CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, bakterilerde ve Arkelerde bulunan crispr Cass bağışıklık sistemlerinde kritik roller oynayan Cas Endonükleazın çalışılması için RNA substratları üretmektir. Cas Endonükleaz için RNA substratları elde etmek amacıyla, tercih edilirse, in vitro RNA üretimi için uzun DNA kalıbı elde etmek üzere belirli bir CRISPR bölgesinin PCR amplifikasyonu uygulanabilir.

Substrat RNA üretimi için daha kısa şablonlar oluşturmak amacıyla iki oligonükleotid birbirine bağlanabilir. Alternatif olarak, kısa ve özel olarak sentezlenmiş tekrar dizileri CAS Endonükleaz analizlerinde test edilebilir. Nihayetinde, RNA transkriptlerinin üretimi ve ardından CAS altı endonükleaz tarafından gerçekleştirilen kesim, otoradyografi ile görselleştirilebilir.

Sunulan tekniklerin temel amacı, araştırmacıların farklı uzunluktaki RNA substratları ile CRISPR RNA işlemesini incelemelerini sağlamaktır. Bu nedenle, tek tekrarlı elementler gibi küçük RNA'lar veya birkaç ara diziyi kapsayan crispr RNA transkriptleri gibi daha büyük RNA'lar üretmek için farklı yöntemler kullanılır. Bu yöntemler özellikle CRISPR RNA olgunlaşması hakkında bilgi sağlasa da, benzer şablon hazırlama stratejileri diğer RNA işleme sistemleri için de benimsenebilir. Prosedürü, bakteri ve arkhea CRISPR bağışıklık sistemleri üzerine çalışan bir laboratuvardan olan bir lisansüstü öğrencisi ve bir doktora sonrası araştırmacı uygulamalı olarak gösterecektir.

Adaptasyon adı verilen bir süreçte, proto spacer olarak adlandırılan bir viral DNA dizisi, büyüyen bir CRISPR kümesindeki iki tekrar elementi arasına yerleştirilebilir. Ardından, tüm CRISPR kümesi transkribe edilir ve daha sonra CAS endonükleaz (örneğin, CAS altı) tarafından küçük CRISPR RNA'lara işlenir. Küçük CRISPR RNA'lar daha sonra CAS protein kompleksi kaskadına dahil olur ve CRISPR RNA ile proto spacer arasındaki baz tamamlayıcılığını, uzun pre CRISPR RNA substratları oluşturmak için viral DNA degradasyonuna yönelik bir sinyal olarak kullanarak, tekrarlanan viral ataklara karşı konak savunmasını aracılar.

T7 RNA polimeraz promoter dizisini ileri primerle ekleyerek bir CRISPR kümesinin ara bölge (spacer) bölgelerini hedefleyen PCR primerlerini tasarlayarak başlayın. Ardından, PCR ürününü bir vektöre klonlamak için her iki primere restriksiyon bölgeleri ekleyin. Genomik DNA'dan ilgilenilen pre-CRISPR RNA dizisinin PCR ile çoğaltılmasından sonra, T7 RNA polimerazın transkripsiyonu uygun şekilde başlatabilmesi için bir guanin kalıntısına ihtiyaç duyduğunu unutmayın.

PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezi ile ayırın ve istenen bandı jelden ekstrakte edin, ardından yapışkan uçlar oluşturmak için PCR ürününü restriksiyon enzimleri ile sindirin. Daha sonra, herhangi bir kesim yan ürününü ortadan kaldırmak için PCR ürününüzü bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırdıktan sonra; T4 DNA Ligaz, T4 DNA Ligaz tamponu ve karşılık gelen yapışkan uçlara sahip pUC vektörü ile kesilmiş PCR ürününe 3:1 molar oranında ekleme yapın. Şimdi ligasyon reaksiyonunu 16 °C'de gece boyunca inkübe edin ve ardından karışımı, başarılı ligasyonu belirlemek için mavi-beyaz tarama yöntemini kullanan standart protokoller aracılığıyla kompetan E. coli DH5α hücrelerine transforme edin.

Son olarak, bir plazmit hazırlama kiti kullanarak beyaz kolonilerden plazmitleri izole edin ve orta büyüklükte ön CRISPR RNA substratları oluşturmak için plazmit sekanslaması ile pozitif klonları belirleyin. İşleme, burada gösterilen dizilere benzer, istenen CRISPR tekrarlı ara boşluk dizisine sahip ileri ve geri oligonükleotidler tasarlayarak başlayın. Oligonükleotidlerin, yapışkan uçların oluşmasını sağlamak amacıyla, oligonükleotidlerin sonlanmasının ardından bir T7 RNA polimeraz promotör dizisinin yanı sıra uç kısıtlam kısıtlam bölgeleri içerdiğine dikkat edin.

Örnekleri, her bir oligonükleotidin 5' ucunu fosforillemek için T4 polinükleotid kinaz ve T4 polinükleotid kinaz tamponu ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, fosforillenmiş ileri ve geri oligonükleotidleri T4 DNA ligaz tamponu ile bir ısıtma bloğu üzerinde 95 °C'de beş dakika inkübe edin. Örnekler hibritlendikten sonra ısı kaynağını kapatın ve karışımın oda sıcaklığına ulaşana kadar yaklaşık iki ila üç saat soğumasını bekleyin.

