cas6 endonükleaz denemesi. A.) Toluidin blue ile boyanan poliakrilamid özel tasarlanmış RNA oligonükleotid (250 pmol) jel ve in vitro RNA transkriptleri (tipik 100 ul reaksiyon 5 ul) iki. Isı sonra Clostridium thermocellum bir Cas6 hazırlık (80 pmol) B.) SDS-PAGE jel1 saat ve Ni-NTA kromatografisi için 50 ° C de yağış. 5 &#39;terminal etiketli tekrar sıraları ve in vitro transkriptleri ön crRNA için endonucleolytic Cas6 aktivitesi C) tespit eder. -9 Pozisyonunda bir dNTP tanıtımı kısa Cas RNA substratın (S, Şek. 2C) için Cas6 bölünme ortadan kaldırmaktadır. Bir 5 &#39;terminal 8 nt etiketi de uzun ön crRNA substratlar (L, Şek. 2A) dan crRNA olgunlaşması için oluşturulur. Bantları denatüre 8 M üre% 12 poliakrilamid jel üzerinde ayrılmış ve otoradyografi ile görselleştirilmiş edildi.

<ol><li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li>
<li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes%3A+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery%2C+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi%2C+and+hypothetical+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Direct%22%5BJournal%5D)">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7(2006).</li>
<li>Lillestøl, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li>
<li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li>
<li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li>
<li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li>
<li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li>
<li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li>
<li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li>
<li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li>
<li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li>
<li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR%2FCas+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li>
<li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li>
<li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li>
<li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li>
<li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sunulan yöntemler farklı boyut aralıkları Cas endonükleaz substratların oluşturmayı etkinleştirmek ve sıra tasarım özgürlüğü değişen. Sentetik RNA oligonükleotid substratların nesil için en düz ileri yaklaşım artık RNA oligomerler oluşturarak artan maliyetler ve teknik sınırlamalar nedeniyle kısa RNA tasarımları ile sınırlıdır. Başarılı RNA sentezi üzerinde 100 nükleotid uzunlukta değiştirilmemiş RNA oligomerleri için rapor edilmiş olsa da, özel RNA sentezi için pratik ve ekonomik azami altında 40 nükleotidler yatıyor. Ancak, herhangi bir sıra sentez edilebilir ve modifiye nükleotidler (örn. deoxyribonucleotides) ve hedeflenen giriş ayrıntılı olarak yarılma bölgeleri analiz etmek için kullanılabilir. Daha uzun ön cRNAs in vitro transkripsiyon kullanılarak oluşturulan olmalıdır. Bir T7 RNA polimeraz promotörü içeren oligonükleotidler ara tavlama uzunluğu önceden crRN üretimi için olanak sağlarGibi. Rutin olarak ve ekonomik olarak sentezlenmiş oligonükleotid DNA&#39;nın maksimum uzunluğu sadece 150 nükleotid üzerinde ve bu yöntem vasıtasıyla sentetik ön crRNAs azami temsil eder. Birbirleri ile yapışkan uçları oluştururlar birkaç tavlı DNA oligonükleotid çiftleri düzeneği bu maksimal uzatmak ancak yapının klonlama artan zorlukları zorunlu olabilir. Bu yöntemin başlıca avantajı, herhangi bir istenen sırada ile ön crRNA yapıları (ve bu nedenle Cas endonükleaz substrat) oluşturmak için yeteneğidir. Bu sentetik crRNA tasarımları test yapılmasını sağlar. Son olarak, daha büyük bir ön crRNAs bunların tüm genomik CRISPR elemanları ya da fraksiyonları PCR amplificates elde edilebilir. In vitro transkripsiyon plasmidi şablon olarak değişiklikler için önceden crRNA varyantlarının üretilmesi için site-yönlendirmeli mütajenez yoluyla sokulabilir. Bu yapı, bir bütün içinde küresel endonucleolytic bölünme kalıp analiz etmek için de kullanılabilirön crRNA. In vitro transkripsiyon içinde T7 RNA polimeraz aracılığıyla değiştirilmemiş RNA üretimi için öncü çalışma devri RNA&#39;lar 14 ve brom mozaik virüs RNA 15 dayanmaktadır. Uzlaşma T7 RNA polimeraz promotörü bir tanıma alanı (-5 ile -17) ve önemli bir guanozin +1 16 de transkripsiyon başlangıcı olan bir inisiyasyon alanı (+6 aracılığıyla -4) oluşmaktadır. +1 Pozisyonlar akış hemen hemen arzu edilen herhangi bir RNA sekansının transkripsiyon olanak sağlayan çeşitli olabilir. In vitro transkripsiyon akıntısı oluşturmak için şablon olarak sunulan yöntemler CRISPR genomik bölge ya da sentetik ön crRNA türevleri neticesinde komple bir ön-crRNAs in vitro sentezi için izin verir. Transkripsiyon reaksiyonu 5 &#39;monofosfat termini 14 elde etmek için GMP ile astarlanmalıdır sürece dökümleri 5&#39;-terminali trifosfat mevcut oluşturulur. Transkript etiketli isteniyorsa, bu tür termini gerekmektedirT4 polinükleotid kinaz ve γ-[32 P]-ATP. sahip Cas6 ve Cas6-benzeri enzim aktivitesi Yarılma 5&#39;-hidroksil ile bir 2 &#39;, 3&#39;-siklik fosfat termini ihtiva crRNA oluşturur. Bu RNA&#39;lar sonra Cascade kompleksi tarafından tanınması için analiz edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Antarktika Fosfataz </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> In vitro transkripsiyon Sınıf Ultrasaf Nükleotid trifosfatlar içinde </td><td> Bioscience Jena </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Sıvı kromatografisi, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA oligonükleotidler </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA oligonükleotidler </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Jel Ekstraksiyon Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR saflaştırma Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Plazmid Maxi Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA Ligaz </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 polinükleotid kinaz </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA Polimeraz </td><td> Kendi hazırlığı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoksinükleotid Çözüm Mix </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini Protean Tetra Elektroforez Sistemi </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Fırtına 840 Tarayıcı </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Depolama Phosphorscreen </td><td> Moleküler Dinamik </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion Yüksek Sadakat DNA Polimeraz </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> GC tampon kullanın </td></tr><tr><td> Toluidin Blue </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP </td><td> Hartmann Analitik </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

