Rat Beyin gelen Serebral Yüzey damarları ve İlişkili Beyin zarları ve Diseksiyon ve Koroid Pleksus bir Görsel Açıklama
14 Kasım 2012
Bu video sunumu önbeyin işlevini destekleyen en önemli iki derece vasküler yapıların hasat yöntemi gösterir. Onlar ilişkili meninksler (MAV) ve serebral kan akımı ve beyin omurilik sıvısı (BOS) homeostazı için gerekli olan koroid pleksus ile birlikte serebral yüzeyi (yüzeysel) damar vardır.
Bu prosedürün genel amacı; ön beyin korteksi, orta beyin, talamus ve kallum yüzeylerini örten meningeslerin (beyin zarları) peel ve araknoid kısımlarını ve ilişkili arteriyel vaskülatürü verimli ve hızlı bir şekilde diseke etmek ve ayrıca lateral ventriküllerden koroid pleksusu toplamak suretiyle gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle epifiz bezi çıkarılarak ve ön beyne bitişik meningesler ile arteriyel ağlar ayrılarak gerçekleştirilir. İkinci olarak, kortikal yüzeydeki arterler ve arteriyoller, Willis ventral halkasından başlanıp dorsal kortikal yüzeylere doğru ilerlenerek dikkatlice çıkarılır; böylece peel ve kalan araknoid membranların vaskülatüre tutunmuş kalması sağlanırken bitişik kortikal yüzey dokularının toplanması minimuma indirilir.
Ardından, lateral ventriküllerin açığa çıkarılarak koroid pleksusun toplanmasına olanak sağlamak için korteks ve komissural lifler, septum ve hipokampustan diseke edilerek ayrılır. Son olarak, talamus ve orta beynin kallus bölgelerini açığa çıkarmak için hipokampus çıkarılır. Daha sonra bu bölgenin üzerinde yer alan meningesler ve ilişkili damar yapısı diseke edilir.
Nihayetinde, diseke edilen meninglerin ve ilişkili arteriyel vaskülatürün yanı sıra koroid pleksusun bütünlüğü ve özgüllüğü, bu bölgelerin her birinin gen ekspresyon profilleri karşılaştırılarak belirlenebilir. Bu yöntem, beyin fonksiyonlarını destekleyen vaskülatür ile ilgili araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu süreç; kan akımı, BOS fonksiyonu, nörotoksik hasarlar ve beyin travması açısından koroid pleksusun fonksiyonunun meningler ve ilişkili arteriyel vaskülatür ile karşılaştırılmasını, benzerliklerin ve farklılıkların belirlenmesini içerir.
Bu protokole başlamak için, ötanazi uygulamasının hemen ardından sıçanlardan çıkarılan beyinleri beş dakika boyunca buz gibi soğuk, normal salin içerisine yerleştirin. Korteks yüzeyinden beyin meningeslerinin ve ilişkili arteriyel vaskülatürün (MAV) ayrılabilmesi için, diseksiyon öncesinde beynin bu süre boyunca soğumasını sağlamak önemlidir. Ardından beyni, buz üzerinde duran bir cam Petri kabının tabanına yerleştirerek üzerine 1 cm buz gibi soğuk normal salin veya pH 7.4'te 0.1 molar sodyum fosfat tamponlu salin ekleyin.
Tüm diseksiyon işlemleri, beyin büyük oranda salin içerisinde olacak şekilde gerçekleştirilmelidir. Diseksiyona başlamak için, beyni Petri kabına dorsal yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve iki hemisfer arasında en orta ventral bölgede bulunan pineal bezi konumlandırın. Bu bez, serebellumun hemen rostralinde ve meninglerin hemen altında veya yüzeyinde bulunur.
Colli üzerinden ilerleyin. Epifiz bezini iki adet küçük eğik uçlu pens kullanarak çıkarın. Epifiz bezinin korteks gibi pembe renkte olduğunu, ancak genellikle beyin çıkarma işlemi sonrası kalan kan ve damar kalıntılarıyla çevrili olduğunu unutmayın.
