Name: Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Öğrenin, SNARE-aracılı membran füzyonunu enzimatik hücre füzyon deneyiyle niceliksel olarak analiz etmeyi. β-galaktosidaz aktivitesi ölçülerek çoklu SNARE kombinasyonları incelenir ve hücre biyolojisi araştırmalarında güvenilir bir yöntem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Louisville ve CA135123 Üniversitesi (CH) için başlangıç ​​fonları tarafından desteklenmektedir.

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon <ol><li> COS-7 hücreleri, 4.5 g / l glikoz ve% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde kültürlenmiştir. </li><li> Plazmid transfeksiyon üreticinin talimatlarına (Invitrogen) göre lipofektamin ile yapılır. </li></ol> 2. Hücre Yüzey SNARE İfade Floresan Mikroskobik Analizi <ol><li> Transfeksiyon önceki gün, 3 × 10 4 COS-7 hücreleri 24-kuyucuğu bulunan steril 12-mm cam lamelleri (Fisher Scientific) üzerine numaralı seribaşı. </li><li> TTA kodlayan plazmid her iyi, 0.25 mcg v-hücreleri için (pTet-Off, Clontech) ekspres vamps çevrilen plazmid 0.25 mikrogram ile transfekte edilir. </li><li> Her bir kuyudaki T hücreleri için, plazmid kodlama TRE-lacZ (PBI-G, Clontech) 0.25 ug 0.25 ug ekspres SNAP-25 ve syntaxins 1 veya 4 çevrilen plazmid her biri ile transfekte edilir. </li><li> T sonra 24 saatransfection hücreler yine PBS içinde% 4 paraformaldehid + + 10 dakika boyunca (PBS 0.1 g / l CaCl2, 0.1 g / l MgCI2 ile desteklenmiş), ve sonra PBS içinde% 10 FBS içinde bloke + + 30 dakika süreyle sabitlenir. </li><li> Hücreler, anti-myc monoklonal antikor 9E10 (neat hibridoma kültür yüzey maddesi) ile 1.5 saat için inkübe edilir. </li><li> Ile dört yıkamadan sonra PBS + + hücreleri 1:500 dilüsyon FITC-konjuge sekonder antikor (Jackson Immunoresearch Laboratories) ile 1 saat boyunca kuluçkaya bırakıldı. </li><li> Ile dört yıkamadan sonra PBS + + etiketli hücreler antifade Gold reaktifi (Invitrogen) uzatmak da monte edilmiştir. </li><li> Konfokal görüntüler Olympus lazer tarama konfokal mikroskop üzerinde toplanır. Görüntüler Adobe Photoshop yazılımı ile işlenir. </li></ol> 3. Hücre Yüzey SNARE İfade FACS Analizi <ol><li> Transfeksiyondan bir gün önce, 2 x 10 5 COS-7 hücreleri 6-plakaların her kuyuya tohumlanmıştır. </li><li> Tra sonra 24 saatile nsfection SNARE, pTet-Off ve PBI-G plazmidler döndürülmüş, hücreler PBS içinde% 1 paraformaldehid + + ile 15 dakika daha sabit, ve sonra PBS içinde% 10 FBS içinde + + 15 dakika için bloke edilmiştir. </li><li> Hücreler, 60 dakika boyunca, anti-myc monoklonal 9E10 antikoru ile inkübe edilir. </li><li> Üç yıkamadan sonra PBS + +, hücreler 45 dakika süreyle FITC-konjuge sekonder antikor (1:200 dilüsyon) ile etiketlenir. </li><li> PBS ile üç yıkar + +, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile plakalar kazınmış sonra. </li><li> 15.000 hücreler FACSCalibur akış sitometresinin (BD Biosciences) kullanılarak analiz edilmektedir. Her bir numune grubunun ortalama floresan yoğunluğu CellQuest Pro yazılımı kullanılarak elde edilir. </li></ol> 4. Enzimatik Hücre Füzyon Deneyi <ol><li> Transfeksiyondan bir gün önce, 1.2 x 10 6 COS-7 hücrelerinin her biri 100 mm doku kültürü çanağı içinde ekildi ve 2 x 10 5 COS-7 hücreleri 6-plakaların her