crispr / cas sistemleri endonükleazlar için substrat Üretimi

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Virüsler ve prokaryotik ana etkileşim bakteri ve arke yaşamın evrimini şekillendirdi. Prokaryotlar restriksiyon modifikasyon, başarısız enfeksiyon ve CRISPR / Cas sistemlerini içerir viral saldırılardan kaçınmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. C i s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) dizileri ve sociated (Cas) genler olarak C RISPR bir dizi (Şekil 1) 1-3 nterspaced egularly r lüsterli birçok bakteri ve en Archaea bulunan bu adaptif bağışıklık sistemi oluşur. Cas proteinler ve tekrarları farklı setleri CRISPR / Cas sistemleri 4 en az üç büyük farklı türlerini tanımlar. Evrensel proteinler Cas1 ve Cas2 viral DNA almasında rol aldığı öne eminuzayan CRISPR küme 5, 5 &#39;terminalinde iki tekrarlar arasında yeni bir ayırıcı eleman oluşturur. Tüm küme tüm boşluk ve tekrar dizileri içeren bir prekürsör-crRNA dönüştürüldü ve daha sonra küçük crRNAs 6-8 içine farklı Cas6 ailesinin bir enzim tarafından işlenir. Bu crRNAs bir 5 &#39;terminal (8 nükleotidler) ve bir 3&#39; Tekrar dizisi 9 türetilmiş uç etiket ile takviye boşluk sekans içerir. Yeni crRNA viral DNA için Cas protein kompleksi (Cascade) yönettiği ve taban tamamlayıcılık 10 üzerinden bu tür olarak tanımlamak olacak gibi virüsün yinelenen A enfeksiyonu artık bloke edilebilir. Nihayet, CRISPR / Cas tip 1 sistemleri için, nükleaz CAS3 tespit işgalci DNA 11,12 yok edecektir. Bu süreçler prokaryot bir adaptif bağışıklık sistemi gibi CRISPR / Cas tanımlamak ve tutulan Cas proteinlerin çalışması için büyüleyici bir araştırma alanı açıldı.Birçok Cas proteinlerin fonksiyonu hala zor olduğunu ve CRISPR / Cas sistemlerinin belirgin çeşitlilik için nedenleri aydınlatılmaya kalır. Çoğu Cas proteinlerin Potansiyel faaliyetleri detaylı hesap analizleri ile tahmin edilmiştir. Cas proteinlerin önemli bir kısmını Görüntülenen veya 4 endonükleazları olarak işlev önerilmiştir. Burada, Cas endoribonucleases çalışma için crRNAs ve öncü-cRNAs oluşturmak için yöntemler sunuyoruz. Farklı endonükleaz deneyleri doğrudan RNA oligonükleotidler veya run-off transkripsiyon vitro T7 RNA polimeraz aracılığıyla oluşturulan uzun crRNA ve pre-crRNA dizileri olarak sentezlenmiş olabilir ya kısa tekrar dizileri gerektirir. Bu metodoloji dahili etiketli endonükleaz yüzeylerde ve sentetik veya mutant crRNAs oluşturulması nesil için radyoaktif nükleotidlerin birleşme sağlar. Cas6 endonükleaz etkinliği 5&#39;-hidr crRNAs ile içine önceden crRNAs olgunlaşması için kullanılmaktadıroksil ve bir 2 &#39;, 3&#39;-siklik fosfat termini.

Bakteri ve Archaea yılında CRISPR / Cas sistemleri aracılık adaptif bağışıklık. Birçok Cas proteinlerin uzunluğu değişen crRNA öncüllerinin hareket endoribonucleases olarak hareket etmek önerilmektedir. Burada Cas endonuclease aktivitesinin biyokimyasal analiz için önceden crRNA yüzeyler oluşturmak için üç farklı yaklaşımlar sergiler.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

Virüslerin ve prokaryot konakçılarının etkileşimi, bakteriyel ve arkeal yaşamın evrimini şekillendirmiştir. Prokaryotlar, ... için çeşitli stratejiler geliştirmiştir.