Şimdi, çağrılan oligonükleotidleri, bir hibridizasyon karışımıyla sindirilmiş ve defosforile edilmiş P vektör T, dört DNA Ligaz tamponu ve T4 DNA Ligaz ile 16 °C'de gece boyunca ligasyon işlemine tabi tutun. Ardından, ligasyonun başarılı olduğunu belirlemek için mavi-beyaz tarama kullanarak, ligasyon yapılmış plazmidleri standart protokollerle kompetan E. coli DH5α hücrelerine transforme edin. Son olarak, plazmidleri izole edin ve sindirim ile ardından gelen plazmid dizileme yoluyla pozitif klonları tanımlayın.

Kısa tek tekrarlı cas RNA substrat dizileri, burada gösterilenlere benzer şekilde tasarlanabilir. Bir deoksiribonükleotid dahil edildiğinden emin olun. RNA kesim bölgesinin belirlenmesi gerekiyorsa, RNA oligonükleotidinin üretimi için özel bir sentez tesisi kullanılabilir.

Seçilen özel substrata sahip plazmidler izole edildikten sonra, bir maxi prep plazmid saflaştırma kiti kullanarak plazmidleri, klonlanan fragmanların aşağısından kesen restriksiyon enzimi ile lineerize edin. Ardından, sindirimin tamamen gerçekleştiğinden emin olduktan sonra, lineerize plazmidi fenol kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesi ile saflaştırın. Pelleti DEPC işleminden geçirilmiş steril suda süspanse ederek nükleik asitleri geri kazanın.

Şimdi sindirim plazmidlerini; ATP, CTP, GTP ve UTP içeren, taze hazırlanmış bir in vitro T7 RNA polimeraz runoff transkripsiyon karışımında 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Son olarak, elde edilen RNA transkriptlerini denatüre 8 M üre içeren %12'lik poliakrilamid jel üzerinde analiz edin. Transkriptleri Mono Q anyon değişim kromatografisi ile saflaştırmak ve ardından RNA fraksiyonlarının etanol çöktürmesi ve peletlerin DEPC ile işlem görmüş steril suda yeniden süspanse edilmesi yoluyla geri kazanmak da mümkündür; böylece tasarım substratları endonükleaz assayleri ile analiz edilebilir. İşleme, substrat bantlarının otoradyografi ile görüntülenmesi ve reaksiyon ürünlerinin denatüre 8 M üre içeren jel ekstraksiyonu ile saflaştırılmasıyla başlayın.

%12 poliakrilamid jel kullanın, ardından Clostridium thermo cell'den elde edilen bu CAS altı proteininde gösterildiği gibi, ısı çöktürmesi ve nikel NTA kromatografisi yoluyla istenen rekombinant cas proteinlerini üretin ve saflaştırın. Daha sonra, endonükleaz assay reaksiyonunun gerçekleşmesini sağlamak için CAS proteinini taze hazırlanmış bir endonükleaz reaksiyon karışımıyla 37 °C'de 30 dakika boyunca birleştirin. Son olarak, reaksiyon karışımının beş birimini sekiz molar üre üzerine yükleyin.

%12 poliakrilamid jel kullanın ve elektroforez sonrası kesim ürünlerini otoradyografi ile görüntüleyin. Burada, özel tasarlanmış bir RNA oligonükleotidi ile iki in vitro RNA transkriptinin Coomassie blue ile boyanmış poliakrilamid jeli gösterilmiştir. RNA üretim verimliliğinin kısa, uzun ve orta uzunluktaki konstrüktler arasında farklılık gösterdiğine dikkat edin.

RNA endonükleaz aktivitesinin incelenmesi, yüksek derecede saflaştırılmış rekombinant cas proteinlerinin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller gerektirir. Bu şekilde, Clostridium thermo cell'den alınan bir CAS altı örnek hazırlığının SDS page jeli görülmektedir.

Isı çöktürmesi ve nikel NTA kromatografisinin ardından, standart bir protein markörü ile birlikte yürütülen işlem gösterilmektedir. Uygun bir negatif kontrol örneği, CAS six ekspresyonu içermeyen bir hücre lizatı içermeli ancak aynı CAS six saflaştırma prosedürünü takip etmelidir; CAS six preparatının gerekli yüksek saflık düzeyine sahip olduğu belirlenmiştir. Burada, beş prim uç işaretli bir tekrarlayan dizi substratının co Clostridium thermo cell CAS six proteini tarafından kesilmesi otoradyografi ile görselleştirilebilir.

Her bir hat; artı işaretleriyle belirtildiği üzere ca altı protein ile inkübasyon sonrası radyoaktif olarak işaretlenmiş substrat, RNA veya eksi işaretleriyle belirtildiği üzere negatif kontrol olarak bir tampon çözelti ile inkübe edilmiş örnekleri; artı veya eksi doksi ribonükleotid eklemesiyle birlikte uzun substratları veya kısa substratları içermektedir. Eksi dokuz pozisyonundakiler, endonükleaz reaksiyonunu kolaylaştırmak için kullanılmıştır. Bu prosedürün ardından, doksi ribonükleotid RNA molekülüne dahil edildiğinde kısa substratlarda kesilme gerçekleşmediğine dikkat edin.

Cas nükleazları, olgun ve net RNA'lar üretmek için bir araç olarak da kullanılabilir. Bu RNA'lar, viral saldırıların engellenmesindeki rolleri hakkında bilgi edinmek amacıyla kaskad komplekslerine dahil edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, Cas nükleazlar için CRISPR substratlarının nasıl tasarlanacağı ve üretileceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu farklı substratlar, crispr Es'lerin olgunlaşması ve kullanımıyla ilgili soruların yanıtlanması için kullanışlıdır.