kuyuya tohumlanmıştır. </li><li> 5, ug Flipp her biri - v-hücreleri, 0.5plazmid ed VAMP her 100-mm kültür çanak hücrelerine pTet-Off 5 mikrogram ile transfekte edilir. Kontrol hücreleri boş vektör pcDNA3.1 (+) ve pTet-Off ile transfekte edilmiştir. Vamps 1, 4, 5, 7 ve 8, tunicamycin N-glikolizasyon önlemek için, (10 ug / ml) transfeksiyon esnasında hücre kültürü aracı maddesi içinde yer almaktadır. </li><li> 6-kuyucuğu her iyi t-hücreleri için, 1 mg SNAP-25 plazmid saygısız ve PBI-G 0.5 mikrogram ile transfekte edilir plazmid syntaxin4 saygısız plazmid syntaxin1 veya 0.05 mikrogram çevirdi. </li><li> Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücreler v-enzim içermeyen hücre Ayrılma Tamponu (Invitrogen) ile kültür kaplarından ayrılır. Kaldırılan hücreler bir hemasitometre ile sayılır ve resüspande edilirler, HEPES-tamponlu DMEM% 10 FBS, 6.7 ug / ml ve 0.67 tunicamycin mM DTT ile desteklenmiştir. </li><li> 4.8 x tekrar süspanse 10 5 v-hücrelerinin her biri de zaten t-hücreleri içeren eklenir. </li><li> 6, 12 veya 24 saat sonra, sıçan 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde </sub&gt;, β-galaktosidaz ifade üreticinin talimatlarına (Promega) &#39;ye göre Reporter Lysis Buffer ile β-galaktosidaz Enzim Assay System kullanılarak ölçülür. Kısaca, hücreler PBS ile iki kez yıkanır ve daha sonra Reporter lizis tamponu içinde lize. Hücre lizatları 2 x Tahlil Tamponu içinde eşit hacmi ile karıştırılır. Boş bir kontrol olarak Muhabir Lizis Tampon Testi 2 × Tampon ile karıştırılır. </li><li> 90 dakika sonra, reaksiyon kolorimetrik 1 M sodyum karbonat eklenmesi ile durdurulur. </li><li> 420 nm Absorbans bir HITACHI 100-40 spektrofotometresi kullanılarak ölçülür. </li></ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Orijinal hücre füzyon deneyi 6 floresans mikroskobu ile SNARE-aracılı hücre füzyon olayları belirler. Burada β-galaktosidaz ve spektrometrik ölçüm aktive ifadesi ile SNARE-aracılı hücre füzyonu olayların rakamlarla yenilikçi bir tahlil açıklamaktadır. Bu testte kullanarak, rutin analiz 15 - 20 v ve t-SNARE tek bir deneyde kombinasyonları. Hücre yüzeyinde ifade SNARE ölçmek için akış sitometrisi kullanılarak, vamps ifade seviyeleri titre ve membran füzyon kapasiteleri (Şekiller 2 ve 4) karşılaştırın. Dahası, e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ve ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7 hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> PBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofektamin </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzim-ücretsiz cep disosiasyon çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Tavşan anti-TET Baskılayıcı poliklonal antikor </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-konjuge eşek anti-fare IgG (H + L) </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Lazer tarama konfokal mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur flowsitometri </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Muhabir Lizis Buffer ile β-Galaktosidaz Enzim Assay Sistemi </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Model 100-40 UV-VIS spektrofotometre </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak snare-aracılı membran füzyon analizi