Ardından, Petri kabındaki beyni ters çevirin. Daha sonra, ponsu örten vertebral arteri, daha küçük arterleri ve meningesleri, ön beynin meningeslerinden ve vaskülatüründen ayırın. Sonrasında, MAV'nin çıkarılması işlemine başlayın.
Diseksiyon sürecine ventral kısımdan başlayarak Willis halkasının ana arterleri, orta serebral arterler ve anterior arterlerle başlamak önemlidir. Ardından, herhangi bir hemisferden başlayarak, posterior kommünikan arteri internal karotid birleşiminin hemen posteriorundan kesmek için küçük eğimli uçlu pensler kullanın; böylece ön beynin daha anterior ve posterior arter ağaçlarını birbirinden ayırmış olursunuz. Daha sonra aynı işlemi karşıt hemisfer için tekrarlayın.
Şimdi MCA'yı ve anterior arteri forsepsle kavrayarak, ventral anterior korteksi örten MAV'nin olfaktör traktusun üzerinden ve çevresinden kaldırılmasını sağlamak için nazikçe anterior dorsal yönde çekin. Bu işlem, anterior korteksi örten MAV'nin büyük bir kısmını uzaklaştırır. Lateral kortikal bölgeleri çevreleyen MAV'nin daha anterior lateral bölgelerinin korteksten serbest bırakılabilmesi için beyni Petri kabına 45 ila 90 derecelik bir açıyla döndürün, MCA'yı ve ilişkili arterleri kavrayıp korteks boyunca nazikçe dorsal yönde çekin.
Gerekirse, diseksiyon sırasında majör arterleri korteksten kaldırmak ve serbest bırakmak için pensetin uçları kullanılabilir. Şimdi, MAV'nin daha posterior lateral bölgelerini çıkarın. MAV'nin soğuk ve nemli kalmasını sağlamak için bu toplama işlemi sırasında bir hemisferden diğerine geçmenin en iyisi olduğunu unutmayın; ayrıca MAV'yi korteksten serbest bırakırken herhangi bir dirençle karşılaşırsanız hemisferleri değiştirin.
Son olarak, primer somatosensör ve motor korteksi çevreleyen MAV'nin en dorsal bölgelerini çıkarmak için, bu bölümü beyinden ayırmak üzere beynin dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde çevirin ve sagital sinüs boyunca pensetin uçlarını kullanın. Hasat edilen MAV'nin bu kısmı, test ve analiz için gerekli olana kadar geçici olarak buz soğukluğundaki salinde tutulabilir veya daha sonraki işlemler için dondurulabilir. Genellikle korteksin en posterior kodil bölgelerini örten MAV yapışık kalır.
Kaldırılma işlemi, bu videonun sonraki bir bölümünde gösterilmektedir. Koroid pleksusu çıkarmak için öncelikle beyni dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın ve büyük pens ile sabit tutun. Ardından, küçük pensi hemisferler arasındaki orta hat boyunca aşağı doğru itin ve uçlarını kullanarak korteks ile korpus kallozumdan geçip hippokampusun orta hattının üst kısmına kadar delin.
Ardından, lateral ventrikülün büyük bir kısmını açığa çıkarmak için pens yardımıyla callosum ile birlikte korteksi dorsal hipokampus ve septumdan uzaklaştırın. Koroide pleksus, boyunca uzanan ana arteri belirleyen dalgalı kırmızı çizgi aracılığıyla konumlandırılabilir ve tanımlanabilir. Üçüncü ventrikülün lateral duvarlarını aralamak ve en dar ucunu genişletmek için pensin iki ucunu kullanın.
Ardından küçük penset kullanarak, koroid pleksusun bu ucunu serbestçe çekin. Sonra, septum ile kaudat putamen bölgesi arasındaki en anterior bölgeyi genişletmek için penseti kullanın ve koroid pleksusu bu uçtan da serbestçe çekin. İkinci kalan koroid pleksusu elde etmek için aynı prosedürü kontralateral hemisferde de uygulayın.
