CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, bakterilerde ve Arkelerde bulunan crispr Cass bağışıklık sistemlerinde kritik roller oynayan Cas Endonükleaz çalışması için RNA substratları üretmektir. Tercih edilirse, in vitro RNA üretimi için uzun DNA kalıpları elde etmek amacıyla belirli bir CRISPR bölgesinin PCR amplifikasyonu uygulanabilir.

Substrat RNA üretimi için daha kısa şablonlar oluşturmak amacıyla iki oligonükleotid birbirine bağlanabilir. Alternatif olarak, özel olarak sentezlenmiş kısa tekrar dizileri CAS Endonükleaz analizlerinde test edilebilir. Sonuç olarak, RNA transkriptlerinin üretimi ve ardından CAS altı endonükleaz tarafından gerçekleştirilen kesim, otoradyografi ile görselleştirilebilir.

Sunulan tekniklerin temel amacı, araştırmacıların farklı uzunluktaki RNA substratları ile CRISPR RNA işlemesini incelemelerine olanak sağlamaktır. Bu nedenle, örneğin tek tekrarlı elementler gibi küçük RNA'lar veya birkaç ara dizgeyi (spacer) kapsayan CRISPR RNA transkriptleri gibi daha büyük RNA'lar üretmek için farklı yöntemler kullanılır. Bu yöntemler özellikle CRISPR RNA olgunlaşması hakkında bilgi sağlasa da, benzer şablon hazırlama stratejileri diğer RNA işleme sistemleri için de benimsenebilir. Prosedür; Bakteri ve Arkhe CRISPR bağışıklık sistemleri üzerine çalışan bir laboratuvardan bir lisansüstü öğrencisi ve bir doktora sonrası araştırmacı tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir.

Adaptasyon adı verilen bir süreçte, proto spacer olarak adlandırılan viral bir DNA dizisi, büyüyen bir CRISPR kümesindeki iki tekrar elementi arasına yerleştirilebilir. Ardından, tüm CRISPR kümesi transkribe edilir ve daha sonra Cas endonükleaz (örneğin, CAS altı) tarafından küçük CRISPR RNA'larına işlenir. Küçük CRISPR RNA'ları daha sonra CAS protein kompleksi kaskadına dahil olur ve CRISPR RNA ile proto spacer arasındaki baz tamamlayıcılığını, uzun pre CRISPR RNA substratları üretmek amacıyla viral DNA degradasyonu için bir sinyal olarak kullanarak, tekrarlanan viral saldırılara karşı konak savunmasını gerçekleştirir.

İleri primerine T7 RNA polimeraz promotör dizisini ekleyerek bir CRISPR kümesinin ara bölgelerini hedefleyen PCR primerlerini tasarlayarak başlayın. Ardından, PCR ürününün bir vektöre klonlanması için her iki primere restriksiyon bölgeleri ekleyin. PCR ile genomik DNA'dan ilgili pre-CRISPR RNA dizisi amplifiye edildikten sonra, T7 RNA polimerazın transkripsiyonu düzgün bir şekilde başlatabilmesi için bir guanin kalıntısına ihtiyaç duyduğunu unutmayın.

PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezi ile ayırın ve istenen bandı jelden ekstrakte edin, ardından yapışkan uçlar oluşturmak için PCR ürününü restriksiyon enzimleri ile sindirin. Daha sonra, herhangi bir kesim yan ürününü ortadan kaldırmak için PCR ürününüzü bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırdıktan sonra; T4 DNA Ligaz, T4 DNA Ligaz tamponu ve kesilmiş PCR ürünü ile karşılık gelen yapışkan uçlara sahip DFOs dört ilişkili pUC vektörünü üçe bir molar oranda ekleyin. Şimdi ligasyon reaksiyonunu 16 °C'de gece boyunca inkübe edin ve ardından karışımı, başarılı ligasyonu tanımlamak için mavi-beyaz tarama kullanarak standart protokollerle kompetan E. coli, DH5α hücrelerine transforme edin.

Son olarak, plazmid hazırlama kiti kullanarak beyaz kolonilerden plazmidleri izole edin ve orta büyüklükte pre-CRISPR RNA substratları üretmek için plazmid dizileme ile pozitif klonları belirleyin. Burada gösterilen dizilere benzer, istenen CRISPR tekrar boşlukları dizisine sahip ileri ve geri oligonükleotidler tasarlayarak başlayın. Oligonükleotidlerin, yapışkan uçların oluşmasını sağlamak için oligonükleotidlerin bitiminden sonra terminal restriksiyon bölgelerinin yanı sıra bir T7 RNA polimeraz promotör dizisi içerdiğini unutmayın.

Kısa bir bekletmenin ardından, her bir oligonükleotidin 1 μM miktarını 5' ucundan fosforillemek için numuneleri T4 polinükleotid kinaz ve T4 polinükleotid kinaz tamponu ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, fosforillemiş ileri ve geri oligonükleotidleri T4 DNA ligaz tamponu ile bir ısıtma bloğu üzerinde 95 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Numuneler hibritlendikten sonra ısı kaynağını kapatın ve karışımın oda sıcaklığına ulaşana kadar yaklaşık iki ila üç saat soğumasını bekleyin.