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

SNARE (ler oluble N-etilmaleimid duyarlı faktör ttachment proteini yeniden reseptör) veziküller (v-SNARE) ve hedef membranlarda protein etkileşimleri (t-SNARE) intrasellüler vezikül füzyon 1-4 katalize. Sulandırma deneyleri SNARE-aracılı membran füzyon 5 mekanizması ve düzenleme kesme için gereklidir. Bir hücre füzyon deneyi 6,7 olarak, SNARE proteinler hücre yüzeyinde ektopik olarak ifade edilmiştir. Bu SNARE hücre zarının kaynaştırmak için yeterli olduğunu gösteren, SNARE proteinler tahrik hücre-hücre füzyonu &quot;döndürülmüş&quot;. Hücre füzyon deneyi mikroskopik analiz dayandığından çok v-ve t-SNARE etkileşimleri kantitatif analiz için kullanılan zaman, daha az verimlidir. Burada β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı hücre füzyonu olayların rakamlarla, yeni bir tahlil 8 tarif. Ikitetrasiklin kontrollü Transaktivatörü (TTA) ve tetrasiklin yanıt elementinin kontrolü (TRE-lacZ) altında lacZ genini kodlayan bir haberci plazmid: Tet-Off gen ifade sistemi 9 bileşenlerinin bir ölçme sistemi olarak kullanılmaktadır. Ekspres hücre yüzeyinde t-SNARE çevrilen protein COS-7 hücrelerinin (T-hücreleri) içine hücre yüzeyinde v-SNARE proteinleri (v-hücreleri) ile transfekte TRE-lacZ çevrilen COS-7 hücreleri içine transfekte Bu TTA . TRE, lacZ transkripsiyonel aktivasyonu ve β-galaktosidaz ekspresyonu için TTA&#39;nın bağlayıcı olarak V-ve T-hücrelerinin sonuç SNARE-bağımlı füzyon. Β-galaktosidaz aktivitesi 420 nm&#39;de absorbans ile bir kolorimetrik yöntemle ölçülür. Vezikül ilişkili membran proteinleri (vampirler) Çeşitli post-Golgi veziküler bölümlerinde 10-15 ikamet v-SNARE vardır. Aynı seviyede vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve 8 ile ifade, onların membran füzyonu karşılaştırmakenzimatik hücre füzyon deneyi kullanılarak faaliyetleri. Spektrometrik ölçüm dayanarak, bu testte SNARE-aracılı membran füzyon analiz ve yüksek verimlilik çalışmaları için nicel bir yaklaşım sunuyor.

Niceliksel bir hücre füzyon deneyi geliştirmek için, biz TRE TTA bağlama ile güçlü transkripsiyonel aktivasyon yararlanmak. TTA yokluğunda, TRE-lacZ yılında lacZ geninin transkripsiyonu sessizdir. TTA mevcut olduğu zaman, TRE bağlanır ve lacZ geni transkripsiyonunu aktive eder. Şekil 1, bu enzimatik hücre füzyon tahlil oluşan bir akış şeması gösterilmektedir. TTA hücre yüzeyinde ifade v-SNARE proteinler, ve TRE-lacZ T-hücreleri içine transfekte edilir ki v-hücrelerine...

Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Veziküller üzerindeki (v-SNARE'ler) ve hedef membranlar üzerindeki SNARE (çözünür N-etilmaleimid-hassas faktör tutunma proteini reseptörü) proteinlerinin etkileşimleri...