Yine, bu doku geçici olarak buzda, soğukta, salinde tutulabilir veya daha sonra işlenmek üzere dondurulabilir. Korteksin en posterior koddle bölgelerini kaplayan geri kalan MAV'yi çıkarmak için, önce her iki hemisferden hipokampüsün tamamını çıkararak talamus ve kollikuli üzerindeki MAV'yi açığa çıkarın. MAV'nin bu kısmının çıkarılmasının, geri kalan MAV'nin korteksten çıkarılmasına göre çok daha kolay olacağını unutmayın.
Talamusun anterior kısmının üzerini örten daha büyük damar yapısı kavranıp nazikçe çekildiğinde, bu damar yapısının Supra kokürküler ağ ile bağlantılı olduğu ve dorsal hipokampus ile dorsal talamus ağına kan sağladığı görülür. Nazikçe çekmeye devam edildiğinde nihayet supra ağı serbest kalacak ve kodle arteriyel dairenin son kısımlarına ulaşılabilecektir. Bu aşamada, granular retros lineal primer, auditori ve görsel kortekslerin yüzeyinde kalan herhangi bir MAV'yi çıkarmak için daha fazla dikkat gösterilmelidir.
Bu ikinci talamik ve kallozal MAV kesitiyle birlikte toplanan geri kalan tüm posterior ventral kortikal MAV örnekleri, ayrı ayrı analiz edileceklerse çıkarılmalı ve diseke edilen ilk kortikal MAV kesitine eklenmelidir. Ardından, kontrol koşulları altında striatum, paryetal korteks ve MAV bölgeleri arasındaki gen ekspresyon profillerini karşılaştırmak için, Agilent 0 1 4 8 7 9 tüm sıçan genomu, 4x44.060 mer oligonükleotit dizileri kullanılarak gen ekspresyon analizi gerçekleştirilebilir. İşleme, tarama ve ilk veri depolama ile ilgili daha fazla ayrıntı Thomas ve ark. çalışmasında bulunabilir.
Diseksiyon doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, elde edilen MAV dokuları toplamda yaklaşık 35 ila 45 miligram ağırlığında iki sağlam parça halinde olmalıdır. Başlangıçta diseke edilen ve korteksin büyük bir kısmını çevreleyen MAV yaklaşık 25 miligram, talamus, kallozite ve oksipital korteksi kaplayan kısım ise yaklaşık 15 miligram ağırlığında olmalıdır.
Dokular, damarlardaki kalıntı kan nedeniyle hafif pembemsi bir renkte olmalıdır. Hasat edilen bilateral koroid pleksus, burada görüldüğü gibi, her biri bir ila iki miligram ağırlığında iki adet sağlam doku örneği şeklinde olmalıdır. Burada, kontrol koşulları altında striatum, paryetal korteks ve MAV'deki gen ekspresyon profillerinin bir karşılaştırmasını görmekteyiz.
Üstteki grafik, striatumdaki ekspresyonu parietal korteks ile karşılaştırmalı olarak göstermektedir. Alttaki grafik ise MAV'deki ekspresyonu parietal korteks ile karşılaştırmalı olarak gösterirken, striatum ve parietal korteksin birbirleriyle MAV'den çok daha yakından ilişkili olduğu görülmektedir. Burada, MAV'deki diferansiyel gen ekspresyonunu kontrol ile karşılaştırıldığında hipertermiye yanıt olarak, kontrol ile karşılaştırıldığında amfetamine yanıt olarak ve hipertermi ile amfetamin arasında görüyoruz.
Son olarak, burada MAV'de parietal korteks ve striatuma kıyasla 15 katından fazla ekspresyon gösteren genleri işlevlerine göre karakterize edilmiş şekilde görüyoruz. Bu genlerin çoğu vasküler sistem ve/veya bağışıklık sistemi ile ilişkilidir. Çok yüksek kat değişimleri gösteren diğer genler ise hücre dışı matris proteinleri, solute taşıyıcılar ile lipid ve retinoik asit metabolizmasıyla ilgilidir.