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, bakterilerde ve Arkelerde bulunan crispr Cass bağışıklık sistemlerinde kritik roller oynayan Cas Endonükleazın çalışılması için RNA substratları üretmektir. Cas Endonükleaz için RNA substratları elde etmek amacıyla, tercih edilirse, in vitro RNA üretimi için uzun DNA kalıbı elde etmek üzere belirli bir CRISPR bölgesinin PCR amplifikasyonu uygulanabilir.Substrat RNA üretimi için daha kısa şablonlar oluşturmak amacıyla iki oligonükleotid birbirine bağlanabilir. Alternatif olarak, kısa ve özel olarak sentezlenmiş tekrar dizileri CAS Endonükleaz analizlerinde test edilebilir. Nihayetinde, RNA transkriptlerinin üretimi ve ardından CAS altı endonükleaz tarafından gerçekleştirilen kesim, otoradyografi ile görselleştirilebilir.Sunulan tekniklerin temel amacı, araştırmacıların farklı uzunluktaki RNA substratları ile CRISPR RNA işlemesini incelemelerini sağlamaktır. Bu nedenle, tek tekrarlı elementler gibi küçük RNA'lar veya birkaç ara diziyi kapsayan crispr RNA transkriptleri gibi daha büyük RNA'lar üretmek için farklı yöntemler kullanılır. Bu yöntemler özellikle CRISPR RNA olgunlaşması hakkında bilgi sağlasa da, benzer şablon hazırlama stratejileri diğer RNA işleme sistemleri için de benimsenebilir. Prosedürü, bakteri ve arkhea CRISPR bağışıklık sistemleri üzerine çalışan bir laboratuvardan olan bir lisansüstü öğrencisi ve bir doktora sonrası araştırmacı uygulamalı olarak gösterecektir.Adaptasyon adı verilen bir süreçte, proto spacer olarak adlandırılan bir viral DNA dizisi, büyüyen bir CRISPR kümesindeki iki tekrar elementi arasına yerleştirilebilir. Ardından, tüm CRISPR kümesi transkribe edilir ve daha sonra CAS endonükleaz (örneğin, CAS altı) tarafından küçük CRISPR RNA'lara işlenir. Küçük CRISPR RNA'lar daha sonra CAS protein kompleksi kaskadına dahil olur ve CRISPR RNA ile proto spacer arasındaki baz tamamlayıcılığını, uzun pre CRISPR RNA substratları oluşturmak için viral DNA degradasyonuna yönelik bir sinyal olarak kullanarak, tekrarlanan viral ataklara karşı konak savunmasını aracılar.T7 RNA polimeraz promoter dizisini ileri primerle ekleyerek bir CRISPR kümesinin ara bölge (spacer) bölgelerini hedefleyen PCR primerlerini tasarlayarak başlayın. Ardından, PCR ürününü bir vektöre klonlamak için her iki primere restriksiyon bölgeleri ekleyin. Genomik DNA'dan ilgilenilen pre-CRISPR RNA dizisinin PCR ile çoğaltılmasından sonra, T7 RNA polimerazın transkripsiyonu uygun şekilde başlatabilmesi için bir guanin kalıntısına ihtiyaç duyduğunu unutmayın.PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezi ile ayırın ve istenen bandı jelden ekstrakte edin, ardından yapışkan uçlar oluşturmak için PCR ürününü restriksiyon enzimleri ile sindirin. Daha sonra, herhangi bir kesim yan ürününü ortadan kaldırmak için PCR ürününüzü bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırdıktan sonra; T4 DNA Ligaz, T4 DNA Ligaz tamponu ve karşılık gelen yapışkan uçlara sahip pUC vektörü ile kesilmiş PCR ürününe 3:1 molar oranında ekleme