CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, Cas Endonükleaz için RNA substratları elde etmek için bakterilerde ve ArcHa'da bulunan crispr Cass bağışıklık sistemlerinde çok önemli roller oynayan Cas Endonükleaz çalışması için RNA substratları üretmektir. Belirli bir CRISPR bölgesinin PCR amplifikasyonu, in vitro RNA üretimi için uzun DNA şablonu elde etmek için kullanılabilir. Eğer tercih edilirse.

Substrat RNA üretimi için daha kısa şablonlar oluşturmak üzere iki oligonükleotid diz çökebilir. Alternatif olarak, kısa, özel sentezlenmiş tekrar dizileri daha sonra CAS Endonükleaz testlerinde test edilebilir. Sonuç olarak, RNA transkriptlerinin üretimi ve ardından CAS altı endonükleaz ile bölünme, oto radyografi ile görselleştirilebilir.

Sunum tekniklerinin temel amacı, araştırmacıların farklı uzunluklarda RNA substratları ile CRISPR RNA işlemeyi incelemelerini sağlamaktır. Bu nedenle, küçük RNA'lar oluşturmak için farklı yöntemler kullanılır, örneğin tek tekrar elementleri veya crispr, RNA, birkaç aralayıcıyı kapsayan transkriptler gibi daha büyük RNA'lar. Bu yöntemler özellikle CRISPR RNA olgunlaşması hakkında bilgi sağlasa da, diğer RNA işleme sistemleri için benzer şablon hazırlama stratejileri benimsenebilir, Prosedürün sessiz olacağını gösteren bir yüksek lisans öğrencisi ve hem bakteri hem de ArcHa CRISPR bağışıklık sistemlerinde bir laboratuvardan doktora sonrası doktora yanıtı.

Proto aralayıcı adı verilen bir viral DNA dizisi, adaptasyon adı verilen bir süreçle büyüyen bir CRISPR kümesindeki iki tekrar elemanı arasına yerleştirilebilir. Daha sonra, tüm CRISPR kümesi kopyalanır ve daha sonra bir Cass Endonükleaz tarafından küçük CRISPR RNA'larına, örneğin CAS altıya işlenir. Küçük CRISPR RNA'ları daha sonra CAS protein kompleksi kaskadına dahil edilir ve uzun ön CRISPR RNA substratları oluşturmak için viral DNA bozunması için bir sinyal olarak CRISPR RNA ile proto aralayıcı arasındaki baz tamamlayıcılığını kullanarak, tekrarlanan bir viral saldırıya karşı konak savunmasına aracılık eder.

İleri primere T yedi RNA polimeraz promotör dizisini ekleyerek bir CRISPR kümesinin ara bölgelerini hedefleyen PCR primerleri tasarlayarak başlayın. Ardından, PCR ürününü bir vektöre klonlamak için her iki primere de kısıtlama bölgeleri ekleyin. T yedi RNA polimerazın, genomik DNA'dan ilgilenilen CRISPR öncesi RNA dizisini PCR ile amplifiye ettikten sonra transkripsiyonun uygun şekilde başlatılması için I kalıntısı gerektirdiğine dikkat edin.

PCR ürünlerini, Viagra aose jel elektroferezini ve jel ekstraktını yasaklanmış arzuyu ayırın, ardından yapışkan uçlar oluşturmak için PCR ürününü kısıtlama enzimleri ile sindirin. Daha sonra, PCR ürününüzü bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırdıktan sonra, herhangi bir bölünme yan ürününü ortadan kaldırmak için, T dört DNA Ligaz T dört DNA Ligaz tamponu ve bölünmüş PCR ürününün DFO'nun dört ilgili disk vektörüne üç ila bir molar oranını ekleyin. Şimdi ligasyon reaksiyonunu gece boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin ve ardından karışımı, başarılı ligasyonu tanımlamak için mavi beyaz tarama kullanarak standart protokollerle yetkin e coli, DH beş alfa hücresine dönüştürün.

Son olarak, bir plazmit hazırlama kiti kullanarak plazmitleri beyaz kolonilerden izole edin ve orta büyüklükte pre CRISPR RNA substratları oluşturmak için plazmit dizilimi ile pozitif klonları tanımlayın. Burada gösterilen dizilere benzer şekilde istenen CRISPR tekrar boşlukları dizisi ile ileri ve geri oligonükleotidler tasarlayarak başlayın. Oligonükleotidlerin, yapışkan uçların oluşmasını sağlamak için oligonükleotidleri sonlandırdıktan sonra terminal kısıtlama bölgelerinin yanı sıra bir T yedi RNA polimeraz promotörü dizisini içerdiğine dikkat edin.

Diz çöktükten sonra, numuneleri T dört polinükleotid kinaz ve T dört polinükleotid kinaz tamponu ile 37 santigrat derecede bir saat boyunca oligonükleotidlerin her birinin bir anomalisi olan beş ana fosforile inkübe edin. Daha sonra fosforile ileri ve geri oligonükleotidleri T dört DNA ligaz tamponu ile bir ısıtma bloğu üzerinde 95 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Numuneler melezlendikten sonra, ısı kaynağını kapatın ve karışımın oda sıcaklığına ulaşana kadar yaklaşık iki ila üç saat soğumasını bekleyin.