Bu prosedür uygulanırken, MAV diseksiyonu sırasında sabırlı olmanın önemli olduğu unutulmamalıdır. Ayrıca, tüm diseksiyon boyunca beynin izotonik salyanda veya fosfat tamponlu salyanda daldırılmış halde tutulması önemlidir. Bunun yanı sıra, deneysel veriler oluşturmak için dokular alınmadan önce, MAV kesit alma işleminin dört veya beş sıçan üzerinde pratik edilerek çalışılması önerilir.
Genel Bakış
Bu video sunumu, serebral kan akışının ve beyin omurilik sıvısı homeostazının sürdürülmesi için kritik öneme sahip olan serebral yüzey damarlarının ve koroid pleksusun hasat edilmesine yönelik bir yöntemi göstermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Vasküler Biyoloji
- Nöroanatomi
Arka Plan
- Serebral yüzey damarları ve koroid pleksus beyin fonksiyonları için hayati öneme sahiptir.
- Bu yapıların rollerinin anlaşılması, beyin omurilik sıvısı dinamikleri üzerine yapılan araştırmalara ışık tutabilir.
- Bu yapıların incelenmesi için diseksiyon teknikleri temel teşkil eder.
- Gen ekspresyon profilleri, bu vasküler bileşenler arasındaki fonksiyonel farkları ortaya çıkarabilir.
Çalışmanın Amacı
- Meningesleri ve ilgili damar yapısını etkili bir şekilde diseke etmek ve toplamak.
- Koroide pleksus ile beyin omurilik sıvısı fonksiyonu arasındaki ilişkiyi incelemek.
- Nörotoksik hasarlar ve beyin travmaları hakkında bilgi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Sıçan beyinlerinden meninglerin ve arteriyel vaskülatürün diseksiyonu.
- Koroide pleksusların lateral ventriküllerden dikkatlice çıkarılması.
- Komşu dokulara verilen hasarı minimize ederek hassas toplama işlemi için pens kullanımı.
- Toplanan dokuların bütünlüğünü değerlendirmek için gen ekspresyon profillerinin karşılaştırılması.
Temel Sonuçlar
- Meninglerin ve ilişkili vaskülatürün başarılı şekilde diseksiyonu.
- Koroid pleksus hasadı, minimum doku hasarı ile gerçekleştirilmiştir.
- Gen ekspresyon analizi, hasat edilen her bölge için belirgin profiller göstermiştir.
- Koroid pleksus ve meninglerin fonksiyonel rollerine dair içgörüler elde edilmiştir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, beyin vasküler yapılarını incelemek için güvenilir bir yaklaşım sağlar.
- Bu bileşenlerin anlaşılması, beyin omurilik sıvısı dinamikleri hakkındaki bilgileri artırabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, beyin fonksiyonlarını ve patolojilerini ele almak için bu bulgular üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu yöntem, biyofarma araştırmacılarının iki kritik nörovasküler yapıyı —meninksle ilişkili damarlanma (MAV) ve koroid pleksus— izole etmelerini ve analiz etmelerini sağlayarak MSS ilaç keşfinde hedef validasyonunu destekler. Gen ekspresyon profilleme için biyokimyasal olarak canlı doku sağlayarak, nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozukluklarda rol oynayan vasküler ve sıvı homeostaz yollarının mekanistik olarak riskten arındırılmasını kolaylaştırır. Bu yaklaşım, vasküler fonksiyonu amfetamin maruziyeti ve hipertermi gibi nörotoksik hasarlarla ilişkilendirerek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Nörovasküler kenetlenme ve kan-beyin bariyeri fonksiyonunda yer alan hedefleri doğrulamak için MAV'deki vasküler ve bağışıklıkla ilişkili gen ekspresyonunun sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Alt omik analizleri için uygun, bozulmamış MAV ve koroid pleksus dokuları sağlayan standartlaştırılmış bir diseksiyon iş akışı sunar.