Şimdi, çağrılan oligonükleotidleri; bir hibridizasyon karışımı, sindirilmiş ve defosforile edilmiş P vektörü T dört DNA Ligaz tamponu ve bir TP ile 16 °C'de gece boyunca ligeyin. Ardından, ligasyonun başarılı olduğunu belirlemek için mavi-beyaz tarama yöntemini kullanan standart protokollerle, lige edilen plazmidleri kompetan E. coli DH5α hücrelerine transforme edin. Son olarak, plazmidleri izole edin ve sindirim ve ardından plazmid sekanslama yoluyla pozitif klonları tanımlayın.

Buradakilere benzer şekilde kısa, tek tekrarlı cas RNA substrat dizileri tasarlanabilir. Bir deoksiribonükleotid dahil edildiğinden emin olun. RNA kesilme bölgesinin belirlenmesi gerekiyorsa, RNA oligonükleotid üretimini gerçekleştirmek için özel bir sentez tesisi kullanılabilir.

Seçilen özelleştirilmiş substrata sahip plazmidler izole edildikten sonra, bir maxi prep plazmid saflaştırma kiti kullanarak plazmidleri, klonlanan fragmanların aşağısını kesen restriksiyon enzimi ile lineerize edin. Ardından, sindirimin tamamen gerçekleştiğinden emin olduktan sonra, lineerize plazmidi fenol kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürme ile saflaştırın. Nükleik asitleri, peleti DEPC işleminden geçirilmiş steril su içinde süspanse ederek geri kazanın.

Şimdi, sindirim plazmidlerini ATP, CTP, GTP ve UTP içeren, yeni hazırlanmış bir in vitro T7 RNA polimeraz runoff transkripsiyon karışımı içerisinde 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Son olarak, elde edilen RNA transkriptlerini denatüre edici 8 M üre içeren %12'lik poliakrilamid jel üzerinde analiz edin. Transkriptleri Mono Q anyon değişim kromatografisi ile saflaştırmak ve ardından RNA fraksiyonlarının etanol çöktürmesi ve peletlerin DEPC ile işlem görmüş steril su içerisinde yeniden süspande edilmesi yoluyla geri kazanmak da mümkündür; böylece tasarım substratları endonükleaz analizleri ile analiz edilebilir. İşleme, substrat bantlarını otoradyografi ile görüntüleyerek ve reaksiyon ürünlerini denatüre edici 8 M üre içeren jel ekstraksiyonu ile saflaştırarak başlayın.

%12 poliakrilamid jel hazırlayın, ardından Clostridium thermo cell'den elde edilen bu CAS altı proteininde gösterildiği üzere, ısı çöktürmesi ve nikel NTA kromatografisi yoluyla istenen rekombinant cas proteinlerini üretin ve saflaştırın. Daha sonra, endonükleaz assay reaksiyonunun gerçekleşmesini sağlamak için CAS proteinini, taze hazırlanmış bir endonükleaz reaksiyon karışımıyla 37 °C'de 30 dakika boyunca birleştirin. Son olarak, reaksiyon karışımından beş µL'yi sekiz molar üre içeren jele yükleyin.

%12'lik poliakrilamid jel hazırlayın ve elektroforez sonrası kesim ürünlerini otoradyografi ile görselleştirin. Burada, özel tasarım bir RNA oligonükleotidi ile iki in vitro RNA transkriptinin kromozom mavisi (methylene blue) ile boyanmış poliakrilamid jeli gösterilmektedir. Kısa, uzun ve orta uzunluktaki konstrüktler arasında RNA üretim verimliliğinin farklılık gösterdiğine dikkat edin.

RNA endonükleaz aktivitesinin incelenmesi, yüksek derecede saflaştırılmış rekombinant cas proteinlerinin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller gerektirir. Bu şekilde, Clostridium thermo cell'den elde edilen bir CAS altı örnek hazırlığının SDS page jeli görülmektedir.

Isıl çöktürme ve nikel NTA kromatografisinin ardından, standart bir protein markörü ile birlikte yürütülen işlem gösterilmiştir. Uygun bir negatif kontrol örneği, CAS six ekspresyonu olmayan bir hücre lizatı içermeli; ancak aynı CAS six saflaştırma prosedürü takip edildiğinde, hazırlanan CAS six'ın gerekli yüksek saflık düzeyine sahip olduğu belirlenmiştir. Burada, beş prime terminali işaretlenmiş bir tekrarlayan dizi substratının co Clostridium thermo cell CAS six proteini tarafından kesilmesi, otoradyografi ile görselleştirilebilir.

Her bir şerit; artı işaretleriyle belirtildiği üzere ca altı proteini ile inkübasyon sonrası radyoaktif olarak işaretlenmiş substrat, RNA veya eksi işaretleriyle belirtildiği üzere negatif kontrol olarak bir tampon çözelti; uzun substratlar veya denoksiribonükleotid ilavesi olan veya olmayan kısa substratlar içerir. Eksi dokuz konumunda, endonükleaz reaksiyonunu kolaylaştırmak için kullanılmıştır. Bu prosedürü takiben, denoksiribonükleotid RNA molekülüne dahil edildiğinde kısa substratlarda kesilmenin gerçekleşmediğine dikkat ediniz.

CAS altı nükleazlar, aynı zamanda olgun ve net RNA'lar üretmek için bir araç olarak da kullanılabilir. Bu RNA'lar, viral saldırıların engellenmesindeki etkilerini anlamak amacıyla kaskad komplekslerine dahil edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, Cas nükleazlar için CRISPR substratlarının nasıl tasarlanacağı ve üretileceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.

Bu farklı substratlar, crispr Es'lerin olgunlaşması ve kullanımıyla ilgili soruların yanıtlanması açısından kullanışlıdır.