Bu prosedürün genel amacı, beta galaktosidazın aktive edilmiş ekspresyonu yoluyla snare aracılı hücre füzyon olaylarını nicelendirmektir. Bu işlem, öncelikle v ve t snare proteinlerinin cost seven hücrelerinin yüzeyinde ektopik olarak eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, V snare proteinlerini eksprese eden hücrelerin, T snare proteinlerini eksprese eden hücrelerle birleştirilmesidir.Bu durum snare aracılı hücre füzyonuna ve beta galaktozidasın aktive edilmiş ekspresyonuna yol açar. Nihayetinde, hücre füzyonu ile indüklenen beta galaktozidaz aktivitesi bir spektrofotometre kullanılarak ölçülür. Bu tekniğin veya mikroskobik SAL bölgesi analizi gibi mevcut yöntemlerin temel avantajı, birden fazla snare kombinasyonunu analiz edebilmesidir.Nicel olarak, bu yöntem snare aracılı membran füzyonunun mekanizmasını ve düzenlemesini anlamak için uygulanabileceği gibi, yüksek kapasiteli çalışmalar yürütmek için de kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Doc Na Hassan ve teknisyen David Humphrey uygulamalı olarak gösterecekler. Transfeksiyon yüklemesinden bir gün önce.12 milimetrelik cam lameller içeren 24 kuyucuklu plakalar kullanın; bu lameller üzerine, deneydeki farklı plazmidleri eksprese eden hücre kombinasyonlarının her biri için ikişer kuyucuk hazırlayın. Transfeksiyon için, 4,5 g/L glukoz ve %10 FBS ile desteklenmiş DMEM'de kültüre edilmiş 30.000 COST7 hücresini ekleyin. V hücrelerinin bulunduğu her bir kuyucuğa 0,25 µg TTA plazmidi ve bir set ekspresyon plazmidi ekleyin.Bu durumdaki ilgi duyulan ters çevrilmiş proteinleri, yani ters çevrilmiş vamp'leri transfekte etmek için T hücrelerine, TRE lacks Z'yi kodlayan plazmitin çeyrek mikrogramını ve ilgi duyulan ters çevrilmiş proteinleri kodlayan tamamlayıcı plazmit setini ekleyin. Bu durumda bunlar snap 25, syntaxin one ve syntaxin four'dur. Şimdi cost seven hücrelerini üretici talimatlarına göre lipectomy ile transfekte edin ve hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin; transfeksiyondan 24 saat sonra hücreleri supplementli paraformaldehitte 10 dakika boyunca sabitleyin. Sabitleme işleminden sonra hücreleri üç kez PBS++ ile durulayın, ardından hücreleri supplementli FBS ile 30 dakika boyunca bloke edin.Bloklama işleminden sonra, hücreleri anti mic monoklonal antikoru Nine E 10 ile 30 dakika boyunca inkübe edin. PBS++ ile dört yıkama yaptıktan sonra, hücreleri 1:500 dilüsyonundaki fitzy konjuge ikincil antikorlarla bir saat boyunca inkübe edin. PBS++ ile dört yıkama daha yaptıktan sonra, işaretlenmiş hücreleri ticari olarak temin edilebilen anti-fade reaktifi ile kapatın.Hücreler artık konfokal mikroskopi için hazırdır; transfeksiyondan bir gün önce, analiz edilecek her plazmid kombinasyonu için her bir 100 milimetrelik doku kültürü kabına 1,2 milyon Cos-7 hücresi ve altı kuyucuklu plakaların her kuyucuğuna 200.000 Cos-7 hücresi ekleyin. Bir kuyucuk hazırlayın ve hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin. Ertesi gün, transfeksiyon için plazmidleri ekleyin; V hücreleri için, her bir 100 milimetrelik kültüre ilgili GFP proteinini eksprese eden bir plazmid ve 5 µg pTet-Off ekleyin.100 milimetrelik bir kültür kabındaki kontrol hücrelerini, V hücreleri ile aynı bağıl konsantrasyonlarda boş bir vektör ve P te off ile kotransfekte edin. Tüm plazmidler V hücrelerine ve kontrol hücrelerine eklendikten sonra, vamp'lerin N-glikozilasyonunu önlemek için bu kuyucuklara tcom mycin ekleyin. Altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğunda, T hücrelerini ilgili proteinleri eksprese eden tamamlayıcı plazmidler içeren bir mikrogram PBIG ile kotransfekte edin.Şimdi cost seven hücrelerini üretici talimatlarına uygun olarak lip ile transfekte edin. Ardından hücreleri 24 saat boyunca kültüre edin; transfeksiyondan 24 saat sonra V hücrelerini enzim içermeyen hücre ayrıştırma tamponu ile kültür kaplarından ayırın. İşleme hücreleri bir kez 20 milliliters PBS ile yıkayarak başlayın.Ardından beş mililitre enzim içermeyen disosiasyon tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyonun ardından, plakaya sertçe vurularak hücrelerin yerinden ayrılması sağlanır; hücrelerin ayrılıp ayrılmadığı mikroskop altında kontrol edilir. Hücrelerin yarısından azı ayrılmışsa, beş dakika daha bekleyin ve plakaya tekrar vurun.Hücrelerin yarısından fazlası ayrılana kadar hücreleri ayırma tamponunda inkübe etmeye devam edin. Ardından, V hücrelerini bir hemositometre ile sayın. Sonrasında, V hücrelerini takviye edilmiş DMEM Hanks dengeli tuz çözeltisi tamponunda mililitre başına yaklaşık 480,000 hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin.Şimdi, T hücrelerini içeren her bir kuyucuğa bir mililitre resüspande edilmiş V hücresi ekleyin ve plakaları inkübatöre geri yerleştirin. Hücreleri altı, 12 veya 24 saat boyunca birlikte kültürledikten sonra, onları PBS ile yıkayın ve lizis tamponu ekleyin. Ardından, hücreleri kuyucuklardan sıyırarak santrifüj için tüplere aktarın.Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve ticari olarak mevcut bir assay kullanarak, üreticinin talimatlarına uygun şekilde beta galakto ekspresyonunu ölçün; bu protokol sırasında, sonuçları puanlamak için bir molar sodyum karbonat ekleyerek kolera metrik reaksiyonu 90 dakika sonra durdurduğunuzdan emin olun. Absorbansı bir spektrofotometre ile 420 nanometrede ölçün. CO seven hücreleri flipped snare plazmidleri ile transfekte edildiğinde, flipped snare proteinleri hücre yüzeyinde eksprese edildi.Hücre yüzeyindeki snare proteinlerinin ekspresyon seviyelerini ölçmek için akış sitometrisi kullanılmıştır. Membran füzyon kapasitelerini karşılaştırabilmek için vamp'lerin aynı seviyede eksprese edilmesi gerekiyordu. Bu nedenle, transfeksiyonda kullanılan her bir ters çevrilmiş snare plazmidinin konsantrasyonu titre edilmiş ve transfeksiyon için optimize edilmiştir.Bu koşullar altında, vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve sekiz ile syntaxin bir ve dört hücre yüzeyinde sırasıyla aynı düzeyde eksprese edilmiş olup, sinaptik eksositozu yöneten nöronal snare proteinleri assay'in uygulanabilirliğini test etmek için kullanılmıştır. Nitekim, vamp iki eksprese eden V hücreleri ile SYNTAXIN bir snap 25 eksprese eden T hücreleri birleştirildiğinde, güçlü beta galaktosidaz ekspresyonu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, vamp iki veya SNAP 25'ten herhangi biri eksprese edilmediğinde, yalnızca bazal beta galaktosidaz aktivitesi tespit edilmiş olup, bu durum hücre füzyonunun ve beta galaktosidaz ekspresyonunun v ve t snare proteinlerinin etkileşimlerine dayandığını göstermiştir; genel olarak SYNTAXIN bir, snap 25, vamp bir, vamp üç ve vamp sekiz karşılaştırılabilir düzeyde ve en yüksek füzyon aktivitelerine sahipti.Buna karşılık, bazal beta GAL aktivitesi, protein kombinasyonunun vamp five ve SYNTAXIN one arasındaki durumun aksine membran füzyonunu tetiklemediğini göstermektedir. Snap 25. Enzimatik füzyon testi gerçekleştirilirken, SNARE proteinlerinin N-glikozilasyonunu önlemek için tunicamycin eklemeyi ve SNARE proteinleri arasında disülfit bağ oluşumunu önlemek için DTT eklemeyi hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, hücre füzyon analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

analysis-snare-mediated-membrane-fusion-using-an-enzymatic-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Bu video hücrelerin verimli elektrofüzyon...

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Işık mikroskobu teknikleri, biyokimyasal tahlillerle birleştiğinde, netrin bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun katılımını aydınlatmaktadır. Bu tekniklerin kombinasyonu, akson dallanmasını ve hücre şekli değişikliğini kontrol eden moleküler mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Burada, N-terminal hexahistidine/maltoz-bağlayıcı protein ve nikel-nitrilotriacetic yüzeye bağlı floresan protein erimiş rekombinant yüzeylerde kullanan bir son zamanlarda geliştirilen proteaz tahlil platform ayrıntılı yordam mevcut asit manyetik özel boncuk. Bir sonraki jel analiz Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez tarafından ayrılmış tahlil örnekleri de sunulmaktadır.

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi

Öğrenin, SNARE-aracılı membran füzyonunu enzimatik hücre füzyon deneyiyle niceliksel olarak analiz etmeyi. β-galaktosidaz aktivitesi ölçülerek çoklu SNARE kombinasyonları incelenir ve hücre biyolojisi araştırmalarında güvenilir bir yöntem sunar.

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Daha fazla video keşfet