Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Bu prosedürün genel amacı, beta galaktosidazın aktive edilmiş ekspresyonu aracılığıyla snare aracılı hücre füzyon olaylarını nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle v ve t snare proteinlerinin cost seven hücrelerinin yüzeyinde ektopik olarak eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, V snare proteinlerini eksprese eden hücrelerin, T snare proteinlerini eksprese eden hücrelerle birleştirilmesidir.

Bu durum, snare aracılı hücre füzyonuna ve beta galaktozün aktif ekspresyonuna yol açar. Nihayetinde, hücre füzyonu tarafından indüklenen beta galaktoz aktivitesi bir spektrofotometre kullanılarak ölçülür. Bu tekniğin veya mikroskobik SAL bölge analizi gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı, birden fazla snare kombinasyonunu analiz edebilmesidir.

Niceliksel olarak, bu yöntem snare aracılı membran füzyonunun mekanizmasını ve regülasyonunu anlamak için uygulanabileceği gibi, yüksek kapasiteli çalışmalar yürütmek için de kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Doc Na Hassan ve teknisyen David Humphrey, transfeksiyon yüklemesinden bir gün önce gösterecekler.

12 milimetrelik cam lameller içeren 24 kuyucuklu plakaları hazırlayın; deneydeki her bir benzersiz plazmit eksprese eden hücre kombinasyonu için bu lameller üzerinde ikişer kuyucuk ayırın. Transfeksiyon için 4,5 g/L glikoz ve %10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de kültüre edilmiş 30.000 COST7 hücresini ekleyin. V hücrelerine, her bir kuyucuk başına 0,25 µg TTA plazmidi ve bir set ekspresyon plazmidi ekleyin.

Bu durumdaki ilgi odağı olan ters çevrilmiş proteinleri, yani ters çevrilmiş vamp'leri transfekte etmek için T hücrelerine TRE lacks Z kodlayan plazmidin çeyrek mikrogramını ve ilgi odağı olan ters çevrilmiş proteinleri kodlayan tamamlayıcı plazmid setini ekleyin. Bu durumda bunlar snap 25, syntaxin one ve syntaxin four'dur. Şimdi cost seven'i üretici talimatlarına uygun olarak lipectomy ile transfekte edin ve hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin; transfeksiyondan 24 saat sonra hücreleri takviye edilmiş paraformaldehitte 10 dakika boyunca sabitleyin. Sabitleme işleminden sonra hücreleri üç kez PBS++ ile durulayın, ardından hücreleri takviye edilmiş FBS ile 30 dakika boyunca bloke edin.

Bloklama işleminin ardından, hücreleri anti mic monoklonal antikoru Nine E 10 ile 30 dakika boyunca inkübe edin. PBS++ ile dört kez yıkama yaptıktan sonra, hücreleri 1:500 dilüsyonundaki fitzi konjuge ikincil antikorlarla bir saat boyunca inkübe edin. PBS++ ile dört yıkama daha yaptıktan sonra, işaretlenmiş hücreleri ticari olarak temin edilebilen anti-fade reajenine monte edin.

Hücreler artık konfokal mikroskopi için hazırdır; transfeksiyondan bir gün önce, analiz edilecek her plazmid kombinasyonu için her bir 100 milimetrelik doku kültürü kabına 1,2 milyon Cos-7 hücresi ve altı kuyucuklu plakaların her kuyucuğuna 200.000 Cos-7 hücresi ekleyin. Bir kuyucuk hazırlayın ve hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin. Ertesi gün transfeksiyon için plazmidleri ekleyin; V hücreleri için, her bir 100 milimetrelik kültüre ilgi duyulan FLIP proteinini eksprese eden bir plazmid ve 5 µg pTet-Off ekleyin.

100 milimetrelik bir kültür kabındaki kontrol hücrelerini, V hücreleri ile aynı bağıl konsantrasyonlarda boş bir vektör ve P te off ile ko-transfekte edin. Tüm plazmidler V hücrelerine ve kontrol hücrelerine eklendikten sonra, vamp'lerin N-glikozilasyonunu önlemek için söz konusu kuyucuklara tcom mycin ekleyin. Altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğunda, T hücrelerini ilgi duyulan proteinleri eksprese eden tamamlayıcı plazmidler içeren bir mikrogram PBIG ile ko-transfekte edin.