yapın. Şimdi ligasyon reaksiyonunu 16 °C'de gece boyunca inkübe edin ve ardından karışımı, başarılı ligasyonu belirlemek için mavi-beyaz tarama yöntemini kullanan standart protokoller aracılığıyla kompetan E. coli DH5α hücrelerine transforme edin.Son olarak, bir plazmit hazırlama kiti kullanarak beyaz kolonilerden plazmitleri izole edin ve orta büyüklükte ön CRISPR RNA substratları oluşturmak için plazmit sekanslaması ile pozitif klonları belirleyin. İşleme, burada gösterilen dizilere benzer, istenen CRISPR tekrarlı ara boşluk dizisine sahip ileri ve geri oligonükleotidler tasarlayarak başlayın. Oligonükleotidlerin, yapışkan uçların oluşmasını sağlamak amacıyla, oligonükleotidlerin sonlanmasının ardından bir T7 RNA polimeraz promotör dizisinin yanı sıra uç kısıtlam kısıtlam bölgeleri içerdiğine dikkat edin.Örnekleri, her bir oligonükleotidin 5' ucunu fosforillemek için T4 polinükleotid kinaz ve T4 polinükleotid kinaz tamponu ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, fosforillenmiş ileri ve geri oligonükleotidleri T4 DNA ligaz tamponu ile bir ısıtma bloğu üzerinde 95 °C'de beş dakika inkübe edin. Örnekler hibritlendikten sonra ısı kaynağını kapatın ve karışımın oda sıcaklığına ulaşana kadar yaklaşık iki ila üç saat soğumasını bekleyin.Şimdi, çağrılan oligonükleotidleri, bir hibridizasyon karışımıyla sindirilmiş ve defosforile edilmiş P vektör T, dört DNA Ligaz tamponu ve T4 DNA Ligaz ile 16 °C'de gece boyunca ligasyon işlemine tabi tutun. Ardından, ligasyonun başarılı olduğunu belirlemek için mavi-beyaz tarama kullanarak, ligasyon yapılmış plazmidleri standart protokollerle kompetan E. coli DH5α hücrelerine transforme edin. Son olarak, plazmidleri izole edin ve sindirim ile ardından gelen plazmid dizileme yoluyla pozitif klonları tanımlayın.Kısa tek tekrarlı cas RNA substrat dizileri, burada gösterilenlere benzer şekilde tasarlanabilir. Bir deoksiribonükleotid dahil edildiğinden emin olun. RNA kesim bölgesinin belirlenmesi gerekiyorsa, RNA oligonükleotidinin üretimi için özel bir sentez tesisi kullanılabilir.Seçilen özel substrata sahip plazmidler izole edildikten sonra, bir maxi prep plazmid saflaştırma kiti kullanarak plazmidleri, klonlanan fragmanların aşağısından kesen restriksiyon enzimi ile lineerize edin. Ardından, sindirimin tamamen gerçekleştiğinden emin olduktan sonra, lineerize plazmidi fenol kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesi ile saflaştırın. Pelleti DEPC işleminden geçirilmiş steril suda süspanse ederek nükleik asitleri geri kazanın.Şimdi sindirim plazmidlerini; ATP, CTP, GTP ve UTP içeren, taze hazırlanmış bir in vitro T7 RNA polimeraz runoff transkripsiyon karışımında 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Son olarak, elde edilen RNA transkriptlerini denatüre 8 M üre içeren %12'lik poliakrilamid jel üzerinde analiz edin. Transkriptleri Mono Q anyon değişim kromatografisi ile saflaştırmak ve ardından RNA fraksiyonlarının etanol çöktürmesi ve peletlerin DEPC ile işlem görmüş steril suda yeniden süspanse edilmesi yoluyla geri kazanmak da mümkündür; böylece tasarım substratları endonükleaz assayleri ile analiz edilebilir. İşleme, substrat bantlarının otoradyografi ile görüntülenmesi ve reaksiyon ürünlerinin denatüre 8 M üre içeren jel ekstraksiyonu ile saflaştırılmasıyla başlayın.