Şimdi, adı verilen oligonükleotidleri, sindirilmiş ve fosforillenmiş bir hibridizasyon karışımı, P vektör T, dört DNA Ligaz tamponu ve gece boyunca 16 santigrat derecede bir TP ile bağlayın. Daha sonra bağlanmış plazmitleri, başarılı ligasyonu tanımlamak için mavi beyaz tarama kullanarak standart protokollerle yetkin e coli, DH beş alfa hücrelerine dönüştürün. Son olarak, plazmitleri izole edin ve pozitif klonları sindirim ve ardından plazmit dizilimi ile tanımlayın.

Kısa tek tekrarlı cas RNA substrat dizileri, burada gösterilenlere benzer şekilde tasarlanabilir. Bir deoksi ribonükleotid eklediğinizden emin olun. RNA bölünme yeri belirlenecekse, RNA oligonükleotidinin üretimini gerçekleştirmek için özel bir sentez tesisi kullanılabilir.

Plazmitleri tercih edilen özelleştirilmiş substrat ile izole ettikten sonra, bir maxi prep plazmit saflaştırma kiti kullanarak, plazmitleri, klonlanmış parçaların aşağı akışında parçalanan kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırın. Daha sonra tam sindirimi sağladıktan sonra, doğrusallaştırılmış plazmiti fenol kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltme ile saflaştırın. Nükleik asitleri resüs ile geri kazanın, peleti DEPC ile muamele edilmiş steril suda süspanse edin.

Şimdi sindirim plazmitlerini, A-T-P-C-T-P-G-T-P ve UTP dahil olmak üzere taze hazırlanmış in vitro T yedi RNA polimeraz akış transkripsiyon karışımında 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Son olarak, elde edilen RNA transkriptlerini denatüre eden sekiz molar üre, %12 poli akrilamid jel üzerinde analiz edin. Transkriptlerin mono Q anyon değişim kromatografisi yoluyla saflaştırılması ve daha sonra transkriptlerin, RNA fraksiyonlarının etanol çökeltilmesi ve DEPC ile muamele edilmiş steril suda peletlerin yeniden taranması yoluyla geri kazanılması da mümkündür, böylece tasarım substratlarını endonükleaz tahlilleri ile analiz etmek için substrat bantlarını oto radyografi ile görselleştirmek ve reaksiyon ürünlerini denatüre eden sekiz molar üreden jel ekstraksiyonu ile saflaştırmak suretiyle başlayın.

% 12 poli akrilamid jel daha sonra, Clostridium termo hücresinden elde edilen bu CAS altı proteini için gösterildiği gibi, bir nikel NTA kromatografisi olan ısı çökeltme yoluyla istenen rekombinant cas proteinlerini üretir ve saflaştırır. Daha sonra CAS proteinini, endonükleaz tahlil reaksiyonunun gerçekleşmesine izin vermek için 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca taze hazırlanmış bir endonükleaz reaksiyon karışımı ile birleştirin. Son olarak, reaksiyon karışımının beşini sekiz molar üre üzerine yükleyin.

% 12 poli akrilamid jel ve oto radyografi ile elektroforez sonrası bölünme ürünlerini görselleştirin. Burada, özel olarak tasarlanmış bir RNA oligonükleotidinin hine mavisi lekeli poli akrilamid jeli ve iki in vitro RNA transkripti gösterilmektedir. RNA üretiminin verimliliğinin kısa, uzun ve ara uzunluk yapıları arasında değiştiğine dikkat edin.

RNA endonükleaz aktivitesinin araştırılması, pozitif negatif kontrollerin yanı sıra yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant cas proteinleri gerektirir. Bu şekilde. Clostridium termo hücreden bir CAS altı numune hazırlamanın bir SDS sayfası jeli.

Isı çökeltme ve nikelden sonra, standart bir protein markörü ile birlikte çalışan NTA kromatografisi gösterilir. Uygun bir negatif kontrol numunesi, CAS altı ekspresyonu olmayan bir hücre lizatı içermelidir, ancak aynı CAS altı saflaştırma prosedürünü takiben, CAS altı preparatının gerekli yüksek saflık seviyesine sahip olduğu belirlendi. Burada, co Clostridium termo hücre CAS altı proteini ile tekrar dizisi substratı olarak etiketlenmiş beş ana terminalin bölünmesi, oto radyografi ile görselleştirilebilir.

Her şerit, radyoaktif olarak etiketlenmiş substrat, artı işaretleri ile gösterildiği gibi ca altı protein ile inkübasyondan sonra RNA veya eksi işaretleri, uzun substratlar veya deoksi ribonükleotid ilavesi olsun veya olmasın kısa substratlar ile belirtildiği gibi negatif kontrol olarak bir tampon içerir. Eksi dokuz pozisyonunda, endonükleaz reaksiyonunu kolaylaştırmak için kullanıldı. Bu prosedürü takiben, deoksi ribonükleotid RNA molekülüne dahil edildiğinde kısa substratların bölünme eksikliğine dikkat edin.

CAS altı Nükleaz, olgun, gevrek RNA'lar üretmek için bir araç olarak da kullanılabilir. Bu RNA'lar, viral saldırıların müdahalesine katılımı hakkında bilgi edinmek için kaskad komplekslerine dahil edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, Cas ve nükleazlar için CRISPR es substratlarının nasıl tasarlanacağını ve üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu farklı substratlar, crispr E'lerin olgunlaşması ve kullanımı ile ilgili soruları ele almak için kullanışlıdır.