- Öngörücü Değer: Nörotoksik zorlanmalara yanıt olarak diferansiyel gen ekspresyonunu ortaya çıkararak biyobelirteç keşfini destekler ve hedef önceliklendirmeye yardımcı olur.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Vasküler bütünlüğü korunmuş doku preparatları oluşturarak, serebrovasküler ve BOS düzenleyici hedefler için güvenilir assay geliştirilmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Diseksiyon 5–10 dakika sürer, bu da tarama kampanyaları için yüksek kapasiteli doku hazırlığına imkan sağlar.
- Tekrarlanabilirlik Değeri: MAV (~25–35 mg korteks ilişkili, ~15 mg talamik) ve koroid pleksus (taraf başına 1–2 mg) örneklerinin tutarlı şekilde toplanması, karşılaştırmalı analizler için standartlaştırılmış girdi sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Toplanan dokular, travmatik beyin hasarı ve nörotoksisite gibi klinik durumları taklit eden hasarlara karşı vasküler yanıtların incelenmesi için hastalıkla ilişkili modellerdir.
- Mekanistik Risk Azaltma: MAV, koroid pleksus ve kortikal bölgeler arasındaki gen ekspresyon karşılaştırmaları, vasküler spesifik sinyalleme ile MSS-parenkimal sinyallemeyi netleştirerek hedeflerin riskini azaltmaya yardımcı olur.
- Preklinik Süreklilik: Tutarlı doku izolasyonu kullanarak, keşif aşamasından preklinik aşamalara kadar vasküler hedef etkileşiminin boylamsal değerlendirmesine olanak tanır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, hipotez odaklı hedef doğrulamayı destekleyerek ve vasküler yolakların aydınlatılması yoluyla öncü bileşik tanımlamaya katkı sağlayarak, erken keşif sürekliliği kapsamına girmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Serebral kan akışı ve BOS homeostazındaki belirgin rollerini incelemek amacıyla meningeal vaskülatürün ve koroid pleksusun izole edilerek yolakların açıklığa kavuşturulmasını kolaylaştırır.
- Tarama: Vasküler ve nöroimmün analizlerde tekrarlanabilir bileşik testlerine olanak tanıyan standartlaştırılmış doku girişleri sağlar.
- Analitik: Vasküler yanıtların deneysel koşullar arasında karşılaştırılmasına izin veren kantitatif gen ekspresyon çıktıları (örneğin, Agilent tüm sıçan genom dizileri aracılığıyla) üretir.
- Translasyonel Araştırma: MAV ve koroid pleksus moleküler profillerini, hipertermi kaynaklı nörotoksisite gibi patofizyolojik durumlarla ilişkilendirerek biyobelirteç uyumunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Vasküler, meningeal veya koroid pleksus hedeflerini inceleyen birden fazla MSS projesinde uygulanabilecek, yeniden kullanılabilir bir doku izolasyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nörovasküler ve BOS ile ilgili yolaklardaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış diseksiyon tekniği ve izotonik salin içinde doku işleme yoluyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken vasküler yanıt verileri sağlayarak merkezi sinir sistemi programlarında geç evre başarısızlık riskini azaltır ve devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Vasküler hedef etkileşimi ve beyin homeostazı ile fonksiyonel ilişkisine dayalı olarak hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Hassas meningeal ve vasküler dokuları izole etmek için nöroanatomi ve mikrocerrahi diseksiyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Doku canlılığını korumak için ince pensler gibi diseksiyon enstrümanlarına ve kontrollü bir ortama (buz gibi soğuk salin) bağımlıdır.
- Tutarlı doku hazırlama ve analiz için histoloji, moleküler biyoloji ve farmakoloji ekipleri arasında ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Adaptasyon hususları arasında, kortikal kontaminasyonu önlemek için farklı sıçan suşları veya yaşlarına göre diseksiyon derinliğinin ayarlanması yer alır.
- Pratik sınırlama: Diseksiyonun çok hızlı veya uygun doku hidrasyonu olmadan yapılması durumunda meningeal yırtılma veya vasküler hasar riski mevcuttur.