%12 poliakrilamid jel kullanın, ardından Clostridium thermo cell'den elde edilen bu CAS altı proteininde gösterildiği gibi, ısı çöktürmesi ve nikel NTA kromatografisi yoluyla istenen rekombinant cas proteinlerini üretin ve saflaştırın. Daha sonra, endonükleaz assay reaksiyonunun gerçekleşmesini sağlamak için CAS proteinini taze hazırlanmış bir endonükleaz reaksiyon karışımıyla 37 °C'de 30 dakika boyunca birleştirin. Son olarak, reaksiyon karışımının beş birimini sekiz molar üre üzerine yükleyin.%12 poliakrilamid jel kullanın ve elektroforez sonrası kesim ürünlerini otoradyografi ile görüntüleyin. Burada, özel tasarlanmış bir RNA oligonükleotidi ile iki in vitro RNA transkriptinin Coomassie blue ile boyanmış poliakrilamid jeli gösterilmiştir. RNA üretim verimliliğinin kısa, uzun ve orta uzunluktaki konstrüktler arasında farklılık gösterdiğine dikkat edin.RNA endonükleaz aktivitesinin incelenmesi, yüksek derecede saflaştırılmış rekombinant cas proteinlerinin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller gerektirir. Bu şekilde, Clostridium thermo cell'den alınan bir CAS altı örnek hazırlığının SDS page jeli görülmektedir.Isı çöktürmesi ve nikel NTA kromatografisinin ardından, standart bir protein markörü ile birlikte yürütülen işlem gösterilmektedir. Uygun bir negatif kontrol örneği, CAS six ekspresyonu içermeyen bir hücre lizatı içermeli ancak aynı CAS six saflaştırma prosedürünü takip etmelidir; CAS six preparatının gerekli yüksek saflık düzeyine sahip olduğu belirlenmiştir. Burada, beş prim uç işaretli bir tekrarlayan dizi substratının co Clostridium thermo cell CAS six proteini tarafından kesilmesi otoradyografi ile görselleştirilebilir.Her bir hat; artı işaretleriyle belirtildiği üzere ca altı protein ile inkübasyon sonrası radyoaktif olarak işaretlenmiş substrat, RNA veya eksi işaretleriyle belirtildiği üzere negatif kontrol olarak bir tampon çözelti ile inkübe edilmiş örnekleri; artı veya eksi doksi ribonükleotid eklemesiyle birlikte uzun substratları veya kısa substratları içermektedir. Eksi dokuz pozisyonundakiler, endonükleaz reaksiyonunu kolaylaştırmak için kullanılmıştır. Bu prosedürün ardından, doksi ribonükleotid RNA molekülüne dahil edildiğinde kısa substratlarda kesilme gerçekleşmediğine dikkat edin.Cas nükleazları, olgun ve net RNA'lar üretmek için bir araç olarak da kullanılabilir. Bu RNA'lar, viral saldırıların engellenmesindeki rolleri hakkında bilgi edinmek amacıyla kaskad komplekslerine dahil edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, Cas nükleazlar için CRISPR substratlarının nasıl tasarlanacağı ve üretileceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.Bu farklı substratlar, crispr Es'lerin olgunlaşması ve kullanımıyla ilgili soruların yanıtlanması için kullanışlıdır.