Şimdi, üretici talimatlarına uygun olarak cost seven hücrelerini lip ile transfekte edin. Ardından hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin; transfeksiyondan 24 saat sonra V hücrelerini, enzim içermeyen hücre ayrıştırma tamponu ile kültür kaplarından ayırın. İşleme hücreleri bir kez 20 milliliters PBS ile yıkayarak başlayın.

Ardından beş mililitre enzim içermeyen disosiasyon tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyonun ardından, plakaya sertçe vurarak hücrelerin yerinden çıkmasını sağlayın ve mikroskop altında ayrılıp ayrılmadıklarını kontrol edin. Hücrelerin yarısından azı ayrılmışsa, beş dakika daha bekleyin ve plakaya tekrar vurun.

Hücrelerin yarısından fazlası ayrılana kadar detakman tamponu içindeki inkübasyona devam edin. Ardından, V hücrelerini bir hemositometre ile sayın. Sonrasında V hücrelerini, supplement eklenmiş DMEM heis tamponu içinde mililitre başına yaklaşık 480, 000 hücre konsantrasyonunda resüspande edin.

Şimdi, T hücrelerini içeren her bir kuyuya bir mililitre resüspande edilmiş V hücresi ekleyin ve plakları inkübatöre geri yerleştirin. Hücrelerin altı, 12 veya 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesinin ardından, hücreleri PBS ile yıkayın ve lizis tamponu ekleyin. Ardından, hücreleri kuyulardan sıyırarak santrifüj için tüplere aktarın.

Santrifüj işleminden sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve beta galakto ekspresyonunu, üretici talimatlarına uygun olarak ticari olarak mevcut bir assay kullanarak ölçün; bu protokol sırasında, sonuçları belirlemek için bir molar sodyum karbonat ekleyerek kolera metrik reaksiyonu 90 dakika sonra durdurduğunuzdan emin olun. Absorbansı bir spektrofotometrede 420 nanometre dalga boyunda ölçün. CO seven hücreleri flipped snare plazmidleri ile transfekte edildiğinde, flipped snare proteinleri hücre yüzeyinde eksprese edildi.

Hücre yüzeyindeki snare proteinlerinin ekspresyon düzeylerini ölçmek için akış sitometrisi kullanılmıştır. Membran füzyon kapasitelerini karşılaştırabilmek için vamp'lerin aynı düzeyde eksprese edilmesi gerekiyordu. Bu nedenle, transfeksiyonda kullanılan her bir flipped snare plazmidinin konsantrasyonu titre edilmiş ve transfeksiyon için optimize edilmiştir.

Bu koşullar altında, hücre yüzeyinde sırasıyla vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve 8 ile syntaxin 1 ve 4 aynı düzeyde eksprese edildiğinde, sinaptik ekzositozu sağlayan nöronal SNARE'ler analiz yönteminin uygulanabilirliğini test etmek için kullanıldı. Nitekim, vamp 2 eksprese eden V hücreleri ile SYNTAXIN 1 ve SNAP-25 eksprese eden T hücreleri birleştirildiğinde, güçlü bir beta-galaktosidaz ekspresyonu tespit edildi. Ancak, vamp 2 veya SNAP-25'ten herhangi biri eksprese edilmediğinde, yalnızca bazal beta-galaktosidaz aktivitesi tespit edildi; bu durum, hücre füzyonunun ve beta-galaktosidaz ekspresyonunun v-SNARE ve t-SNARE etkileşimlerine dayandığını göstermektedir. Genel olarak SYNTAXIN 1, SNAP-25, vamp 1, vamp 3 ve vamp 8 benzer ve en yüksek füzyon aktivitelerine sahipti.

Buna karşılık, bazal beta GAL aktivitesi, protein kombinasyonunun vamp five ve SYNTAXIN one arasındaki durumun aksine membran füzyonunu tetiklemediğini göstermektedir. Snap 25. Enzimatik füzyon testi gerçekleştirilirken, SNARE proteinlerinin N-glikozilasyonunu önlemek için tunicamycin eklemeyi ve SNARE proteinleri arasında disülfit bağı oluşumunu engellemek için DTT eklemeyi hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, hücre füzyon analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.