substrate-generation-for-endonucleases-of-crisprcas-systems

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçları, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu el yazması, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü hiPSC raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Burada açıklanan endogenously etiketleme için bir protokol proteinler insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler CRISPR/Cas9 kullanarak floresan etiketleri ile ifade olmasıdır. Putatively düzenlenen hücreleri hücre aktif floresans sıralayarak zenginleştirilmiş ve klonal hücre satırları oluşturulur.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Halka açık cDNA/ORF kaynaklarını kullanarak Drosophila'daki UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli inşası için bir yöntem olan CRISPR tabanlı modüler montaj (CRISPRmass) için bir protokol sunuyoruz. CRISPRmass, çeşitli plazmit kütüphanelerini düzenlemek için uygulanabilir.

UAS-cDNA/ORF plazmit kütüphanesinin yüksek verimli yapısı için CRISPR tabanlı modüler montaj

CRISPR gibi teknolojilerin önündeki önemli bir engel, hayati genleri bozabilecek hedef dışı olaylardır. 'Dizileme ile Bölünme Etkilerinin İn Vitro Raporlaması için Döngüselleştirme' (CIRCLE-seq), istenmeyen bölünme bölgelerini belirlemek için tasarlanmış bir tekniktir. Bu yöntem, CRISPR-Cas9'un genom çapındaki aktivitesini yüksek hassasiyetle ve önyargısız olarak haritalandırır.

Hedef Dışı Gen Düzenlemenin Sorgulanması için CIRCLE-Seq

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Öğrenin, CRISPR/Cas sistemlerinde Cas endonükleaz aktivitesini incelemek için farklı uzunluklarda RNA substratları üretme yöntemlerini. PCR amplifikasyonu, oligonükleotit sentezi ve otoradyografi teknikleriyle CRISPR RNA olgunlaşmasını araştırın.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

Daha fazla video keşfet